综述：研究体外人生殖器组织中宿主对HIV感染反应的新方法

《American Journal of Reproductive Immunology》：Novel Approaches for Investigating Host Responses to HIV Infection in Ex Vivo Human Genital Tissues

　　**摘要**

理解局部免疫反应和生殖黏膜屏障的结构完整性对于推进对性传播HIV易感性和慢性HIV感染发病机制的认识至关重要。本综述重点介绍了使用体外人类生殖组织研究宿主对HIV感染反应的创新方法。空间转录组学和多重成像技术的最新进展使得能够高分辨率地分析组织结构、免疫细胞分布以及黏膜环境中的基因表达。这些技术揭示了与HIV易感性和慢性感染相关的空间异质性免疫反应以及上皮和黏膜下结构的变化。针对生殖组织形态定制的计算工作流程提高了重复性，并支持转录组学和成像数据的整合。尽管目前存在诸如分辨率限制和高成本等局限性，但空间转录组学和生物成像平台的持续改进有望提供对黏膜屏障功能和HIV发病机制的更深入见解。通过这些方法表征组织特异性免疫动态，可能有助于开发旨在增强黏膜防御和降低HIV感染脆弱性的靶向干预措施。

**1 引言**

在HIV研究的早期几十年里，科学研究的重点主要集中在血液来源的样本上。这种方法忽视了黏膜组织，尤其是女性生殖道中的黏膜组织，而这些组织是性传播过程中病毒进入的主要部位。2019冠状病毒病（COVID-19）大流行也说明了这一点，它表明外周血液中的免疫反应可能与病原体在黏膜组织中启动复制和驱动疾病过程的反应大相径庭[1, 2]。HIV利用黏膜环境的特殊免疫特征来建立感染，包括其细胞组成、细胞因子环境和上皮屏障[3, 4]。与黏膜部位相关的淋巴组织，特别是肠道，由于含有丰富的活化CD4+ T淋巴细胞，因此特别容易受到HIV感染[5, 6]。研究系统、黏膜和淋巴系统在免疫动态上的差异对于推进HIV的预防、治疗和疫苗策略至关重要。对肠道相关淋巴组织的研究揭示了HIV发病机制的几个方面，如上皮完整性的破坏、CD4+ T细胞的严重耗竭和慢性免疫激活[7]。相比之下，在HIV感染的急性期和慢性期，对女性生殖道的探索相对较少。信息缺乏反映了持续的障碍：临床样本获取困难、伦理和程序限制以及生殖道内免疫网络的复杂性。因此，我们对局部宿主防御、病毒库的建立以及该部位组织特异性进展的理解仍然不完整，这阻碍了旨在阻止感染的干预措施的发展。未来的研究应优先从处于HIV感染不同阶段（包括急性和慢性期）的女性以及暴露风险较高的血清阴性女性中获取宫颈阴道组织样本。获取此类材料将使我们能够详细了解病毒进入主要部位的免疫环境和组织结构；同时也能提供关于病毒长期存在的见解。尽管非人类灵长类动物模型为该领域做出了贡献，但物种之间存在根本差异，包括黏膜免疫组织、内分泌影响、微生物群落和组织结构的差异。这些差异限制了动物观察结果在人类生物学中的直接适用性。相比之下，使用体外人类黏膜组织进行实验为研究人类感染、宿主防御和治疗反应的特异性过程提供了一个独特的相关框架。最近的技术进步改变了人类黏膜免疫和HIV感染的空间生物学领域[8, 9]。高维方法，如空间转录组学、空间分辨蛋白质组学（例如多重免疫荧光成像）、单细胞RNA测序和活细胞成像结合功能分析，现在允许对组织微环境进行详细分析。当应用于女性上生殖道时，对人类输卵管上皮的空间转录组学分析揭示了具有重要意义的空间调控基因表达模式，这对女性生殖健康具有重要意义[10]。这些空间组学方法对于研究由外阴、阴道和外宫颈组成的女性下生殖道黏膜也特别有价值。每个部分都具有独特的上皮结构、常驻微生物群和免疫细胞群体。这些方法可以生成整合数据集，以传统组织学或批量分析无法实现的精度捕捉细胞多样性和空间背景。在本综述中，我们描述了将多重成像和空间转录组学应用于从已确诊HIV感染的女性以及高风险个体获得的体外外宫颈组织的方法。通过这些例子，我们强调了这些方法带来的新见解，以及它们在阐明宿主-病原体相互作用和维持HIV疾病中黏膜屏障功能方面的更广泛潜力。

