环境DNA宏条形码技术揭示了越南Con Dao群岛沿海生态系统中隐藏的鱼类多样性以及显著的栖息地分化现象 作者：Hung Manh Pham、Jacques Panfili、Huy Duc Hoang、Monique Simier、Masaki Miya和Jean-Dominique Durand

《Diversity》：Environmental DNA Metabarcoding Reveals Hidden Fish Diversity and Strong Habitat Partitioning Across Coastal Ecosystems in the Con Dao Archipelago, Vietnam Hung Manh Pham, Jacques Panfili, Huy Duc Hoang, Monique Simier, Masaki Miya and Jean-Dominique Durand

　　摘要：康岛群岛拥有越南最古老的海洋保护区（MPA），并被认定为区域性的海洋生物多样性热点。本研究应用环境DNA（eDNA）宏条形码技术，评估了康岛群岛四种主要栖息地类型的沿海鱼类多样性：珊瑚礁、海草床、红树林和港口区域。通过使用MiFish-U 12S引物在八个采样点进行检测，共发现282个操作分类单元（OTUs），对应144种鱼类。鱼类群落表现出明显的栖息地结构特征：不同栖息地间的群落组成存在显著差异，且重叠度极低。仅有三种鱼类在所有栖息地中均被检测到。多变量分析表明，栖息地类型而非站点间的空间距离是导致群落差异的主要因素。红树林和海草床支持的鱼类群落与现有物种名录和MPA管理框架中的描述存在差异，尤其是某些隐秘或非商业价值的物种。这些结果显著扩展了人们对康岛群岛鱼类多样性的认识，并强调了在MPA设计和监测中纳入栖息地异质性（尤其是非珊瑚礁生态系统）的必要性。尽管eDNA宏条形码技术存在扩增偏差和参考数据库中的分类分辨率限制，但它为描述采样不足的栖息地提供了有力的补充方法。

1. 引言
全球海洋生物多样性正以前所未有的速度下降，主要原因是过度捕捞、栖息地退化、沿海开发以及气候变化[1,2]。为应对这一问题，海洋保护区（MPAs）作为关键的保护策略得到越来越多的应用，旨在减缓生物多样性的丧失、增强生态系统的恢复力，并通过增加鱼类数量、恢复体型结构和提高繁殖潜力来促进被过度捕捞的鱼类种群的恢复[3,4]。设计合理且管理有效的MPAs在提高物种丰富度、生物量和营养复杂性方面显示出明显的好处，尤其是在涵盖多种栖息地并确保它们之间生态连通性的情况下[5,6]。

康岛群岛位于越南南部，拥有该国最古老的海洋保护区，该保护区成立于1984年。其主要目的是保护受威胁的标志性大型动物，包括儒艮（Dugong dugong）、江豚（Neophocaena phocaenoides）和绿海龟（Chelonia mydas）。由于海草床是儒艮的重要觅食场所，因此保护工作主要集中在少数几个海草斑块上。这一栖息地也是众多海洋鱼类的关键育苗场，包括当地渔业捕捞的目标物种，支持极高的鱼类密度[7,8,9]。然而，尽管这些栖息地在生态和渔业上具有重要意义，但在MPA的管理框架内并未对鱼类种群进行监管和监测，大多数栖息地仍允许捕鱼活动[10]。因此，深入了解康岛群岛的鱼类多样性对于管理工作至关重要，但目前的相关知识仍然非常有限。以往的研究主要基于水下视觉调查和渔业观察，记录了来自珊瑚礁栖息地的273种鱼类，属于100个属和39个科[11,12]。鉴于越南沿海已记录超过1500种海洋鱼类[13,14,15,16,17]，现有的康岛群岛鱼类名录几乎可以肯定是不完整的。此外，尽管报道了一些具有商业价值的鱼类科（如Serranidae、Lutjanidae、Nemipteridae、Haemulidae、Scaridae和Siganidae），但在康岛群岛记录的物种丰富度与其在全国范围内的多样性相比显得偏低[18,19]。

