酵母（Saccharomyces cerevisiae）对天然五环三萜类化合物马斯林酸（maslinic acid）的新颖微生物转化方法：气相色谱-质谱（GC-MS）分析及细胞毒性筛选

《Journal of Molecular Structure》：Novel microbial bioconversion of the natural pentacyclic triterpene, maslinic acid, by Saccharomyces cerevisiae, GC-MS analysis and cytotoxic screening

　　约斯拉·特拉贝尔西（Yosra Trabelsi）| 曼苏尔·兹纳蒂（Mansour Znati）| 希切姆·本·贾内特（Hichem Ben Jannet）| 贾卢尔·布阿吉拉（Jalloul Bouajila）
莫纳斯提尔大学，莫纳斯提尔科学学院，杂环化学、天然产物与反应性实验室（LCHPNR）-LR11ES39，环境大道5019号，莫纳斯提尔，突尼斯

**摘要**
马斯林酸（Maslinic acid，简称MA）是一种五环三萜类化合物，广泛存在于橄榄渣中——这是橄榄油生产的主要副产品——以及各种其他植物中。尽管它具有广泛的生物活性，但其治疗应用受到水溶性较差的限制。在本研究中，采用超声辅助提取法从橄榄渣中分离出了MA，并随后通过酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）对其进行了生物转化。经过衍生化处理后，利用气相色谱-质谱（GC-MS）技术对所得的三萜类组分进行了分析，初步鉴定出8种代谢物，其中3种在文献中已有报道。这些代谢物可能是通过氧化和羟基化等酶促反应生成的，这些反应可能会改变MA的理化性质（包括极性），从而影响其生物行为。与先前报道的三萜类化合物相比，检测到的代谢物显示出不同的碎片化模式，表明在所施加的生物转化条件下形成了结构改性的三萜类衍生物。

随后，评估了这些组分对结直肠癌细胞系LS174T和HCT116的细胞毒性。其中，F1组分表现出最显著的细胞毒性效应，其对HCT116的IC50值为25.7 μg/mL，表明其细胞毒性比原始化合物有所提高。观察到的活性可能与影响分子相互作用和细胞摄取的结构修饰有关，但不能排除组分内部协同效应的贡献。这些发现为利用酿酒酵母进行MA生物转化提供了初步的分析和生物学见解，支持了其在未来结构-活性关系研究中的重要性，并强调了微生物生物转化作为一种生成具有增强细胞毒性新型三萜类衍生物的有效策略。

**1. 引言**
萜类化合物是自然界中最大、最多样化的天然产物之一，在各种生物体中广泛存在。其中，特别是五环结构的三萜类化合物因其广泛的生物活性（包括抗糖尿病、抗菌、抗癌、抗病毒和抗炎作用）而受到广泛关注[[1], [2], [3]]。马斯林酸（MA；2,3-二羟基奥莱烷-12-烯-28-酸）是一种五环三萜类化合物，在欧橄榄（Olea europaea L.）及其他植物物种以及橄榄油生产产生的固体废物（橄榄渣）中含量丰富，其药理活性（如抗炎、心脏保护、抗糖尿病、抗菌和抗癌作用）已得到广泛研究[[4], [5], [6], [7], [8], [9]]。由于这些生物活性，开发MA衍生物以进行结构-活性关系（SAR）研究受到了广泛关注[[10]]。然而，MA的化学修饰主要限于其反应位点，限制了这类研究的范围。作为化学合成的替代方法，天然产物的微生物转化已成为生成新型且具有药用价值的代谢物的有前景策略[[11]]。为了获得难以化学合成的衍生物并便于进一步评估其生物活性，已使用不同微生物对MA进行了多种生物转化（见图1[[12]]。酵母，尤其是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），因其稳健性和对多种有机底物及溶剂的耐受性而被广泛用作生物催化剂[[13]]。这种微生物作为一种高效的全细胞催化剂，能够催化多种反应（包括氧化、还原、水解和脱氢），其立体选择性还原羰基和碳-碳双键的能力使其在三萜类生物转化中特别有价值[[14]]。因此，本研究首次尝试利用酿酒酵母对MA进行微生物生物转化。通过衍生化处理后，利用GC-MS技术分析了所得的三萜类组分，初步鉴定出8种代谢物，其中3种为首次报道[[15,16]]。随后，评估了这些组分对癌细胞HCT116和LS174T的细胞毒性。