**2 组织采集和数据处理的伦理和后勤考虑**

**2.1 获取女性生殖道活检的伦理和实际问题**

在HIV影响严重的群体中收集外宫颈和阴道组织样本需要仔细的伦理考量。这类程序本质上是侵入性的，必须尊重参与者的安全、自主权和文化敏感性。主要关注点包括确保知情同意、在恢复期间保护参与者，以及最小化行为或临床风险。国际指导文件（例如联合国艾滋病规划署和世界卫生组织发布的文件）强调了进行此类研究时的关键伦理原则[11, 12]。Lajoie等人[13]在肯尼亚的一组女性性工作者中进行了活检研究，提供了一个值得注意的例子。该研究展示了如何通过综合的生物医学、行为和社区层面的保护措施来解决伦理挑战。开发了一种理解工具，以确认参与者完全理解活检程序及其影响，包括在愈合期间需要避免性活动。考虑到黏膜损伤可能会暂时增加HIV感染的易感性，可以通过检测宫颈阴道分泌物样本中的前列腺特异性抗原（一种常用的阴道精液暴露生物标志物）来监测依从性[14]。谨慎的移动电话提醒可以进一步支持术后依从性，而经济补偿可以被视为对因必需的禁欲而损失的收入的公平补偿。与当地临床医生和同伴教育者的合作可以进一步增强信任并确保文化敏感性。从方法论的角度来看，通常两个约2-3毫米的外宫颈穿刺活检，结合宫颈阴道分泌物样本，足以支持基因和蛋白质表达的多组学分析。对于转录组学研究，一个活检样本应立即置于RNA保存介质中。第二个活检可以根据成像或蛋白质组学应用的需要进行快速冷冻或固定。这些采集实践遵循宫颈病变筛查的标准临床程序。阴道活检通常需要局部麻醉，但其他方面遵循类似的方法。

**2.2 空间分辨高维数据中的伦理考虑**

空间组学方法的出现使得能够仔细检查组织结构和分子动态[15]。然而，将这些方法应用于体外生殖道样本可能会引入伦理挑战，因为空间信息可能会无意中捕获独特的解剖或病理特征。与批量组学不同，空间数据集的分辨率可能会阻碍有效的匿名化；罕见情况或小样本量在与上下文元数据结合时进一步增加重新识别的风险。因此，知情同意程序必须明确解释空间数据生成的范围。向开放科学的广泛转变必须与对敏感空间数据集的负责任管理谨慎平衡。开放访问存储库可能不适合无限制地存放生殖组织数据。相反，受控访问基础设施可以提供具有严格使用条件的安全分发模型[16, 17]。额外的数据共享机制强调了协调的伦理框架和治理结构对于二次数据使用的重要性。