传统上，越南当地鱼类多样性的了解主要依赖于对渔民捕获的成年鱼类的形态学鉴定。虽然这种方法提供了关于被捕捞鱼类的宝贵信息，但它未能充分反映隐秘、稀有、夜间活动或非商业价值的物种，并且偏向于易于捕捞工具进入的栖息地。近年来，通过收集和DNA条形码分析幼鱼和后幼鱼（尤其是与珊瑚礁相关的物种），全球范围内的鱼类多样性研究得到了扩展[20,21,22,23]。基于早期生命阶段的调查不仅提高了生物多样性评估的准确性，还揭示了栖息地的生态功能（如其作为育苗场的作用）。鱼类幼体通常是浮游的且数量丰富，这使得某些物种在这个阶段更容易被采集[24]。Pham等人[25,26,27]首次利用光陷阱结合DNA条形码技术对康岛群岛的鱼类多样性进行了基于DNA的评估，发现了163个物种，其中包括许多新的记录。尽管这些研究显著推进了当地鱼类多样性和补充动态的了解，但它们主要关注早期生命阶段和季节性模式，未能涵盖所有成年鱼类和特定栖息地的群落。与传统捕捞方法类似，这些基于DNA的方法仍然局限于通过采样工具物理捕获的生物。最近，环境DNA（eDNA）宏条形码技术作为一种革命性的、非侵入性的生物多样性评估方法出现，能够直接从水样中检测鱼类群落[28,29,30,31,32]。在海洋生态系统中，eDNA调查在揭示与栖息地相关的鱼类群落、检测稀有或难以发现的物种以及快速生成全面的生物多样性名录方面显示出巨大潜力，且采样工作量较小[33,34]。与传统捕捞方法不同，eDNA受采样工具选择性和观察者偏差的影响较小，特别适合评估异质性沿海栖息地中的鱼类多样性。然而，eDNA快照主要反映的是短时间尺度上的物种存在情况，对补充过程和季节性动态的信息有限。因此，将eDNA宏条形码技术与光陷阱调查相结合，为填补这一知识空白提供了强有力的补充框架。

基于以往的传统和基于DNA的调查，本研究旨在通过应用eDNA宏条形码技术于多种沿海栖息地，并将其结果与同一地点使用光陷阱评估的生物多样性结果进行直接比较，以探索和扩展康岛群岛已知的海洋鱼类多样性[26]。具体目标包括：(i) 评估康岛群岛内珊瑚礁、海草床、红树林和港口区域中通过eDNA检测到的鱼类物种丰富度和群落组成；(ii) 发现早期传统或基于幼鱼的调查未能捕捉到的鱼类多样性成分。通过强调eDNA宏条形码技术和幼鱼采样之间的互补性，本研究为改进生物多样性名录提供了关键见解，并强调了在热带沿海系统的未来MPA设计和管理中纳入栖息地多样性和连通性的必要性。

2. 材料与方法
2.1 研究区域和采样设计
采样在越南康岛群岛的Con Son Bay进行，涵盖了三种主要的沿海栖息地类型以及一种受人类活动影响的栖息地。选择了八个采样点，包括三个海草床（SG1：8°41′22.11″ N, 106°37′48.31″ E；SG2：8°41′34.64″ N, 106°38′27.47″ E；SG3：8°41′44.33″ N, 106°38′32.89″ E）、两个珊瑚礁站点（CR1：8°39′58.3″ N, 106°40′57.6″ E；CR2：8°40′09.2″ N, 106°39′51.0″ E）、两个红树林站点（M1：8°40′12.0″ N, 106°40′53.2″ E；M2：8°38′49.3″ N, 106°33′13.2″ E）以及一个港口站点（H1：8°40′38.8″ N, 106°36′26.5″ E）。这些站点代表了康岛海洋保护区内的主要沿海栖息地（图1）。采样时间为2017年11月14日至15日。每个站点采集了两个水样副本，共获得16个样本。

2.2 水样采集与过滤
水样在原位使用Sterivex?过滤器（Merck KgaA，德国达姆施塔特）（孔径0.22 μm）和Vampire采样泵（BurkleTM，德国巴特贝林根）进行采集和过滤。每个采样点都遵循标准化的五步去污和采样程序：
- 泵和管路用稀释的漂白剂消毒20秒，然后用环境海水冲洗30秒；
- 采样桶也用稀释的漂白剂消毒20秒，然后用环境海水彻底冲洗；
- 在大约2米深度处采集环境水样并倒入采样桶中；
- 每个样本大约过滤5升水；
- 根据水的浑浊程度，可能需要2到5个Sterivex过滤器来处理每个样本；
- 过滤后，通过向Sterivex过滤器中通入空气去除残留水分；
- 每个过滤器填充RNAlater?（QIAGEN，德国希伦），用无菌盖子密封，标记后储存在-20°C条件下直至分析。

