Identification and Characterisation of the Gene Cluster Governing Biosynthesis of the Anti-Mycobacterial Antibiotic Acidomycin

《Microbial Biotechnology》：Identification and Characterisation of the Gene Cluster Governing Biosynthesis of the Anti-Mycobacterial Antibiotic Acidomycin

　　

酸霉素是一种具有独特作用机制的抗分枝杆菌抗生素，靶向生物素（biotin）生物合成途径。尽管其在体外对分枝杆菌表现出高度活性，但由于药代动力学特性欠佳，其作为抗结核药物的开发一直受阻。对酸霉素生物合成进行工程化改造可能会产生具有改善药理特性的新型类似物。在此，研究人员描述了从雪绒花根际分离的链霉菌属（Streptomyces）细菌中酸霉素生物合成基因簇（BGC）的鉴定。值得注意的是，酸霉素BGC与链霉亲和素（stravidins）的生物合成基因相邻，后者是靶向生物素生物合成途径中另一酶的次级代谢产物，同时还与两个编码链霉亲和素（streptavidins）的基因相邻，这些蛋白可强力结合并隔离生物素。通过基因敲除和异源表达证实了酸霉素BGC的身份，这表明形成酸霉素酰基链所需的脂肪酸很可能是从生物素生物合成途径中“掠夺”（scavenged）而来的。利用CRISPR/Cas9辅助敲除酸霉素BGC中的细胞色素P450编码基因导致酸霉素产量显著下降，但并未完全中止生物合成。

论文解读：抗分枝杆菌抗生素酸霉素生物合成基因簇的鉴定与功能分析

研究背景与立项依据

结核病（Tuberculosis, TB）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起，每年导致数百万人患病且耐药性问题日益严峻，亟需新型抗分枝杆菌药物。酸霉素（acidomycin）作为一种发现于“抗生素黄金时代”的噻唑烷酮类化合物，通过抑制生物素合酶BioB阻断生物素合成，从而在体外高效抑制分枝杆菌生长。然而，由于其半衰期极短等药代动力学缺陷，酸霉素未能被开发为临床药物。随着天然产物生物合成与工程化技术的进步，重新审视此类“被遗忘”的抗生素并改良其理化性质成为可能。本研究旨在鉴定酸霉素的生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Cluster, BGC），解析其生物合成逻辑，为后续通过代谢工程手段优化其药代动力学特性奠定基础。

关键技术方法概述

研究人员从雪绒花（Leontopodium nivale subsp. alpinum）根际分离得到一株链霉菌（Streptomyces sp. RLA021）。首先通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析其次级代谢组，并结合核磁共振（NMR）波谱学技术对化合物进行结构确证。随后利用antiSMASH基因组挖掘工具预测候选BGC，并通过构建同源重组敲除载体及利用CRISPR-cBEST碱基编辑系统对特定基因进行失活验证。此外，研究构建了RLA021基因组的fosmid文库，利用酵母同源重组系统将目标BGC克隆至穿梭载体pYES中，并在变铅青链霉菌（Streptomyces coelicolor）M1154和白色链霉菌（Streptomyces albus）Del14中实现异源表达。

研究结果

3.1 酸霉素生物合成基因簇的鉴定

研究人员通过对RLA021菌株的基因组分析，锁定了一个杂合的I型聚酮合酶-非核糖体肽合成酶（PKS I-NRPS）基因簇BGC2.28。通过分别敲除其中的NRPS编码基因（ctg2_6433）和PKS I编码基因（ctg2_6439）发现，NRPS基因的破坏导致酸霉素生产完全中止，证实了其必要性；而PKS I基因的失活并未影响产量。这一结果表明，酸霉素脂肪族羧酸侧链的前体并非由BGC编码的PKS从头合成，而是很可能从初级代谢（特别是生物素合成途径）中摄取。

3.2 酸霉素生物合成基因簇的克隆、异源表达与操控

为了在无背景干扰的宿主中研究该途径，研究人员将包含BGC2.28的31 kb片段克隆至pYES载体，并成功在S. coelicolor M1154和S. albus Del14中实现异源表达，证实了该BGC的完整性。针对细胞色素P450编码基因（ctg2_6435）的CRISPR/Cas9敲除实验显示，突变株中酸霉素产量显著降低但未消失，且检测到了疑似中间体的峰，提示该P450酶可能参与噻唑啉环氧化脱羧生成噻唑烷酮环的最后步骤，但并非绝对必需。

3.3 链霉亲和素生物合成基因簇与酸霉素BGC共定位

比较基因组学分析揭示，在RLA021和S. virginiae NRRL ISP-5094中，酸霉素BGC与链霉亲和素（stravidins）的BGC在基因组上紧密相邻。链霉亲和素靶向生物素合成途径中的另一个关键酶BioA。LC-MS分析证实了RLA021同时产生酸霉素和链霉亲和素S4、S5。进一步的全基因组筛查发现，仅在少数放线菌中同时存在这两个BGC，表明这是一种罕见的针对单一必需辅因子（生物素）不同合成步骤的协同化学防御策略。

讨论与结论

本研究首次通过实验验证了酸霉素生物合成基因簇的身份，并阐明了其生物合成逻辑。核心结论指出，酸霉素的生物合成依赖于NRPS系统，而其独特的脂肪酰侧链前体来源于宿主的生物素代谢流，而非BGC自身编码的PKS。这种代谢“交叉对话”与其作为生物素抗代谢物的作用模式相吻合。

异源表达体系的建立为克服酸霉素原有的药代动力学缺陷提供了理想的工程化平台。研究发现，酸霉素BGC与链霉亲和素BGC在基因组上的共定位，使得同一菌株能产生两种靶向生物素合成不同步骤的抑制剂。这种双重抑制策略在土壤环境中对抗分枝杆菌时可能赋予链霉菌显著的竞争优势，因为单一靶点的逃逸突变难以同时对两种不同机制的抑制剂产生抗性。这项工作不仅确立了酸霉素生物合成的遗传基础，也为开发下一代抗分枝杆菌药物先导化合物开辟了新的途径。该研究发表于《Microbial Biotechnology》。