**3 先进的生物成像和空间组学在研究黏膜屏障和免疫中的作用**

**3.1 多重免疫荧光用于高维组织和免疫分析**

数字生物图像分析涉及从数字化组织或细胞图像中系统地提取可重复的定量信息（图1）。在过去二十年里，该领域从主观的手动解释转向了高度自动化的标准化方法。21世纪初引入的全切片成像是一个重要的转折点，使组织学材料广泛可供非专业病理实验室的研究人员使用[18]。图1展示了使用多表位配体图谱（MELC）在来自肯尼亚女性性工作者的体外生殖组织样本中的人类外宫颈上皮中识别白细胞的情况。应用了多重染色面板：（A）核染色（DAPI，蓝色）、白细胞（CD45，红色）、上皮结构（E-钙粘蛋白，绿色）和血管（CD31，黄色）被可视化。（B）与（A）所示区域相同，展示了用于组织分析的完整MELC标记面板（DAPI，CD45，CD3，CD4，CD8，CD69，CD103，EOMES，CD161，TCRVa7.2，GZMA，GZMB，HLA-DR，Langerin，CD66b，CD49a，CD31，E-钙粘蛋白）。在生物医学研究中，数字成像方法现在是研究细胞组织、组织结构和治疗分布不可或缺的一部分[19-21]。临床分析也取得了显著进展，特别是在肿瘤学领域。过去十年中，美国食品药品监督管理局批准了用于诊断应用的生物成像解决方案，包括乳腺癌的自动评分系统[22]。此外，Str?m等人将基于人工智能的图像分析流程应用于前列腺癌的诊断和分级[23]。这同样适用于HIV研究，其中对淋巴组织和黏膜组织的定量组织学评估对于理解病毒库、免疫激活和组织特异性病理至关重要。先进的多重免疫荧光是新兴的空间蛋白质组学领域中的一个强大方面，被《自然方法》评为“2024年方法”[24]。该领域允许在完整的黏膜组织切片中同时检测数十到数百个蛋白质标记物，从而捕捉局部免疫景观中的空间关系。支持多重成像的商业系统现已广泛可用，为探究感染、炎症和组织稳态背后的复杂细胞和分子动态提供了前所未有的机会。

**3.2 空间转录组学用于表征黏膜结构和免疫动态**

单细胞RNA测序（scRNA-seq）通过提供单个细胞水平的详细转录谱图改变了生物医学研究。然而，这种方法存在固有的局限性：所需的组织分离可能会引起细胞应激、改变基因表达模式，并消除理解组织组织和细胞间通信所需的空间背景。2016年，空间分辨转录组学方法的出现是一个突破[15]，后来由10x Genomics商业化为Visium。这一创新使得可以直接在完整组织切片中量化基因表达，将分子信息与组织结构联系起来。通过保留位置背景，空间转录组学使研究人员能够研究基因表达在不同组织区域的变化以及细胞在其天然微环境中的相互作用（图2）。图2展示了应用于外宫颈组织的空间转录组学的示意图。解剖定位了外宫颈（左侧），并使用组织学切片进行空间转录组学分析。转录组捕获位置由点表示，这些点被分组为转录定义的簇。这些簇对应于不同的上皮层和黏膜下区域，如组织学参考所示（中间）。示意图（右侧）表明每个点可能包含多个细胞和细胞类型。尽管空间转录组学的分辨率通常低于scRNA-seq，但两种方法是互补的。scRNA-seq提供了稳健的转录异质性见解，而空间转录组学将这些数据锚定在特定的组织位置。通常通过一种或多种计算策略实现整合，包括使用scRNA-seq作为参考来推断每个空间点中的细胞类型，以及使用各种空间相互作用分析来表征微环境和通信网络[25]。空间转录组学的最新进展提高了灵敏度、多重性和分辨率[26]。新兴平台支持构建包含数千个同时检测到的转录子的空间分辨组织图谱。这些能力在HIV等传染病研究中特别有用，因为设计针对性治疗策略依赖于了解病毒库、免疫群体和组织重塑过程在生殖黏膜中的分布。

**3.3 朝向女性生殖道的多组学图谱**

尽管对黏膜免疫学和传染病研究的兴趣显著增加，但公开可用的女性生殖道数据集主要集中在癌症方面。像癌症基因组图谱（TCGA）和癌症研究数据共享（CRDC）这样的大规模项目已经为宫颈、阴道和外阴癌生成了大量的数据集[27, 28]。相比之下，来自非恶性组织的数据集，特别是来自健康女性或HIV感染者的数据集，非常稀缺。这种不平衡限制了在生理和病理状态、解剖区域以及人群组之间的比较研究。这也限制了在模拟黏膜屏障功能、宿主防御机制以及对性传播感染的易感性方面的进展。