**2. 结果与讨论**
**2.1. 生物转化过程**
酿酒酵母（S. cerevisiae）对MA的生物转化产生了一系列代谢物混合物。该混合物通过硅胶柱的闪蒸色谱法（流速：60 mL/min）进行分离，使用环己烷/乙酸乙酯梯度进行洗脱。起始洗脱液为80%环己烷和20%乙酸乙酯的混合物，保持5分钟后逐渐增加乙酸乙酯的比例至100%，再维持5分钟，从而回收了10%的初始底物（MA），得到了14个不同的组分（图2）。所有分离出的组分均通过薄层色谱（TLC）和气相色谱-质谱（GC-MS）进行分析，鉴定出10个非三萜类组分和4个含有特征三萜片段的三萜类组分：F1、F2、F3和F7。

**2.2. GC-MS碎片化模式的分析：逆Diels-Alder途径**
对GC-MS光谱中的碎片化模式进行了研究，特别关注逆Diels-Alder（rDA）途径。这一途径在三萜类及相关多环化合物的质谱碎片化中起着关键作用，提供了支持生物转化代谢物结构鉴定的关键离子[[15]]。硅基化化合物的质谱显示，由于三甲硅基化作用，-OH和-COOH基团产生了m/z 73的碎片（由离子化三甲硅烷[(CH3)3Si]+产生），以及与甲基丢失相关的碎片（m/z 15 amu）。O-硅基化衍生物会失去m/z 90 mu（TMSOH）和m/z 118 amu（HCOOTMS）的中性碎片，或m/z 89 [OTMS]+和m/z 117 [COOTMS]+的离子碎片。Budzikiewicz等人报告称，碎片化行为受12-13双键的存在影响[[17]]。根据Assimopoulou等人的研究[[18]]，所有含有12-不饱和奥莱烷骨架的三萜类化合物的主要质谱碎片化特征归因于环C上的rDA反应（图2），该反应产生m/z 262的离子（碎片f），这是三萜类甲酯的特征峰[[19]]。随后，离子f进一步碎片化产生碎片c（m/z 203）。此外，Isidorov指出，五环三萜类化合物（如三萜酸）的典型碎片为m/z 320（碎片b）[[20]]。此外，由于rDA作用在环E上的特异性断裂，会产生m/z 203、189和133的特征峰（分别为碎片c、e和d），这些是奥莱烷骨架的特征质量离子[[16]]，其中12-奥莱烷衍生物在rDA过程中通常在m/z 203处的峰强度更高[[21]]（图2）。这些三萜类片段的发现与文献中的数据一致[[13,25]]。

**2.3. 通过气相色谱-质谱（GC-MS）分析鉴定新的代谢物**
对生物转化提取物进行纯化后得到了4个三萜类组分（F1、F2、F3和F7）。通过对三萜类组分进行GC-MS分析并严格解读质谱数据，初步鉴定出8种新的生物转化代谢物（图3）。其中，F1（结构C、D和E）和F3（结构G）中的代谢物是首次报道的。不同三萜类组分中初步鉴定出的化合物的主要碎片离子（m/z）总结在表1中。

**表1. 从MA与S. cerevisiae共培养中获得的代谢物及其GC-MS分析后的特征碎片**

| 组分 | RT（分钟） | 建议的结构 | [M+][M-15]+[M-COOMe]+ | [M-HOTMS]+ | [M-HOOCTMS]+[M-TMS]+ | 其他碎片 | m/z |
|------------|-------------|-------------------|------------------|------------------|------------------|-----------------|----------------|
| F1 | 26.27 | A | 600 | 585 | 510 | 482 | 252 | 119/ 133 (d)/ 189 (e)/ 203 (c)/ 320 (b) |
| | 27.99 | B | 512 | 497 | 422 | 439 | 119/ 133 (d’)/ 189 (e’) /203 (c’)/ 232(b’)/ 276 |
| | 27.37 | C | 514 | 499 | 455 | 483 | 2---/133 (d)/ 189 (e)/ 203 (c)/ 262 (f)/ 207/ 251 |
| | 26.37 | D | 526 | 11-49 | 414 | 364 | 845 | 119/ 133 (d)/ 189 (e)/ 203 (c) /320 (b)/ 173 (j)/ 205 (k)/ 253 (l) |
| | 27.25 | E | 528 | 134 | 97 | 410 | 26.37 | 265 |
| | 526 | 11-49 | 414 | 364 | 845 | 119/ 133 (d)/ 189 (e)/ 203 (c) /320 (b)/ 208 (m) /173 |
| F2 | 29.69 | F | 542 | 283 | 444 | 498 | 545 | 2-47 | 119/ 133 (d)/ 189 (e) /201 (n)/ 246 (o)/ 277 (h) |
| | 27.93 | G | 600 | 583 | 4-510 | 422 | 499 | 7-52 | 119/ 133 (d)/ 189 (e)/ 191/ 219/ 234 (p)/ 263 (r)/ 261/ 345/ 360/ 368 (q)/ 396 |
| F7 | 29.36 | H | 468 | 454 | 108 | 436 | 119/ 133 (d)/ 163/ 187/ 189 (e)/ 203 (c)/ 246 (f)/ 281/ 396/ 410 | | |