2.3 DNA提取、扩增和测序
DNA实验在Masaki Miya的实验室进行。环境DNA使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒（Qiagen，德国希伦）从过滤器卡盒中提取，方法依据Miya等人[35]建立并稍作修改。离心后丢弃收集管，并使用QIAvac 24 Plus吸液器（Qiagen，德国希伦）清除卡盒中的残留液体。然后使用蛋白酶K进行裂解。裂解前，将PBS（220 μL）、蛋白酶K（20 μL）和缓冲液AL（200 μL）混合，轻轻将混合液从过滤器卡盒的入口端口注入。DNA提取量约为900 μL，使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒完成提取，最终洗脱体积为200 μL。提取过程进行了一轮。另外准备了一份用于检测污染的空白对照样本（EB）。所有DNA提取物在-20°C下冷冻直至库准备阶段。提取的DNA进一步使用PowerClean Pro DNA Clean-Up Kit（MO BIO Laboratories，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德；现属QiAGEN，德国希伦）进行纯化，以去除PCR抑制剂。

2.4 生物信息学和分类学鉴定
原始序列数据通过定制的内部生物信息学流程进行处理，包括质量过滤、操作分类单元（OTU）聚类和分类学鉴定。eDNA宏条形码分析使用MiFish assay[28]进行。每个OTU的分类学鉴定基于三种方法的共识：
(i) 与CDA鱼类参考数据库[12,25,26,27]的序列相似性搜索；
(ii) 与NCBI核苷酸（nt）数据库（GenBank）的序列相似性搜索；
(iii) PROTAX，一种提供物种、属、科和目级别分类的概率分类方法[36]。当参考匹配度达到≥98.5%（物种级别）和≥95%（属级别）时，自动接受物种和属级别的分类。当多个物种的匹配度相等时，会查阅全球生物多样性信息设施（GBIF）的记录，以确定最可能出现在印度-太平洋地区的分类单元，从而将一些模糊的OTU解析到物种级别。