除了人类蛋白质图谱[29]之外，一个空间分辨的多组学图谱，专注于女性生殖道，可以提供转录组学、蛋白质组学和成像数据，这些数据对于推动该领域的发展至关重要。最近的研究强调了这种方法的可行性和实用性。例如，对HIV感染女性的宫颈组织进行分析发现，上皮屏障受到破坏，慢性免疫激活以及CD4+目标细胞的定位发生了改变，这些过程与病毒的传播和发病机制密切相关[30, 31]。一个全面的图谱可以包含多种设计特点：包括健康志愿者和HIV感染者；纵向采样以捕捉随时间的变化；以及标准化元数据，记录临床特征、激素影响和微生物组成。

4 数据分析和计算工作流程

4.1 生物图像分析中的软件平台和核心概念

随着成像硬件和计算技术的进步，也开发出了许多数字图像分析软件。商业软件包通常与特定的成像系统捆绑销售，它们更倾向于标准化而非灵活性。这些软件的专有性质可能会限制它们适应特殊研究或探索性调查的能力。为了克服这些限制，可以使用开源软件平台（如QuPath [32]、FIJI/ImageJ [33]、CellProfiler [34] 和 Ilastik [35]）来表征HIV易感性的生物标志物。这些平台提供了一个灵活的环境，可以根据项目需求定制工作流程。一旦工作流程建立并得到验证，它们可以实现：a) 使用一致的参数自动处理大量图像数据集，b) 在高通量研究中显著节省时间并减少人工干预，c) 通过标准化的自动化工作流程提高可重复性，d) 适用于涉及数百或数千张图像的研究。在我们的研究中，其中一些软件支持为特定区域（例如多层上皮或黏膜下层）的图像分割、免疫细胞计数以及上皮屏障完整性的评估——这些分析在固定的商业框架中实现起来会很有挑战性。此外，这些工作流程可以在具有相似组织结构的组织之间部分重用，从而有效地适应和重复相关样本类型的分析。开源软件的另一个好处是能够轻松地将协议传播给更广泛的研究社区，这提高了透明度、可重复性和集体改进。这些工作流程不受许可费用或专有技术的限制。它们的适应性也使它们适用于多种组织类型和实验设置。然而，开源软件的优势也带来了一些挑战。有效使用通常需要更高的技术专长，这可能会阻碍不熟悉图像分析的研究人员。此外，开发经过验证的、针对特定项目的工作流程可能非常耗资源。必须优化流程，并在结果能够被自信地解释之前确认其准确性。另一个重要的考虑因素是高计算需求，尤其是在处理大型图像文件和数据集时。这需要配备足够处理能力的工作站，或者使用能够提供足够图形处理单元（GPU）资源的基于云的分析平台。无论使用何种软件环境，生物图像分析工作流程通常包括以下核心步骤：(a) 图像预处理以减少背景噪声和校正颜色强度变化，(b) 分割以定义感兴趣的对象，如组织区域或单个细胞，(c) 提取描述性特征，如面积和荧光强度，(d) 结果分类，包括形状、大小或信号强度[36]。

4.2 空间转录组学的计算环境

空间转录组数据的解释需要将分子读数与潜在的组织学框架结合起来。只有当可视化结果清晰且可以在单个或多个组织切片上扩展时，这些数据集的价值才能得到实现。为了支持此类分析，在R和Python等常见编程环境中开发了多种计算工具。其中最广泛应用的框架之一是Seurat（用R实现；[37]最初是为单细胞转录组学研究设计的，但后来扩展到了空间技术。Scanpy [38]在Python中提供了类似的功能，提供了针对各种单细胞和空间数据分析的流程。空间转录组数据分析工作流程可以包括以下核心步骤：(a) 导入数据，(b) 质量控制，(c) 样本整合和降维，(d) 聚类和簇注释（簇的差异基因表达分析），(e) 不同研究组之间的差异基因表达，(f) 将斑点去卷积为细胞类型百分比[39]。

