利用水诱导的孔隙形成技术制备用于蛋白质分离的嵌段共聚物膜

《Journal of Membrane Science》：Water-induced pore generation to make block copolymer membranes for protein separations

　　

张若彤|刘龙强|王坤|周建梅|王勇

江苏省可持续性功能聚合物重点实验室，南京工业大学化学工程学院，南京211816，中国（江苏省）

摘要

嵌段共聚物（BCPs）作为制造能够精确分离分子量相近蛋白质的多孔膜的材料，已经引起了广泛关注。在各种制备方法中，选择性膨胀是一种优选的物理方法，可以灵活控制孔径大小，但其性能往往依赖于有机膨胀剂。在此，我们设计并合成了一系列聚（2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯）-嵌段-聚（羟基丙基甲基丙烯酸酯-共-苯乙烯）（PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）BCPs，这些BCPs能够通过水诱导的选择性膨胀形成相互连接的纳米孔。富含羟基的HPMA单元赋予P（HPMA-共-St）链亲水性，使得在温和的水性条件下能够生成孔洞。通过改变HPMA/St的比例和分子量，可以系统地调整膨胀行为和形成的孔结构。在最佳条件下，BCP薄膜能够形成尺寸可调且孔隙率高的均匀双连续纳米孔。用这种最佳BCP制备的复合膜对牛血清白蛋白（BSA）和虾血蓝蛋白（SHC）的分离选择性达到了63.2，对免疫球蛋白-γ（IgG）和SHC蛋白对的分离选择性达到了26.7。此外，混合蛋白质分离测试进一步证明了该膜在蛋白质分离应用中的巨大潜力。

引言

嵌段共聚物（BCPs）由两个或多个共价键合的均聚物链组成，每个链都具有不同的化学性质[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。这些不同链之间的热力学不相容性导致BCPs发生微相分离，形成特征尺寸通常在10到50纳米之间的精细有序纳米结构[6]、[7]。通过选择性地将分散相转化为孔洞，可以精确设计出高度均匀的多孔结构[8]、[9]。因此，基于BCP的膜通常具有规则的孔结构和狭窄的孔径分布，适用于超精确的分子分离，例如区分分子量相近的蛋白质[10]、[11]、[12]、[13]。邱等人[10]通过自组装与非溶剂诱导相分离（SNIPS）技术制备了聚苯乙烯-嵌段-聚（4-乙烯基吡啶）（PS-嵌段-P4VP）BCP超滤膜，这些膜对分子量仅相差2倍的牛血清白蛋白（BSA）和免疫球蛋白-γ（IgG）显示出显著不同的扩散速率。Shevate等人[11]将用聚（2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯）（PDMAEMA）功能化的氧化石墨烯纳米片嵌入聚苯乙烯-嵌段-聚（2-乙烯基吡啶）（PS-嵌段-P2VP）基质中，实现了高达33的分离效率。我们的团队[13]也验证了通过选择性膨胀方法制备的BCP膜的卓越蛋白质分级能力。与传统需要5-10倍或更大分子量差异才能有效分离蛋白质的超滤膜[6]、[10]、[14]相比，这些先进的基于BCP的膜能够精确分离分子量相差不到5倍的蛋白质，显示出在先进的双分子纯化应用中的巨大潜力[15]、[16]。

目前，BCP膜的制备主要依赖于SNIPS和选择性膨胀诱导的孔生成两种方法[17]、[18]。其中，选择性膨胀作为一种方便、高效且纯物理的方法脱颖而出，它避免了化学破坏，允许通过膨胀条件灵活控制孔径大小，并保持了固有的表面功能[9]、[19]。在选择膨胀剂时至关重要[20]。理想情况下，膨胀剂应对分散相的嵌段表现出高亲和力，同时对连续相仅产生适度的塑化作用[21]、[22]。因此，膨胀剂的选择必须根据组成嵌段的化学性质进行精确调整。例如，在PS-嵌段-P2VP的情况下，使用乙醇作为膨胀剂可以在较高温度（50～70°C）下获得有利的孔结构[21]、[23]、[24]、[25]。然而，对于PSF-嵌段-PEG，需要乙醇和丙酮的二元溶剂来促进膨胀[18]、[26]、[27]。迄今为止，已有许多BCPs被用于选择性膨胀方法来制备多孔膜[28]。虽然目前使用的膨胀剂都是有机溶剂，包括醇类和烷烃，但这些有机溶剂在使用过程中不可避免会产生挥发性有机化合物（VOCs），对环境和人类健康构成一定危害。有机溶剂的回收和纯化将进一步增加设备投资和能耗成本。此外，残留的微量有机溶剂也可能带来安全风险，不利于这些膜在生物医学分离领域的应用。