2.5 数据分析
所有统计分析使用R版本4.4.3[37]进行。数据分析通过构建一个表格来汇总八个采样点观察到的所有分类单元的读数数量来完成。使用累积曲线评估采样充分性，该曲线通过绘制新观察到的分类单元数量与采样点数量的关系来表示。对于每个分类单元，计算全球范围内的读数数量以及四个栖息地各自的读数数量作为其丰度的代理指标。使用“vegan”R包计算了四个栖息地的α多样性指数（丰富度、香农多样性和Pielou均匀度）。使用VennDiagram R包v. 1.8.2[38]构建了四个栖息地共有的分类单元数量的关系图。使用ade4包v. 1.7-24[39]中的dudi.coa函数对每个采样点和分类单元的读数计数进行了对应分析（CA）。这些地点和分类单元随后基于沿前两个CA轴计算的欧几里得距离进行了层次聚类，使用stats包v. 4.6.0中的hclust函数应用了完全链接聚合方法[37]。3. 结果 3.1. 整体eDNA鱼类多样性经过严格的过滤和质量控制后，共获得了458,879个12S rRNA基因的读段。其中，435,854个读段（95%）根据≥98.5%的物种水平相似性阈值成功与存档的参考序列匹配。环境DNA宏条形码分析在Con Son Bay的八个采样点中揭示了总共282个操作分类单元（OTUs），对应于246个在≥98.5%序列相似性下被可靠识别的分类单元和36个置信度较低的分类单元（<98.5%）（表S1）。在合并重复检测和模糊匹配后，数据集包含了144个用于下游群落分析的不同鱼类分类单元。全球物种积累曲线没有达到渐近线（图2），表明采样努力（n = 8）仅捕获了部分当地鱼类多样性。图2. 基于Con Dao群岛所有环境DNA采样点的物种积累曲线（±SD，虚线）。3.2. 分类组成和优势物种前十种最丰富的物种占总读段的很大比例（59.8%），其中最丰富的是大鳞鲻鱼Planiliza macrolepis（10.9%）、长吻鲈鱼Photolateralis stercorarius（7.8%）和红鳍鲷鱼Lutjanus fulviflamma（7.1%）（图3）。相对丰度模式在不同生境中有所不同（图4）。海草生境主要由小型浮游和底栖浮游分类单元主导，例如长吻鲈鱼Photolateralis stercorarius（19.4%）、圆鲱鱼Spratelloides spp.（25.7%）和粉耳皇帝鱼Lethrinus cf. lentjan（11.6%），而珊瑚礁则表现出更均匀的物种分布，例如条纹兔鱼Siganus doliatus（20.6%）、白鳍雀鲷Pomacentrus albicaudatus（15.7%）、红腹黄尾鲷Caesio cuning（8.2%）和环纹鹦嘴鱼Scarus rivulatus（7.4%）。红树林生境的特征是一组较小的优势分类单元，例如大鳞鲻鱼Planiliza macrolepis（39.5%）、红鳍鲷鱼Lutjanus fulviflamma（25.6%）和条纹兔鱼Siganus doliatus（6%），而港口站点则显示了与自然和人为影响生境相关的混合分类单元，其中最丰富的是斑点棘足鱼Siganus fuscescens（21.1%）。图3. Con Dao群岛中DNA读段相对丰度最高的分类单元：主要物种的总读段数量以及在整个样本中占总读段数量的百分比。图4. Con Dao群岛四个生境中频繁检测到的分类单元：主要物种的读段数量和百分比。3.3. 多样性指数物种丰富度从一个珊瑚礁站点中的25种到港口站点的50种不等，在不同生境间差异显著。两个珊瑚礁站点的丰富度非常异质（35 ± 14.14），而红树林和海草生境的丰富度相对较小但稳定，分别为32 ± 0.00和32 ± 2.65（表1）。香农多样性指数在港口站点最高（H′ = 3.04），在红树林站点最低（H′ = 1.85 ± 0.03），这些站点也表现出最低的均匀度（Pielou’s J′ = 0.535 ± 0.007）。海草和珊瑚礁站点显示出中等的香农多样性，分别为H’ = 2.43 ± 0.39和2.67 ± 0.06，以及相对较高的Pielou’s均匀度指数，分别为J’ = 0.70 ± 0.11和0.77 ± 0.10。表1. Con Dao群岛八个采样点的丰度（读段数量）、丰富度（分类单元数量）、香农多样性指数和Pielou’s均匀度指数。3.4. 生境间的共有和特有物种Venn图分析显示生境间的物种组成重叠有限（图5）。只有三种物种在四个生境中都被检测到：彩色点鲈鱼Labracinus sp.、蓝条鹦嘴鱼Scarus ghobban和娇嫩圆鲱鱼Spatelloides delicatulus。大多数生境都以高比例的独特分类单元为特征。例如，在珊瑚礁生境中检测到的59种物种中，有19种（约33%）是该生境特有的。同样，其他生境中检测到的物种中有33%到50%是特定于该生境的，表明强烈的生境特化和有限的物种重叠。图5. 四个采样生境内和之间的常见鱼类物种数量的Venn图。3.5. 鱼类群落的多元分析站点×分类单元矩阵（144个分类单元分布在八个站点）的对应分析（CA）显示鱼类群落在不同生境间有明显的分化（图6）。前两个轴分别代表25%和18.3%的总信息，清楚地分离了珊瑚礁、红树林和海草群落。港口样本位于更靠近海草站点的位置，表明这两种生境之间的物种组成更为相似。站点之间的空间距离无法解释群落相似性。值得注意的是，尽管地理位置最远的两个红树林站点显示出高度相似的鱼类群落，而地理位置较近但属于不同生境（珊瑚礁和海草床）的站点则更为不同。基于前两个CA轴的坐标对分类单元进行聚类，确定了三个主要物种组：组1主要与海草床和港口相关；组2是红树林生境的特征；组3与珊瑚礁密切相关。尽管这些组表明了生境亲和性，但每个组中的分类单元偶尔也会在其他生境中被检测到（例如，三种常见物种：彩色点鲈鱼Labracinus sp.、蓝条鹦嘴鱼Scarus ghobban和娇嫩圆鲱鱼Spatelloides delicatulus），反映了生态连通性和物种流动性。这种分类证实了鱼类群落的强烈生境驱动结构，并增强了所检测群落的生态相关性。图6. 站点-分类单元表的对应分析（CA）：(a) 在CA的前两个轴上投影相对贡献超过0.5的物种：这两个轴分别代表了25%和18.3%的总方差。鱼类插图对应于名称加粗的物种，这些物种是根据拷贝数记录在每个生境中排名前十的物种（见图4）；(b) 在同一轴上投影八个站点，根据它们的层次聚类结果分为三个组：组1 = 海草床 + 港口；组2 = 红树林；组3 = 珊瑚礁。这些组在A中报告以突出相应的物种。4. 讨论 4.1. 使用eDNA宏条形码进行鱼类物种鉴定的挑战和限制环境DNA宏条形码现在被广泛认为是一种强大的、非侵入性的工具，用于评估海洋鱼类多样性，特别是在物种丰富的热带系统中，传统采样方法受到限制[28,40]。然而，与其他基于DNA的方法一样，使用eDNA进行物种鉴定仍然受到几个众所周知的方法学限制[41,42]。一个关键限制是参考数据库的完整性和准确性[43]。尽管MiFish 12S标记为大多数硬骨鱼类提供了稳健的分类分辨率[28,44,45]，但可靠的物种水平分配取决于当地分类单元的参考序列的可用性[46]。然而，在本研究中，85%的OTU被分配到物种水平（>98.5%），这与其他海洋eDNA调查相比相对较高，特别是在热带地区[30,34]。剩余的15%可能反映了参考覆盖的不完整，而不是方法学失败，这与越南和印度-太平洋地区的先前研究一致[18,19,26]。第二个限制与密切相关或最近分化的物种之间的遗传差异不足有关。在几个多样的珊瑚礁鱼类科中记录了物种复合体，包括雀鲷科、Siganidae、Mullidae、Apogonidae和Gobiidae[47,48,49]，短eDNA宏条形码片段在某些情况下可能缺乏足够的分辨率来区分这些分类单元。标记级别的比较显示，不同引物集和科之间的区分能力有所不同：例如，在48个科中，有14到19个科检测到BIN（条形码索引数）区分错误，取决于所考虑的宏条形码，其中Teleo1引物集的表现最不一致，MiFish和Ac12S显示出最低的错误率[50]。同样，一些eDNA标记的种间分化值低于基于COI的BINs恢复的值，表明用较短的宏条形码片段可能无法始终恢复某些分类单元的物种边界[45]。更一般地说，没有一种宏条形码是普遍最优的，标记选择对分类分辨率有重要影响。最后，eDNA数据集可能包含由于污染、标签跳跃或PCR错误而产生的低水平伪影[42,51,52]。尽管采取了保守的过滤方法来最小化这些问题，但这样的方法可能会排除一些稀有分类单元的鉴定。总体而言，这些限制是当前eDNA工作流程固有的，但在谨慎解释时不会削弱群落水平模式的稳健性。4.2. Con Dao群岛的鱼类多样性：来自eDNA的新见解尽管存在这些限制和相对有限的采样努力，当前的eDNA调查大大扩展了我们对Con Dao海洋保护区鱼类多样性的了解。仅从八个站点和四种生境类型中检测到了144种鱼类，共16个样本。与之前的调查相比，方法之间存在显著的互补性。传统调查[12]报告了273种物种，而灯光陷阱采样[26]恢复了163个分类单元，其中120个在物种/属水平上被识别（表S1）。然而，只有13种物种在所有三种方法中都有发现，表明方法之间的结果重叠非常有限。迄今为止，三种方法检测到的物种总数为436种（表S1）。超过一半的eDNA数据集（77种）由这种方法独家检测到。此外，eDNA恢复了45个科，超过了传统调查（38个科）和灯光陷阱采样（33个科），其中11个科是eDNA独有且未出现在所有之前的调查中（表S1）。这种分类广度的显著增加突显了eDNA检测到系统发育上多样化的谱系的能力，这些谱系可能在依赖渔具的调查中代表性不足，包括隐秘底栖、夜间活动、浮游或行为难以捉摸的物种，这些物种很少被网捕获或被灯光陷阱吸引。三种方法之间极低的重叠表明现有的清单远未涵盖所有物种。鉴于Con Dao的高度生境异质性和其与生物多样性丰富的珊瑚三角区的地理接近性，通过空间有限的eDNA调查检测到77种以前未记录的物种强烈表明该群岛的鱼类多样性被严重低估。尽管有这些优势，但由于采样设计的局限性，目前研究中通过eDNA揭示的多样性应谨慎解释。与之前在较长时间内进行多次采样的调查[12,26]相比，eDNA数据集是在单次采样活动中获得的，每个站点只有少数重复样本（总共八个站点）。这样的设计无法捕捉鱼类群落的时间变化，特别是在热带沿海系统中，由于潮汐周期、昼夜移动、繁殖事件和季节性补充脉冲，物种组成可能在短时间内发生显著变化。因此，虽然eDNA在检测广泛的分类单元方面非常有效，但这里报告的总多样性可能仍然低估了Con Dao群岛中实际的鱼类多样性。一些稀有、低丰度或短暂的物种可能由于eDNA分布和检测的随机性而被遗漏，特别是考虑到重复样本的数量有限。在这种情况下，与基于重复采样的先前清单的比较进一步强调了采样强度和时间覆盖范围的差异，以及方法学偏差对物种列表差异的贡献。因此，未来的研究需要结合增加重复样本、季节性采样和多年监测，以完全解决鱼类多样性模式并提高基于eDNA的生物多样性评估的稳健性。4.3. 鱼类群落的生境结构多元分析一致表明，鱼类群落在不同生境间的差异大于地理上相邻站点之间的差异（图1和图6），珊瑚礁、红树林、海草床和港口分别拥有不同的群落。只有三种物种在所有生境中都有共同存在（彩色点鲈鱼Labracinus sp.、蓝条鹦嘴鱼Scarus ghobban和娇嫩圆鲱鱼Spatelloides delicatulus）。不同生境之间共同物种的数量较少，这与我们分析中检测到的强烈生境划分一致，这三种普遍存在的物种可能通过根本不同的生态策略实现其广泛的分布。蓝条纹鹦嘴鱼（Scarus ghobban）是一种被广泛记录的移动性物种，其生活习性会随着发育阶段的变化而改变：幼鱼栖息在海草床中，而成年鱼则会迁移到珊瑚礁上[53]。这种鱼类还表现出显著的饮食灵活性，从定居初期以小型甲壳类动物为食，逐渐转变为成年后以藻类和附生植物为食[54]，这使得它们能够利用不同结构栖息地中的营养资源。另一种小型浮游生物——精致鲱鱼（Spratelloides delicatulus）在其整个生命周期中都会在近岸水域形成鱼群，这些水域包括海草床、珊瑚礁和港口区域[25,55]。它的普遍存在可能反映了其与底栖生境结构的解耦：作为一种水柱生物，其分布更多地受到浮游食物可用性和水文条件的影响，而非底质类型的影响。最后，色彩斑斓的点点背鱼（Labracinus sp.，属于伪色科）是一种小型隐秘捕食者，通常栖息在裂缝和洞穴中[56]。它们能够在各种栖息地中生存，这可能是由于它们依赖于三维微生境结构（如洞穴、悬垂物和缝隙），而这些结构可以在珊瑚框架、红树林根系、人工港口结构以及海草相关的碎石中找到。这三个物种共同说明了热带珊瑚礁相关鱼类的栖息地泛化现象可以由发育阶段的栖息地特化、与底栖基底分离的浮游生活方式，或是受微生境驱动而非宏观生境驱动的分布机制所促成。这些模式与更广泛的发现一致，即栖息地生态位宽度是预测物种在异质性和受干扰的海域中持续存在的关键因素[57]。这种由栖息地驱动的划分与生态理论相符，该理论认为环境过滤和结构复杂性会影响沿海鱼类群落的组成[5,58]。热带沿海的镶嵌生态系统通常作为相互连接但生态上有所区分的栖息地网络运作，每个栖息地为区域多样性（gamma多样性）贡献独特的组成部分。因此，在CDA中观察到的高beta多样性反映了栖息地特化和空间更替，而不仅仅是简单的采样偏差。