4.3 空间和基于成像的分析中的重复性

空间组学和成像平台的实用性在很大程度上取决于其输出的可靠性，而这种可靠性又受到生物学和技术重复性的影响。生物学重复样本来自不同的供体或解剖部位，由于年龄、激素环境、微生物组组成和疾病状态的差异而表现出较大的变异性。这种生物学多样性可能与样本收集和处理过程中引入的技术性变异因素相互作用。女性生殖道的黏膜样本容易受到酶促降解和机械应力的影响。程序上的差异（例如活检技术、运输条件和固定方法）会显著改变组织形态和分子完整性。下游的空间蛋白质组学和转录组学读数可能受到分析前因素的影响，包括冷冻延迟、包埋介质（最佳切割温度化合物（OCT）与石蜡）、切片厚度等，这些因素都会影响染色效果和RNA的保存。空间分析平台，如10x Genomics Visium/Xenium、NanoString CosMx和多重免疫荧光，各有优势和局限性，这些都会影响结果的解释和比较。基于免疫荧光的方法严重依赖于抗体的性能、荧光团的稳定性和自荧光程度，这些因素在不同组织和实验运行中可能会有所不同。批次效应可能由试剂批次、扫描仪校准或成像参数的变化引起[40]。转录组平台在空间分辨率和转录本捕获效率上有所不同。例如，Visium提供了广泛的转录组覆盖范围和中等的空间细节，而CosMx使用靶向面板实现了单细胞分辨率[41, 42]。在跨平台分析结果或尝试数据整合时，必须考虑这些差异。空间研究的可重复性需要精心设计。包括多个生物学重复样本（例如来自不同个体或解剖区域的样本）以及技术重复样本（如重复染色或测序），可以识别和量化变异来源。然而，由于组织收集的侵入性以及由此导致的样本稀缺性，合并多个重复样本的可行性往往受到限制。此外，这些方法的高成本也给重复实验带来了重大障碍。关键的质量指标，如组织覆盖范围、RNA完整性、信噪比和分割准确性，应定期报告并用于筛选低质量数据。对于跨平台分析，归一化和批量校正策略（例如Harmony、基于Seurat的方法）对于最小化技术伪影同时保留真实的生物学信号至关重要。

5 多重成像和空间转录组学在人类生殖组织中的应用

5.1 为高分辨率表征黏膜组织量身定制的生物图像分析工作流程

在非人类灵长类动物中的研究表明，上皮完整性是SIV易感性的一个主要决定因素[43, 44]。女性生殖道中的强健上皮屏障理论上可能有助于降低HIV的传播效率。然而，不同解剖部位的上皮特征存在显著差异。在阴道和外宫颈，表层上皮通常厚度为150–500微米，由25–30层分层鳞状细胞组成。相比之下，直肠黏膜由单层柱状上皮构成。这种单层上皮可能提供的机械防御较弱，在肛门性交时容易发生微撕裂，从而可能促进病毒进入。为了从不同复杂性的黏膜组织中获得可靠且可重复的信息，需要专门针对每个部位的结构特征定制图像分析工作流程。在一个评估抗病毒化合物Griffithsin的I期人类临床试验中，我们开发了一个针对单层上皮的直肠活检的自动化流程。该方法分离了上皮和黏膜下层区域，量化了CD4+淋巴细胞，并通过E-钙粘蛋白染色评估了上皮完整性[45]。分割程序经过优化，以反映柱状上皮的形态，确保在多个样本上的分析无偏。我们将类似的方法应用于外宫颈的多层分层鳞状上皮[46]。我们的工作流程进行了修改，以改进分割并增强与慢性HIV感染相关的结构异常的量化[30]。在这两个项目中都使用了一种经过验证的方法来计数外宫颈组织中的CD4+细胞，确保了方法的一致性并便于比较[47]。这些协议的扩展已被用于男性生殖组织的研究，以识别与HIV感染风险相关的生物标志物[48]。此外，我们还修改了生物图像分析工作流程，以处理由多重免疫荧光生成的高维数据集，包括Multi-Epitope Ligand Cartography (MELC) [31]。这种方法结合了18个免疫标志物，实现了在慢性HIV感染背景下对宫颈免疫反应的详细表型和空间表征。高级聚类算法和降维技术被用来划分免疫细胞群体并定义它们在组织微环境中的空间排列。总的来说，这些定制的计算工作流程展示了如何整合自动化分割、标记物定量和空间映射，以揭示与HIV发病机制相关的组织特异性免疫动态和结构改变。这些方法为黏膜组织的高分辨率分析提供了一个强大的框架。

