利用硼酸盐络合辅助的毛细管电泳技术，结合电容耦合非接触式电导检测方法，对乙二醇和丙二醇进行测定

《Journal of Chromatography Open》：Borate complexation-assisted capillary electrophoretic determination of ethylene glycol and propylene glycol using capacitively coupled contactless conductivity detection

　　加布里埃拉·A.M.C.·里贝罗 | 莱拉·M.·德法里亚 | 若泽·A.·弗拉卡西·达席尔瓦 | 多西尔·P.·德热苏斯
坎皮纳斯州立大学化学研究所，UNICAMP，邮政信箱6154，13083-970，坎皮纳斯，圣保罗州，巴西

**摘要**
本文提出了一种新型、快速且可靠的分析方法，利用毛细管电泳（CE）结合电容耦合非接触式电导检测（C4D）技术来测定乙二醇（EG）和丙二醇（PG）。CE分离原理基于这两种二醇与背景电解质（BGE）中的硼酸根离子形成阴离子复合物。通过优化BGE中的硼酸根离子浓度，发现100 mmol l?1的浓度在实现适当分辨率和可接受的焦耳热效应之间取得了最佳平衡。两种二醇的分离时间不到5分钟，并且基线分辨率良好，相关系数大于0.99。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为EG 18.8 μg mL?1和PG 62.7 μg mL?1。在三个不同浓度水平下对样品进行回收测试，结果显示回收率在86%至113%之间，表明该方法具有较高的准确性。所提出的CE-C4D方法成功应用于多种样品的测定，包括发动机冷却液、漱口水和电子香烟用电子液体（e-liquid）。

**1. 引言**
乙二醇（EG）和丙二醇（PG）属于醇类化合物，通常被称为二醇，其分子结构中含有两个羟基，分别连接在两个不同的碳原子上。这两种二醇广泛应用于各种工业领域。例如，EG可用作溶剂、化学合成（树脂和聚合物）的前体以及汽车和工业冷却剂中的防冻剂；而PG则常作为食品和药品制剂中的添加剂，以及电子香烟电子液体中的溶剂。虽然PG的最大安全摄入量为25 mg kg?1，对人体相对安全，但EG的毒性明显更高[[1], [2], [3]]。EG在人体内代谢会产生有毒代谢物，如乙醇酸、乙二酸和草酸，这些物质可能导致肾衰竭以及中枢神经系统和心脏系统的损伤[1]。由于EG是一种无色、无味且带有甜味的液体，其毒性可能被低估，从而引发安全问题。已有报道指出，儿童和宠物曾意外或故意摄入EG[4]。因此，准确测定EG和PG对于质量控制、食品安全和临床试验至关重要。目前最常用的方法是气相色谱（GC），但这类方法通常需要复杂的样品处理和衍生化步骤[[4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]]。此外，还探索了基于液相色谱[12]、质子核磁共振（1H NMR）[13]、电化学[14]、比色[15,16]和荧光[17]检测的替代分析方法。

毛细管电泳（CE）是一种成熟的分析技术，可用于分离和定量离子化合物及可电离化合物[18,19]。该技术基于化合物在充满背景电解质（BGE）的毛细管柱中，在高电场强度（300–500 V cm?1）下的差异迁移现象。CE的主要优点包括分析速度快、样品用量少以及残留物生成量少。当使用电容耦合非接触式电导检测（C4D）时，该方法特别适用于那些在紫外-可见光范围内无吸收或吸收很弱的化合物（如EG和PG）[20,21]。C4D通过高频（数百kHz）正弦信号来检测电导变化，而电极无需与毛细管内的BGE直接接触。CE-C4D已成功应用于多种基质中多种化合物的定量[18,19,[24], [25], [26], [27]]。

然而，EG和PG在强碱性介质中也不会发生电离，这使得它们通过CE分离变得较为困难。尽管如此，通过形成阴离子硼酸酯（见图1）可以克服这一难题。这类多元醇可以与硼酸和某些金属离子形成复合物，其中硼酸根离子是最常用的配体[28]。尽管已有研究利用CE-C4D方法测定多元醇，但尚未针对低分子量二醇（如EG和PG）进行验证[29]。

**2. 实验**
2.1. 试剂和溶液
所有试剂均为分析级。EG、赤藓糖醇、半乳糖、N-环己基-2-氨基乙磺酸（CHES）、N-甲基葡胺、PG、十水合四硼酸钠（硼砂）和三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）均购自Merck Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。超纯水由Millipore公司的Direct-Q3水纯化系统制备。