尽管红树林栖息地在现有的海洋保护区（MPA）划分和生物多样性监测计划中代表性不足，但它们仍支持着在分类学上不同的鱼类群落。在整个印度-太平洋地区，红树林栖息地的鱼类群落与相邻的珊瑚礁和海草床不同，且通常以幼鱼和河口相关物种为主[59,60]。在某些地区，红树林对珊瑚礁鱼类的生物量和补充量贡献显著，充当了重要的育婴场，将新生成的鱼类输送到相邻的珊瑚礁[59]。本研究中发现的众多与红树林相关的物种进一步强调了这些栖息地在Con Dao海域中的生态重要性。海草床表现出高物种丰富度，并与港口区域共享多种物种，表明它们具有生态连通性和潜在的育婴功能。海草栖息地被广泛认为是珊瑚礁和沿海鱼类的关键育婴场所，为幼鱼提供庇护和丰富的食物资源[8,9]。通过发育阶段的栖息地转变，海草栖息地与珊瑚礁之间的连通性已在多个热带系统中得到证实[5,58]。这里检测到的海草和港口群落之间的部分重叠表明，人为改造的栖息地可能部分复制了相邻自然环境的生态功能，可能是通过提供硬质基底、庇护所以及靠近海草来源的食物来源实现的，而不仅仅是简单地容纳了一部分沿海物种。港口区域的高多样性可能与存在多种食物来源有关，而远离城市的栖息地则可能没有这么多食物来源。