5.2 空间转录组学识别影响生殖屏障完整性的基因表达变化

传统的组织破坏方法，如流式细胞术和scRNA-seq，已经提供了关于HIV对免疫介质和上皮功能影响的宝贵见解。然而，这些方法也有局限性。例如，Steinert等人报告了在分离的黏膜悬浮液中测量的免疫细胞频率与显微镜观察到的频率之间的差异，表明在组织处理过程中丢失了重要的空间信息[49]。这些发现强调了在研究HIV感染中的黏膜免疫时保持结构背景的方法的重要性。我们最近的工作表明，慢性HIV感染与生殖道黏膜内的局部转录变化有关[30, 31]。参与上皮连接复合体、细胞外基质稳定性和屏障完整性的基因在外宫颈的特定区域下调。这些变化可能会创造更有利于病原体进入和免疫细胞浸润的微环境。这些结果强调，HIV感染中的上皮破坏不是均匀的，而是空间异质的，这突显了进行组织分辨分析的必要性。空间生物学技术也被证明对于研究局部微生物组如何影响女性生殖道的免疫环境非常有用[50-52]。在比较具有高度多样化的宫颈阴道微生物组的女性与那些以Lactobacillus crispatus/acidophilus为主的微生物组的女性时，空间转录组学揭示了外宫颈上皮基底膜处独特的基因表达谱[53]。前者组中差异表达的基因与上皮维持、黏膜下层细胞外基质组织和免疫功能有关。相比之下，以Lactobacillus crispatus/acidophilus为主的微生物组的女性表现出富含支持黏膜屏障完整性的通路的基因表达谱。在另一项研究中，Kaldhusdal等人[39]表明，激素调节进一步塑造了外宫颈的免疫环境。使用 depot medroxyprogesterone acetate (DMPA) 的女性的体外组织显示出免疫球蛋白转录本的广泛上调，以及关键上皮和基质完整性的基因的局部抑制。这些模式与系统性的雌二醇水平相关，表明DMPA诱导的低雌激素血症会影响黏膜完整性，并以组织特异性方式调节免疫反应。通过无监督聚类来区分上皮和黏膜下层区域，该研究提供了组织结构和免疫活动的高分辨率图谱。同样，Parthasarathy等人[54]在单细胞分辨率下表征了生殖细胞群体，并研究了树突状细胞亚群在HIV暴露后的即时反应。最早的抗病毒反应主要由树突状细胞主导，其特征是快速分泌细胞因子、非经典炎症途径的激活和宿主限制因子的诱导。总的来说，这些发现说明了空间转录组学和单细胞方法如何揭示影响生殖屏障功能和HIV易感性的组织特异性基因表达变化。