**注：**
- 下标粗体字母表示特征性三萜片段：
1. [M- HOMe]+
2. [M- OMe]+
3. [M-Me?+?H]+
4. [M-Me-2?×?H]+
5. [M-COOH]+
6. [M-2?×?OTMS]+
7. [M-CH2OTMS?+?2?×?H]+
8. [M-COOMe+ H]+

据我们所知，三萜类化合物的鉴定通常通过气相色谱-火焰离子化（GC-FID）或质谱检测（GC-MS）进行[[22,23]]，后者总是更适用于鉴定目的。由于三萜类化合物的挥发性和分子量较高，因此在气相色谱分析前必须进行衍生化处理[[25,26]]。三萜类的衍生化通常采用硅基化方法，这是一个繁琐的过程[[25,26]]。因此，通过对三萜类组分进行三甲硅基化（使用BSTFA作为衍生化步骤）后，利用GC-MS对其化学谱进行了表征[[25]]。MA的色谱图（RT= 27.95，图3）作为参考标准，用于比较新生成化合物的保留时间（RT），从而了解其相对分子量和极性。通过将新生成化合物的色谱图与MA的色谱图进行比对，利用它们之间的结构相似性完成了这些新峰及其对应片段的鉴定[[24]]。

**图3. 五环三萜类化合物MA的GC-MS色谱图**
如图3所示，MA的保留时间（RT）为27.95分钟。然而，F1组分的色谱图（图4）显示了多个具有不同RT的峰（1、2和3）。本研究重点关注三萜类组分。先前研究（特别是Vilkickyte等人的工作[[27]]已经确定了三萜类的RT，证实了它们的独特性质。

**图4. 衍生化后F1组分的三萜类区域的总离子色谱图（TIC）示例**
值得注意的是，阴性对照样品（不含MA）的色谱图（图5）未检测到三萜类片段；该样品主要由脂肪酸组成。这些发现表明，改性三萜类的出现是MA生物转化的直接结果，这一点通过组分与阴性对照的比较分析得到了证实。

**图5. 阴性对照样品的总离子色谱图（TIC）**
如图4所示，在F1组分中检测到多个特征峰，分别位于RT（分钟）27.25（峰1）、27.37（峰2）和27.99（峰3）。这些保留时间处的特征碎片表明可能产生了三萜类衍生物。因此，对F1组分的进一步研究表明，它是三萜类最丰富的组分，含有5种生物转化产物。实际上，根据文献数据，我们确认了在RT 26.27分钟处检测到了三甲硅基化的奥莱酸（A）（图6），其特征峰位于m/z 585、482、203和189[[28]]；三甲硅基化的乌索酸醛（B）（M+=512）也出现在RT 27.99分钟（图6）；MA-3-甲基化衍生物（C）在RT 27.37分钟被检测到（M+=514），其特征峰位于m/z 189、203和262（图6），这是从MA衍生的新生物转化产物。经过衍生化处理后，分离出的F1组分中初步鉴定的化合物A、B和C的质谱（M+分别为600、512和514）。此外，在F1组分中还发现了两种新鉴定的结构D（图7）和E（图8），对应的质谱分别在RT 26.37分钟和27.25分钟处出现。基于RT 26.37分钟处的质谱分析（图7），新形成的化合物被鉴定为“D”分子（M+ = 526）。实际上，D的GC-MS谱显示特征性碎片离子m/z 320、203、189和133（分别为碎片b、c、d和e），这些碎片离子表明它是12-oleanane衍生物[19]。观察到的m/z 511处的碎片离子对应于一个甲基的丢失[M-CH3]+。另外，m/z 408处的碎片离子对应于中性羧基TMSOOCH的丢失[M-118]。m/z 205处的碎片离子的存在表明C-4位置存在甲氧基，以及C2-C3之间的π键。而在RT 27.25分钟处出现的化合物（图8）更可能属于结构“E”（M+ = 528），因为其MS谱显示了与结构D相同的特征性三萜碎片m/z 320、203、189和133。尽管如此，m/z 208处的碎片离子的存在支持了C-4位置存在甲氧基以及C2-C3之间π键的减少。