BGE每天通过将适量硼砂溶解在超纯水中来配制，以达到所需的硼酸根浓度。EG和PG的标准储备溶液浓度为10 mg mL?1，通过将相应质量的液体二醇稀释在超纯水中获得。工作标准溶液的浓度范围为100–1000 μg mL?1，通过将储备溶液与BGE混合并加入适量的内标物（Tris或赤藓糖醇，浓度为500 μg mL?1）来制备。

2.2. 仪器和实验程序
2.2.1. CE-C4D分析
实验使用自制的设备，毛细管柱为裸露的熔融石英材质，长度70 cm（有效长度62 cm），外径360 μm，内径50 μm。阳极电极位于进样端，阴极电极位于检测端。样品以11 kPa的压力在阳极侧进行5秒的动态进样。C4D检测器位于毛细管末端（阴极侧）前方8 cm处，工作频率为585 kHz，电场幅度为2 V。在这种条件下，电渗流（EOF）方向朝向阴极。每天通过用0.1 mol l?1 NaOH冲洗（5分钟）、超纯水（5分钟）和BGE（10分钟）对毛细管进行清洗。每次分离前，再用BGE冲洗1分钟以提高迁移时间的准确性。电泳图中的峰面积通过Origin软件（版本8.1）进行积分处理，并用于校准曲线的线性回归分析。

2.2.2. 样品制备
发动机冷却液、漱口水和电子香烟用电子液体样品均购自巴西坎皮纳斯市的本地市场。发动机冷却液和漱口水样品按需用BGE稀释，稀释倍数分别为250–500倍和200–250倍。由于电子液体粘度较高，直接移液较为困难，因此称取0.2000 g样品并用超纯水稀释至10 mL，再进一步用BGE稀释20倍后注入CE-C4D系统。对于所有样品，均选择合适的内标物（详见讨论部分），并将其加入浓度为500 μg mL?1。

在回收测试中，样品初始添加三种不同浓度的目标化合物。每种浓度水平重复三次以评估回收精度。回收测试后，样品按前述步骤进行处理。

2.2.3. CE-C4D方法的分析参数
通过校准曲线（浓度范围100–1000 μg mL?1）的确定系数（R2）评估方法的线性。校准曲线基于二醇与内标物峰面积的比值绘制。数据处理使用Excel 2024软件（微软公司，美国华盛顿）。检测限（LOD）和定量限（LOQ）根据电泳图中信噪比为3和10时的分析物浓度计算得出。方法的准确性通过在不同浓度水平下的回收测试进行评估。

**3. 结果与讨论**
3.1. CE-C4D分离优化
选择含有硼酸根的BGE对于实现二醇的分离至关重要，因为它们会与硼酸根离子形成阴离子复合物（见图1）。通过调整BGE中的硼酸根浓度，可优化EG和PG峰之间的分离效果。硼酸根浓度范围为20–160 mmol l?1，分离电压为15 kV。当硼酸根浓度低于80 mmol l?1时，分离效果不佳。补充材料中的图S1显示了使用不同硼酸根浓度（80–160 mmol l?1）的BGE获得的EG和PG标准溶液的电泳图。由于形成的硼酸酯复合物的离子导电性低于BGE中的共离子，因此二醇峰呈负极性。硼酸根浓度的增加使二醇峰之间的分离度线性提高（见图S2）。硼酸根浓度的增加使硼酸酯复合物向产物侧偏移，从而增加了带负电荷的复合物比例。由于游离二醇缺乏电泳迁移能力，实际迁移速率受硼酸酯复合物比例的影响。因此，增加硼酸酯复合物的比例可提高二醇的有效迁移速率。由于分离过程中存在逆电渗流，PG的迁移时间比EG长，表明PG-硼酸酯复合物的有效迁移速率更高。此外，实验结果表明PG形成的硼酸酯复合物比EG更稳定。

当硼酸根浓度超过120 mmol l?1时，毛细管内的电流过大，导致焦耳热效应显著增强，从而影响分离效果并可能引起基线不稳定。此外，高离子强度的BGE容易堵塞毛细管。由于100 mmol l?1硼砂溶液能够提供满意的峰分离度（1.5），同时避免高浓度带来的问题，因此选择此条件。后续研究中将分离电压提高到25 kV，使二醇的迁移时间缩短至5分钟以内（见图2）。图2显示了使用优化后的BGE（硼酸根浓度100 mmol l?1，pH 9.2）获得的EG和PG标准溶液的电泳图，其中带星号的峰为系统峰（特征峰）。