5.3 多重成像和空间转录组学在HIV研究中的综合见解

批量RNA测序提高了对黏膜免疫的理解，但其依赖于群体平均值，掩盖了细胞间相互作用的空间背景（图3）。空间转录组学通过保持组织结构来解决这一限制；结合多重成像技术，它提供了完整黏膜内转录和翻译特征的整合视图。这种综合方法能够同时映射结构屏障和免疫细胞群体，从而创建出与HIV相关的黏膜微环境的多维画像。

图3（在图查看器中打开）PowerPoint

组织活检中的批量转录组学与空间转录组学对比。比较了批量转录组学和空间转录组学在样本输入、数据输出和空间分辨率方面的差异。批量转录组学是对整个组织的基因表达进行平均处理，而空间转录组学则保留了空间背景并揭示了区域异质性。越来越多的证据表明，非淋巴组织中的驻留免疫细胞表现出与其循环中的对应细胞不同的功能特性[55]。这一观察结果强调了研究组织驻留免疫细胞以阐明HIV致病机制的重要性。了解靶细胞和效应白细胞在生殖组织中的定位对于阐明对HIV感染的局部免疫反应至关重要[56, 57]。然而，许多研究依赖于间接采样策略，如宫颈阴道冲洗或细胞刷取样，这些方法缺乏空间分辨率[58, 59]。最近，我们对肯尼亚女性性工作者的外阴组织进行的空间分辨分析显示，免疫激活广泛存在于上皮层和黏膜下层[31, 39]。与干扰素信号传导和体液反应相关的基因表达升高反映了慢性抗病毒状态；与T细胞效应功能相关的转录本在空间上更为局限的区域出现，与血清阴性对照组相比。这些观察结果表明，HIV感染导致的是分区化而非均匀的免疫调节。这种空间异质性可能解释了慢性感染如何影响黏膜免疫，并可能影响病毒的持续存在或免疫耗竭[60, 61]。基于成像和转录组学的数据集的结合使用为描述HIV感染者以及HIV感染高风险女性的黏膜免疫提供了全面的方法[31]。这些互补的方法揭示了HIV阳性女性体外来源的外阴组织样本中明显的上皮破坏和免疫调节改变。这些发现为HIV的致病机制及其与其他性传播感染的易感性提供了关键见解。

6 当前限制与未来展望

6.1 生殖黏膜组织取样的限制和潜在改进

侵入性生殖黏膜组织取样的主要挑战包括参与者招募、医疗设施和培训人员的有限性、要求参与者在手术前后一段时间内避免无保护性行为，以及缺乏标准化的取样和分析方案[62, 63]。取样方法、组织处理、固定和储存的差异可能导致显著的技术变异。此外，解剖部位的选择、染色组合和分析流程的不同也会阻碍跨研究比较，并限制研究结果的可重复性。全球范围内努力协调黏膜取样方案可以提高可重复性并促进跨研究比较。此外，开发开放获取的验证协议、试剂和元数据标准库将支持更广泛的采用和透明度。试剂、仪器和计算基础设施的高成本也是一个重要限制[64]。此外，这些空间分辨技术生成的大型复杂数据集需要先进的生物信息学能力。随着技术的成熟，成本预计会降低，通量也会提高。开发用户友好的开源生物信息学流程和机器学习算法可以进一步简化数据分析和解释。

6.2 多重免疫荧光技术的限制和潜在改进

基于多重免疫荧光的分析通常产生二维投影，尽管组织本身是三维的。这一限制可能会掩盖重要特征，如连接蛋白的连续性或免疫细胞沿z轴的精确定位。例如，在单个光学平面上观察到的上皮连接中断可能无法准确反映整个组织的连接完整性。同样，在二维图像中靠近上皮边界的免疫细胞实际上可能位于不同的空间层中。为了解决这些问题，未来的研究应结合体积测量方法，如共聚焦z层采集、光片显微镜或组织透明化策略与三维重建[65]。这些方法将允许更完整地表示组织形态，验证二维发现，并提高上皮结构和免疫相互作用的映射准确性。