正如预期的那样，珊瑚礁栖息地主要栖息着与珊瑚礁相关的鱼类家族，但与红树林和海草群落的有限重叠突显了这些栖息地之间的生态互补性。这一模式与珊瑚三角区系统的研究结果一致，在那里栖息地异质性是鱼类多样性和特有性的主要驱动因素[61,62]。总体而言，这些栖息地层面的模式揭示了一个明显的悖论：我们在多变量分析中发现的强烈栖息地分化与热带沿海系统中红树林、海草床和珊瑚礁之间有据可查的发育阶段连通性共存。然而，这并不矛盾。eDNA采样捕捉的是每个地点在特定时间点的DNA存在情况，而不是个体移动的累积轨迹。居住在红树林或海草床中的幼鱼以及定居在珊瑚礁上的成年鱼在采样时向各自的栖息地贡献了环境DNA，因此发育阶段的迁移者在每个生命阶段都表现为特定栖息地的居民，而不是栖息地泛化者。因此，在Con Dao各栖息地观察到的高beta多样性与一个系统一致，在该系统中，功能连通性在个体发育过程中起作用，而鱼类群落组成在栖息地层面保持生态结构。eDNA宏条形码分析非常适合通过其空间分辨的群落组成快照来揭示这种双重性，但无法追踪个体移动或将其检测结果归因于特定的生命阶段。要确认推断出的连通性路径，需要采用其他方法，如耳石微化学分析或标记-重捕研究。