2.2.2.2. 内标物的选择
为提高方法精度，特别是样品进样时的准确性，评估了几种化合物作为内标物的可行性。这些化合物包括半乳糖、N-甲基葡胺、CHES、Tris和赤藓糖醇。它们含有羟基，能与硼酸根形成复合物，从而在相同条件下实现检测和分离。虽然CHES不属于多元醇，但已有研究表明其适合作为CE-C4D方法中的内标物[29]。然而，大多数化合物因峰强度低、信号扭曲或与样品中的其他成分共迁移而不适合用作内标物。相比之下，Tris和赤藓糖醇具有较好的峰分辨率和强度（见图S3），但Tris会与甘油共迁移，因此仅适用于不含甘油的样品（如发动机冷却液和漱口水）。另一方面，赤藓糖醇没有显示出共迁移现象，但其迁移时间（6.11分钟）比Tris（5.32分钟）更长。因此，赤藓糖醇仅被用作含有甘油（电子液体）的样品的内标（IS）。尽管内标使电泳运行时间延长到大约6分钟，但分析时间被定义为最后一个糖醇的迁移时间，即4.62分钟。3.2 CE-C4D方法的分析参数表1总结了所提出方法的主要分析参数。两种糖醇的迁移时间和峰面积的日内和日间相对标准偏差（RSD）在0.6%到4.1%之间，表明这些参数的精度是可以接受的。高分离效率是毛细管电泳（CE）的一个显著特点，这体现在每米板数（N/m）的增加上。两种糖醇都表现出良好的线性，决定系数（R2）高于0.99。使用CE-C4D方法分析的样品中常见的EG和PG浓度，其检出限（LOD）和定量限（LOQ）是合适的。表1. CE-C4D方法的主要分析参数。参数糖醇EGPG迁移时间（分钟）a4.53 ± 0.034.62 ± 0.03日内迁移时间的RSD（%）a0.70.6日间迁移时间的RSD（%）a1.51.6日内峰面积的RSD（%）a2.83.2日间峰面积的RSD（%）a3.34.1N/m74,583 ± 185298,011 ± 2254动态线性范围（μg/mL）100–1000100–1000校准曲线斜率（μg/mL × 10^-3）1.791.45校准曲线截距（x × 10^-3）77.285.9决定系数（R2）0.9980.996LOD18.8 μg/mL（0.303 mmol/L）21.1 μg/mL（0.277 mmol/L）LOQ62.7 μg/mL（1.01 mmol/L）70.4 μg/mL（0.924 mmol/L）a = 10。b每米板数（平均值 ± 标准偏差，n = 10），计算为N/m = 16（tm/wb），其中tm = 迁移时间，wb = 峰基宽，L = 毛细管柱的有效长度。所提出方法的准确性是通过在每个分析样品的三个浓度水平上进行回收测试来评估的。表2总结了回收值，范围在86%到113%之间，最大RSD为12%，表明该方法适用于不同基质的样品。表2. 使用所提出的CE-C4D方法在三个浓度水平上的各种样品的回收值。样品糖醇添加浓度a发现浓度a ± SD回收率 ± SD（%）b发动机冷却液1EG10094 ± 394 ± 3200190 ± 1395 ± 7300273 ± 1691 ± 6发动机冷却液2EG5051 ± 4102 ± 8100107 ± 9107 ± 8150159 ± 13106 ± 8漱口水1PG5048 ± 695 ± 1210092 ± 692 ± 7150132 ± 188 ± 1漱口水2PG4045 ± 5113 ± 118072 ± 390 ± 4120103 ± 386 ± 3电子液体PG200182 ± 1191 ± 6400356 ± 1489 ± 4600576 ± 1796 ± 3a添加浓度（mg/mL，发动机冷却液和漱口水）和mg/g（电子液体）。b = 3。3.3. 在商业样品中测定EG和PG的存在BGE中硼酸盐的存在对于实现糖醇的CE分离是必要的。然而，使用BGE稀释工作标准溶液和样品得到的峰比在超纯水中稀释得到的峰更强烈且更对称（数据未显示）。这些结果很可能是因为在样品注入CE-C4D系统之前就开始反应，从而更快地达到了平衡状态。图3显示了在添加了所测定的糖醇之前和之后的两个样品的电泳图。下载：下载高分辨率图像（189KB）下载：下载全尺寸图像图3. （A）发动机冷却液和（B）电子液体样品在添加EG或PG之前的（红线）和之后的（黑线）电泳图。EOF是电渗流标记，（B）中用星号标记的峰对应于样品中存在的甘油。