水是地球上最丰富的溶剂，具有成本效益和易获得性。与昂贵的有机溶剂相比，水可以大幅降低膜制备的成本，因此更适合大规模连续生产[28]。先前的研究报道，水已被用于诱导BCP薄胶束膜的膨胀，在其表面形成浅坑或纳米孔[29]、[30]。水还被用来膨胀基于BCP的超滤膜，以进一步调整其孔结构和分离性能[31]。然而，目前还没有研究报道将水作为膨胀剂来处理初始状态下密集的BCP薄膜，以创建用于制备分离膜的互连介孔结构。根本原因是目前使用的BCP的连续相对水几乎没有亲和力[5]、[20]、[32]、[33]、[34]。具体来说，当BCPs浸入水中时，分散相会膨胀并扩大体积，从而对连续相施加压缩应力。然而，连续相缺乏在水介质中发生塑性变形以形成多孔结构的能力。因此，通过水诱导膨胀制备多孔膜的新BCPs的合理设计和合成必须基于调整BCPs中主要嵌段的结构和物理化学性质。在这项工作中，苯乙烯（St）和羟基丙基甲基丙烯酸酯（HPMA）单体共聚得到P（HPMA-共-St）作为主要嵌段，而聚（2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯）（PDMAEMA）被选为次要嵌段，用于合成PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）BCP。HPMA结构单元中的羟基赋予共聚物一定的亲水性，使PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）能够在高温下通过选择性膨胀生成孔洞。系统研究了PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）的膨胀行为，结果表明HPMA/St的摩尔比和共聚物的分子量对其膨胀行为有显著影响。在最佳条件下，70°C下的酸性水溶液热处理得到了具有均匀且高度互连孔的BCP薄膜。随后评估了用PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）制备的复合膜在蛋白质分离方面的性能。

节摘

材料

DMAEMA（99%）和HPMA（97%）从Aladdin购买，St（>99%）由Energy Chemical提供。在实验使用前，所有上述单体均通过碱性氧化铝柱过滤去除抑制剂，然后储存在-20°C的冰箱中。2,2'-偶氮异丁腈（AIBN，98%）从Aladdin购买，并通过乙醇重结晶进一步纯化。2-氰基-2-丙基二硫苯甲酸酯（CPDB，>97%）和四氢呋喃（THF，≥99.9%）也已购买。

PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）的合成

PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）是通过两步RAFT聚合反应合成的。通过改变反应温度、反应时间和HPMA与苯乙烯的进料比例，制备了四批PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）。通过¹H NMR对合成的聚合物进行了化学结构表征。如图1a和1b所示，光谱中清晰地识别出了PDMAEMA和PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）的特征峰，证实了合成的成功。

结论

本研究将HPMA单元引入基于PS的BCP中，并通过RAFT聚合成功设计了新型共聚物PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）。合成的PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）能够通过水诱导的膨胀形成孔洞，从而克服了传统依赖有机溶剂的膨胀过程的局限性。系统研究表明，在最佳膨胀条件pH=4和70°C下，PDMAEMA-嵌段-P（HPMA-共-St）能够形成多孔结构。

CRediT作者贡献声明

刘龙强：验证、数据管理。王坤：验证、数据管理。周建梅：撰写-审稿与编辑、监督、方法学、资金获取、概念化。王勇：撰写-审稿与编辑、监督、资金获取。张若彤：撰写-初稿、研究、数据分析、数据管理

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

非常感谢国家自然科学基金（22438005、22478180）的财政支持。