4.4. CDA中eDNA与灯光陷阱调查的互补性
在同一区域内，使用灯光陷阱（LT）采样[26]和eDNA宏条形码分析（本研究）识别的鱼类多样性进行了比较（表S1），发现两种方法之间的重叠非常有限（只有30种物种）。鉴于两种方法检测到的物种总数相似（LT检测到120种，eDNA检测到144种），这种低重叠尤为显著。值得注意的是，eDNA检测到的科的数量明显多于LT采样。一些通过eDNA检测到的科在LT物种清单中完全缺失。这种差异可能反映了方法的选择性，因为已知许多鱼类不会被光线吸引或会主动避开被照亮的微生境。例如，Mugilidae科仅通过eDNA被检测到。此外，LT数据集中没有Carangidae科的存在表明该科的物种可能避免使用基于光线的采样设备。总体而言，这一发现强调了eDNA宏条形码在获取鱼类多样性方面比LT采样具有更大的能力。这种比较突出了两种方法在捕获鱼类群落生态成分方面的根本差异。共享物种比例低表明这两种方法捕获的生物信号存在部分重叠。尽管这一结果清楚地表明eDNA在当前采样设计下能够检测到更广泛的分类范围，但这并不意味着LT采样没有生态价值。相反，两种方法之间的低重叠突显了它们的互补性。eDNA宏条形码能够捕获生物体释放到环境中的DNA痕迹，无论其行为、生命阶段或活动时期如何[32,63]。它允许在大范围空间和异质环境中快速进行标准化的生物多样性评估[40,64]。eDNA检测到的更多科进一步支持了其提供更全面的鱼类群落分类学快照的能力。这一模式与先前的比较研究结果一致，这些研究表明eDNA在结构复杂的热带生态系统中始终能检测到更广泛的分类多样性[40,65]。空间覆盖范围的差异可能加剧了两种方法之间的对比。Pham等人[26]的LT采样由于潮汐限制无法在红树林栖息地中进行，而eDNA采样则整合了包括红树林在内的多种栖息地的信号，已知红树林栖息地拥有独特的鱼类群落[59,60]。此外，LT调查针对特定的生命阶段（主要是幼体和幼鱼），而eDNA则整合了多个生命阶段的信号；即使两种方法都准确，这种差异本身也会减少重叠。排除与红树林相关的多样性并限制时间覆盖范围不可避免地限制了LT采样所捕获的多样性。