分离条件与图2相同。图3B中的电泳图显示，在电子液体样品中有一个峰被确认为甘油，它与用作内标的Tris发生了共迁移。为了避免这种共迁移，在电子液体分析中用赤藓糖醇代替了Tris作为内标。通过CE-C4D方法测定的分析样品中EG和PG的原始浓度（稀释前）显示在表3中。正如预期的那样，EG仅在发动机冷却液中定量到，因为它是该配方的活性成分。此外，由于其高毒性，EG不预期会存在于直接接触人体的产品中。由于产品制造商没有提供糖醇浓度信息，因此无法与所提出的CE-C4D方法测定的浓度进行直接比较。表3. CE-C4D在商业样品中测定的EG和PG的浓度。样品发现浓度aEGPG发动机冷却液1277 ± 14NDEngine冷却液281 ± 2ND漱口水1ND72 ± 4漱口水2ND56 ± 3电子液体ND276 ± 5缩写：ND，未检测到（低于LOD）。a原始浓度（平均值 ± 标准偏差，n = 3），稀释前表示为mg/mL（发动机冷却液和漱口水）和mg/g（电子液体）。3.4. 与其他方法的比较表4将所提出的CE-C4D方法的一些分析参数与同时测定EG和PG的研究中报告的参数进行了比较。所有引用的研究都使用了GC，这是这种类型化合物最常用的分离技术。在分析时间、动态线性范围和准确性方面，所提出的CE-C4D方法与GC方法相当。然而，所提出方法的LOQ高于大多数GC方法，除了使用FID检测的方法。这种较低的灵敏度使得该方法难以用于定量低浓度样品中的EG和PG，例如生物样品。然而，这种LOQ适用于本研究中分析的样品。此外，CE-C4D方法更为简单，因为它不需要衍生化步骤，样品制备简单（只需稀释），并且使用的仪器更简单、成本更低。此外，CE-C4D方法在不同基质的样品中都得到了成功的评估，证明了其在常规质量控制分析中的多功能性。表4. CE-C4D方法与其他同时测定EG和PG的方法的比较。技术样品糖醇分析时间（分钟）线性范围（μg/mL）LOD（μg/mL）LOQ（μg/mL）回收率（%）参考文献气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）血液血清和尿液EG4.9325–5000258396–109[8]PG25–5000258392–106气相色谱-质谱室内空气EG9.630.27–1090.10.387–93[11]PG0.11–45.90.040.1110–119顶空气相色谱血液血浆和血清EG2.5210–200310103.6[10]PG100–2000310103.2同位素稀释气相色谱-质谱全血EG5.454 × 10^-4–0.41 × 10^-3a3 × 10^-3a61.6–69.6[6]PG4 × 10^-3 - 21 × 10^-3a3 × 10^-3a69.3–73.9CE-C4DEngine冷却液、漱口水和电子液体EG4.62b100–1000196398–110本研究PG100–1000217086–113aLOD和LOQ仅由作者根据空白人全血的不可用性估算。b考虑了PG的迁移时间。4. 结论本研究表明，硼酸盐离子与EG和PG的羟基之间形成阴离子硼酸酯，使得可以通过CE-C4D分离和测定这些糖醇。这种方法克服了在BGE中使用的普通pH值下这些糖醇无法电离的问题。此外，C4D适用于检测那些没有紫外-可见光吸收的分析物。所提出的方法被认为是可靠的，并且简单易行，适用于测定多种样品中的EG和PG。与最广泛使用的分析方法（如气相色谱）相比，所提出的方法灵敏度较低。然而，CE-C4D方法消除了繁琐的衍生化步骤，需要的试剂较少，产生的残留物也较少，符合绿色分析化学的原则。我们认为CE-C4D可以在制药、食品和其他相关行业的质量控制和安全方面发挥作用。CRediT作者贡献声明Gabriela A.M.C. Ribeiro：撰写 – 原始草稿，方法学，数据管理。Layra M. de Faria：方法学，形式分析，数据管理。José A. Fracassi da Silva：撰写 – 审稿与编辑，资源，方法学，资金获取。Dosil P. de Jesus：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，监督，软件，资源，项目管理，方法学，研究，资金获取，形式分析，数据管理，概念化。