在F2组分中，保留时间（RT）为29.69分钟时（图9）的分析表明形成了化合物F（M+ = 542），因为主要碎片离子m/z 201和246分别指示了碎片n和o的存在。此外，m/z 498处的碎片离子对应于中性羧基COOH的丢失[M-44]。m/z 524处出现的离子对应于H2O的丢失[M-18]。m/z 452处的碎片离子表明中性硅基羟基HOTMS的丢失[M-90]。m/z 295和m/z 277处的离子分别表明存在C2-C3双取代的[ABC*] ABC*-环（*根据Burnouf-Radosevich等人的命名法，仅表示C环的一部分）和[ABC*-OH]碎片（h），这表明三萜部分的C2和C3位置存在羟基。这些三萜碎片的存在与Avila等人的研究结果一致[15]。观察到的m/z 263处的碎片离子对应于碎片h中甲基的丢失[h-15]+。

进一步地，F3组分在RT（分钟）27.93时的GC-MS谱分析（图10）表明存在结构G（M+ = 600）。实际上，oleanane衍生物在C-12位置引入酮基后，形成了一个显著的碎片离子m/z 234（p）。这种碎片化可以通过烯醇互变异构体的rDA裂解来解释，从而形成离子p，这与Assimopoulou等人的研究结果一致[18]。此外，m/z 368处的离子（碎片q）表明C-2羟基被硅基化（OTMS），并且C-23处发生了功能化（羟基化），形成了硅基团（CH2OTMS）。

F7组分在RT（分钟）27.93时的GC-MS谱分析表明存在甲基oleanonate（12-oleanene）衍生物（提议的结构H，M+ = 468，图11）。根据Assimpoulou等人的研究，碎片b进一步裂解产生物种c（m/z 203）。因此，在甲基oleanonate的碎片f中，m/z 262对应于m/z 262[19]。此外，在m/z 281、410、163、424处观察到的额外碎片离子与Assimpoulou等人的光谱数据一致，从而证实了结构H是MA生物转化产生的新产物。

2.4. 提出了S. cerevisiae对maslinic acid（MA）的生物转化途径。初步鉴定的代谢物（A-H）的形成是通过可能的酶促反应解释的，包括氧化、还原、脱羟基和组合转化[[30], [31], [32], [33]]。所提出的途径基于GC-MS数据。

2.5. 细胞毒性的评估为了评估从MA生物转化中获得的次级代谢物的细胞毒性，我们研究了它们的细胞毒性潜力。这项研究受到了先前报道的启发，这些报道强调了三萜及其类似物对多种细胞系（特别是HCT116和LS174T（结肠癌）的细胞毒性[34]。因此，将MA及其生物转化组分F1、F2、F3和F7在这些细胞系上进行了测试。细胞毒性通过MTT测定法进行评估，该方法基于代谢活跃细胞的线粒体完整性和琥珀酸脱氢酶活性来评估细胞活力。为了评估生物转化组分的细胞毒性效果，确定了表现出抑制百分比（IP）远高于50%的化合物的半数抑制浓度（IC50）值。在两种浓度（50和5 μg/mL）下评估了测试组分的IP，结果总结在表2中。