6.3 空间转录组学的限制和潜在改进

尽管空间转录组学已经改变了完整切片内的全转录组分析，但在黏膜组织研究中仍存在一些技术挑战。一个关键的限制是分辨率：标准平台通常依赖于包含多个细胞的捕获区域，需要通过计算反卷积来估计细胞类型的特异性表达。然而，一些平台的进步现在已经实现了更高的空间分辨率，能够实现亚细胞转录本定位，并且更高通量的系统可以同时分析更大的组织区域和多个样本[66]。性能还取决于组织制备；新鲜冷冻材料可以获得最佳结果，而福尔马林固定石蜡包埋的样本通常表现出较低的RNA质量和敏感性。此外，一些平台仅检测多聚腺苷酸化的转录本，并显示出3′偏倚，限制了非编码RNA和异构体的识别。数据稀疏性，特别是对于低丰度转录本，构成了额外的分析挑战。条形码技术和分子捕获策略的改进提高了灵敏度，使得低丰度转录本的可靠检测成为可能。尽管当前平台在大规模队列研究中的应用有限，但空间转录组学仍然提供了宝贵的见解，尤其是在与高分辨率成像和单细胞方法结合使用时。多模态平台通过结合空间转录组学、蛋白质组学和代谢组学，提供了更全面的组织生物学视图。通过努力提高组织兼容性和结合人工智能进行图像解释和数据整合，也取得了进展。这些发展将继续支持组织水平免疫反应分析的实质性进步。

7 结论性评论

在黏膜免疫学中，表达基因的空间分布和细胞起源与分子本身一样重要；某种介质根据其位置可能具有不同的生物学后果。例如，宫颈阴道上皮中升高的蛋白酶活性支持正常的细胞更新，但在更深层次中的类似活性则与炎症和上皮损伤相关。此外，抗蛋白酶、角蛋白和上皮连接蛋白的表达水平在分层上皮中遵循结构化的空间模式，这反映了正常的角质形成细胞分化。这种蛋白质表达模式的破坏或改变可能导致黏膜功能异常，从而促进疾病进程。对生殖黏膜组织进行空间分析提供的见解远远超出了上皮完整性的范围。通过解析免疫细胞在其天然组织结构中的位置、激活状态和相互作用，空间方法可以阐明HIV易感靶细胞如何在特定微环境中积累，炎症龛如何形成，以及组织驻留免疫群体如何贡献于保护或脆弱性。这些方法还可以揭示基质、血管和神经成分如何塑造局部免疫动态，影响病毒的进入、传播和早期免疫反应。这种多层次的空间信息通过将细胞定位和微环境背景与病毒传播和早期扩散的最早事件联系起来，加深了我们对HIV致病机制的理解。这些过程无法仅通过批量或单细胞分析来捕捉。多组学方法的进步通过结合空间、转录、蛋白质组和代谢组学数据，提供了对黏膜组织的更全面视图。同时，计算和分析流程的快速改进使得这些复杂数据集的整合和解释更加精确和可扩展。由于完整的黏膜免疫屏障对于抵御HIV等性传播病原体至关重要，基于空间的方法学进步为开发保护上皮完整性、减少有害炎症和增强局部免疫防御的干预措施提供了有价值的指导。这些方法还可以通过揭示候选干预措施如何影响相关组织 compartment 中的黏膜结构、信号传导和细胞组成，从而支持局部杀微生物剂和暴露前预防（PrEP）制剂的改进设计和安全性评估。

致谢

作者感谢K. Fowke博士、J. Kimani博士、J. Lajoie博士和K. Omollo博士在肯尼亚内罗毕的性工作者外展项目中对数据收集和科学合作的贡献。

伦理声明

作者确认已遵守期刊作者指南页面上所述的伦理政策，并获得了适当的伦理审查委员会批准。该研究符合美国联邦保护人类受试者的政策。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向相应作者提出合理请求后获取。