尽管eDNA宏条形码具有广泛的分类覆盖范围，但它未能检测到一些通过灯光陷阱采样记录的科，包括Bregmacerotidae、Clupeidae、Chirocentridae、Gobiesocidae、Plesiopidae、Synodontidae和Trichiuridae。这些差异可能是由于当前eDNA调查的采样努力有限，仅在一个采样事件中收集了16个样本。相比之下，LT采样整合了时间变化，特别擅长捕捉偶发的幼体丰度高峰[25,26,27]。先前的研究表明，随着重复采样、在不同时间和深度的采样，eDNA的检测概率显著增加，尤其是对于稀有或短暂存在的物种[66,67,68]。

4.5. 对生物多样性评估和MPA管理的启示
鱼类群落中观察到的强烈栖息地特异性表明，仅保护选定的珊瑚礁或海草斑块（如CDA目前所做的那样）不足以保护所有沿海鱼类多样性。红树林、海草床、过渡栖息地甚至像港口这样的改造环境似乎都对整体生物多样性有所贡献，应在MPA划分和监测策略中予以考虑。然而，这一结论应谨慎解读，因为当前的eDNA数据集基于有限的空间重复性和单一的时间点样本，这可能会影响对栖息地特异性和群落差异的估计。在所有先前清单中未检测到的11个科的发现进一步证实了当前生物多样性基线的不完整性，可能低估了非珊瑚礁栖息地的保护价值。Con Dao海洋保护区最初的设计重点关注像儒艮和海龟这样的大型动物，监测工作也主要集中在珊瑚礁和海草床的某些区域。然而，我们的结果表明，非珊瑚礁栖息地，特别是红树林，为整体鱼类多样性提供了独特且非重复的组成部分。尽管这一结果仅基于单一时间点的采样，但如果将这些栖息地排除在生物多样性评估之外，将导致对区域多样性的系统性低估，并可能导致保护优先级的错误判断。除了改进采样方法外，eDNA快速生成高分辨率生物多样性数据的能力使其成为适应性管理的理想工具，尤其是在那些物流限制导致大规模水下调查难以进行的MPA中。虽然eDNA不能替代传统方法（它无法提供关于数量、种群结构或个体状况的信息），但将其与灯光陷阱、视觉普查和渔业监测结合使用，可以为长期生物多样性评估和早期检测群落变化提供强大的框架。将基于栖息地的eDNA监测整合到长期的MPA管理中，可以提供一个更符合现代生物多样性保护原则的框架[4,69]。

5. 结论
eDNA宏条形码分析显著增强了我们对Con Dao群岛鱼类多样性的理解，揭示了特定栖息地的鱼类群落以及之前未记录的沿海鱼类生物多样性组成部分。尽管在参考数据库、分类学分辨率和物种复杂性方面仍存在挑战，但这些限制与其他分子和形态学方法相同，并不削弱eDNA在广泛生物多样性评估中的价值。未来工作有几个优先事项：首先，需要扩展和整理区域参考库，特别是对于物种丰富且分类学上具有挑战性的科；其次，将eDNA与基于标本的条形码分析、灯光陷阱调查和传统生态监测相结合，对于弥合分子检测和验证物种存在之间的差距至关重要；最后，跨季节重复进行eDNA采样将有助于确定这里观察到的栖息地特异性模式是时间稳定的还是反映了群落组成的季节性变化。在像Con Dao这样的生物多样性热点地区，这种综合方法尤为重要，因为有效的MPA管理依赖于对所有沿海栖息地鱼类多样性的全面了解。CDA海洋保护区的管理也应进行修订，考虑到保护更多栖息地，甚至最好是连续的栖息地，而不仅仅是单独的栖息地。

补充材料
以下支持信息可在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/d18050255/s1，表S1：Nguyen & Mai [12]、Pham等人[26]以及本研究记录的Con Dao群岛中的鱼类物种。