表2. 由S. cerevisiae生物转化得到的F1、F2、F3和F7组分的细胞毒性。

真菌对MA的转化产生了对两种癌细胞系LS174T和HCT116具有显著细胞毒性的组分。如表2中的IP所示，在大多数情况下，从生物转化中获得的三萜组分显示出比母体三萜MA更强的抑制活性。观察到的细胞毒性反映了复杂混合物的总体效应，这可能是由于组分中存在的多种成分之间的组合或潜在协同作用。值得注意的是，在这两种浓度下（50和5 μg/mL），这些组分对LS174T表现出有希望的细胞毒性（IP值）。因此，进一步纯化可能会发现IC50值显著的化合物，甚至可能低于5 μg/mL。在测试的组分中，F1对LS174T和HCT116细胞系表现出最明显的细胞毒性效应，IP值分别为82.8%和67.1%（IC50= 25.7 μg/mL），与母体酸的相应值（65.9%和36.2%）相比相对适中。这种活性可能归因于F1中存在的大量三萜衍生物的结构多样性和丰富性[35]。此外，在F7组分中，C-3羟基氧化为羰基（3-one），同时C-2的羟基被还原，羧基功能转化为甲酯（C-28-COOMe），产生了不同的谱型：对LS174T的IP值为73.4%（高于MA），但对HCT116的IP值仅为40.8%。这表明羧酸转化为酯类会根据细胞系的不同选择性地调节效果。与此一致的是，其他研究表明，在C-28处进行酯化并在C-12引入羰基可以改善三萜酸的抗肿瘤特性[36,37]。此外，F2与MA的不同之处在于C-19和C-20处的取代基发生了重排，同时保留了羟基和羧基功能，使其在结构上与ursane型衍生物有一定的相似性。这种修饰导致了对HCT116的活性为45.5%，略高于MA在该细胞系上的活性，但对LS174T没有活性。这些发现表明C-19/C-20处的重排会影响细胞识别并导致选择性的差异[38]。最后，在F3组分中观察到C-3处的羟基转化为酮基，导致活性显著降低，对LS174T的活性仅为48.4%，对HCT116的活性仅为24.8%，均显著低于MA。我们的结果与先前的研究一致，这些研究表明在C-12引入酮基或在C-23引入羟基（CH2OH）可以影响三萜酸的抗肿瘤活性[39,40]。F1中保留的羟基和羧基有利于在两种细胞系上的强活性。相比之下，C-3处的氧化（F3和F7）降低了活性，而在C-28处的酯化根据细胞系的不同产生了选择性的调节。值得注意的是，骨架替换（F6）提供了高效力，但仅限于LS174T。

3. 结论本研究首次报道了S. cerevisiae对天然MA的微生物转化。对三萜组分进行了GC-MS分析，经过衍生化后鉴定了八种三萜A-H，其中四种以前未报道过。值得强调的是S. cerevisiae的显著潜力，它能够对这种三萜的A、C和E环进行各种靶向功能化。具体来说，这种微生物能够在非活化位置进行氧化反应，在C-2和C-3进行O-甲基化，在C-28进行氧化或甲酯化，还原C-2和C-3的仲醇，以及还原C12-C13双键。此外，MA对LS174T和HCT116癌细胞的细胞毒性在孵育后相对增强。在所有测试的组分中，F1在两种细胞系上表现出最明显的细胞毒性。这些发现激发了进一步研究以分离出负责其生物活性的特定分子。此外，还将对非肿瘤（正常）细胞进行细胞毒性测试，以探索组分的選擇性和潜在的治疗窗口以及分离出的化合物。

4. 实验
4.1. 一般实验程序
所有使用的化学品均为分析纯度。所有试剂均来自Sigma Aldrich（法国Saint-Quentin）。所使用的溶剂均通过标准方法干燥和纯化。所得到的生物转化提取物通过硅胶柱闪蒸色谱法进行纯化（流速：60 mL/min；最大压力：275 psi（19 bar）/400 mg-8 g/silica gel SDS 60）。流动相为环己烷/EtOAc梯度模式。面包酵母Saccharomyces cerevisiae购自法国跨国零售集团Auchan-Toulouse的面包店。

4.2. 原料（MA）的分离
为了从橄榄果渣（O. europaea L.）品种Sidi Abed-Lahmid中分离MA，采用了Chouaib等人[41]之前概述的固液提取和超声技术相结合的方法。所采用的提取方法既经济又具有选择性，获得了8.81克（2.93 mg/g DW）的MA。

4.3. 使用Saccharomyces cerevisiae进行MA的生物转化
将10.5克面包酵母（S. cerevisiae）和12.5克蔗糖加入两个Erlenmeyer烧瓶中并搅拌。随后加入每份Erlenmeyer烧瓶0.5克溶解在乙醇（100 mL）中的MA。然后在黑暗中于28°C下搅拌15天以进行发酵（pH= 3.3）。解决方案通过铝箔[42]来防止光照。生物转化的进展每48小时监测一次，方法是将样品提取出来，用乙酸乙酯处理，然后在Na2SO4上干燥，并使用薄层色谱法（TLC）进行分析。15天后，用乙酸乙酯（3×500 mL）提取整个反应混合物。随后向有机相中加入无水硫酸钠，然后过滤并在减压条件下使用真空旋转蒸发器蒸发至干。粗提取物再用闪蒸色谱法进行分离，洗脱梯度为环己烷和乙酸乙酯。共得到了14个组分，并通过GC-MS进行了分析。还按照既定的生物转化协议进行了空白对照实验（标记为“阴性测试”，未添加MA），除了不添加MA之外。进行这个对照实验是为了识别在分析过程中可能从酵母中产生的化合物。

4.4. 气相色谱-质谱（GC-MS）分析
从生物转化过程和阴性测试提取物中获得的组分的组成分析遵循Chammam等人[43]描述的方法，并进行了修改。将各组分以5 mg/mL的浓度溶解在相应的溶剂中（生物转化组分使用乙酸乙酯，阴性测试提取物使用乙腈）。分析使用的是Saturn 2000气相色谱仪（Les Ulis，法国），配备有熔融石英毛细管柱DB-5MS（5%苯甲基聚硅氧烷；30 m × 0.25 mm；膜厚度：0.25 μm）。每个样品的进样量为5 μL，数据采集在50-90 amu的质量范围内进行全扫描。载气为氢气，流速恒定为1.2 mL/min。进样方式为不分流模式。电离方式采用电子撞击（EI），能量为70 eV。离子源温度保持在300°C，传输线温度设定为250°C。烤箱温度程序如下：初始温度60°C（保持1分钟），以10°C/min的速度升高至150°C（保持1分钟），然后以12°C/min的速度升高至260°C，最后在260°C下保持10分钟。总分析时间为30分钟。

衍生化方法：衍生化过程包括取290 μL上述制备的样品，加入60 μL N,O-双(三甲硅基)三氟乙酰胺（BSTFA）试剂。然后将此混合物在40°C下孵育30分钟。随后对每个衍生化溶液进行光谱分析，步骤与前一节所述相同。衍生化是分析化学中的关键技术，用于提高灵敏度和准确性，尤其是在GC和GC-MS中。它涉及用特定化学物质修饰分析物或样品，以增强其分离和检测能力。这一过程选择性地改变分析物而不显著影响样品基质。例如，衍生化会替换功能基团（如OH、COOH、SH、NH和CONH）中的活性氢（通常是极性和非挥发性的）。这种修饰使这些化合物更具挥发性，这对于通过GC或GC-MS进行准确分析和鉴定至关重要[44]。

4.5. 细胞毒性活性
评估了MA生物转化所得不同组分的细胞毒性，针对两种癌细胞系：LS174T（人类结肠腺癌）和HCT116（人类结肠癌）。所有用于本研究的细胞系均来自美国类型培养物库（ATCC，Manassas，VA，USA）。LS174T细胞在含有高葡萄糖的DMEM培养基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，Thermo Fisher Scientific，法国）中培养，而HCT116细胞则在RPMI培养基（RPMI 1640，Thermo Fisher Scientific，Illkirch，法国）中培养。每种培养基中添加了1%的非必需氨基酸、胎牛血清（10%）以及抗生素组合（包括链霉素、庆大霉素和青霉素）。细胞在37°C下、含有5%二氧化碳（CO2）的潮湿培养箱中培养。当细胞达到70-80%的汇合度时，进行细胞毒性测定。在这些测定中，每个96孔微孔板的孔中接种12,000个LS174T和HCT116细胞。在含有5% CO2的潮湿环境中，微孔板在37°C下孵育过夜。随后，细胞以100 μM的浓度与每种稀释化合物处理三次，并在37°C下孵育两天。细胞毒性评估使用MTT测定法，方法如Trabelsi等人[45]所述。去除上清液后，向细胞中加入50 μL MTT溶液，然后在37°C下孵育40分钟。孵育结束后，移除MTT溶液，通过线粒体脱氢酶将黄色的MTT还原形成的深蓝色甲酚兰晶体用DMSO（80 μL）溶解。使用Mullikan Go微孔板读数器（F1-01620，Thermo Fisher Scientific，Vantaa，芬兰）在605 nm处测量吸光度。在本测定中，使用浓度为37.1和3.71 μg/mL的他莫昔芬作为参考化合物。

**CRediT作者贡献声明**
Yosra Trabelsi：负责实际操作、撰写原始稿件、进行正式分析。
Mansour Znati：负责审阅和编辑、验证、监督、项目管理和概念构思。
Hichem Ben Jannet：负责审阅和编辑、验证、监督、项目管理和方法学研究、资金筹集。
Jalloul Bouajila：负责审阅和编辑、验证、监督、项目管理和方法学研究、资金筹集、概念构思。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。