《Biomass and Bioenergy》：A circular biorefinery approach for mango and lemon industrial waste: on-site Aspergillus welwitschiae cellulase production, enzymatic hydrolysis and bioethanol fermentation
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芒果皮（MP）和柠檬果渣（LP）等农业工业残留物是丰富的木质纤维素生物质，但其随意丢弃会带来环境挑战。它们的高碳水化合物和低木质素含量使其成为适合糖化和生物乙醇生产的底物。然而，商业纤维素酶的高成本限制了其经济可行性。利用真菌发酵进行现场酶生产，为生物精炼框架
芒果皮（MP）和柠檬果渣（LP）等农业工业残留物是丰富的木质纤维素生物质，但其随意丢弃会带来环境挑战。它们的高碳水化合物和低木质素含量使其成为适合糖化和生物乙醇生产的底物。然而，商业纤维素酶的高成本限制了其经济可行性。利用真菌发酵进行现场酶生产，为生物精炼框架内的可持续替代方案提供了可能。研究人员分离了草酸青霉（Aspergillus welwitschiae）并对其进行了形态学和系统发育学鉴定。MP和LP经过处理、近似组成分析，并作为碳源用于深层发酵。采用23因子设计评估了粒径、固液比和搅拌速度对酶生产的优化。酶提取物通过切向超滤进行浓缩，并检测纤维素酶活性。在不同酶量和固体负载下进行糖化，以评估优化条件，随后利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行酒精发酵。MP粗提物在评估条件下的羧甲基纤维素酶活性为0.54 U/mL，LP达到1.45 U/mL，经浓缩后，其活性分别提高至1.37 U/mL和2.09 U/mL；同时显示出果胶酶活性，MP为3.02 U/mL，LP为4.01 U/mL。酶法水解产生的还原糖最高达23.47 g/L（MP）和15.44 g/L（LP），其中固体负载的影响大于酶剂量。发酵在24小时产生乙醇浓度为3.07 g/L（芒果）和3.2 g/L（柠檬）。该研究证明了将农业工业废物转化为酶和生物乙醇的集成生物工艺在技术上是可行的。
论文解读文章
一、 研究背景、问题与目的
农业活动产生的固体残留物是全球经济亟待解决的重要问题。全球每年产生约50亿吨农业废弃物，其不当处置不仅带来环境挑战，也阻碍了可持续发展目标的实现。芒果（Mangifera indica）和柠檬（Citrus aurantifolia）的加工残渣，如果皮和果渣，富含纤维素、半纤维素、果胶和短链碳水化合物，是生产纤维素酶、果胶酶和生物乙醇的潜在底物。墨西哥是这些水果的重要生产国，2024年芒果和柠檬产量分别约为234.7万吨和2915.1万吨，其加工业产生了大量此类废弃物，为区域性的、可持续的生物制造提供了原料基础。
然而，当前处理这些农业工业残留物的传统方法（如用作饲料或填埋）存在传播病原体、产生温室气体和渗滤液等环境与公共卫生问题。更为关键的是，生物转化路径，特别是利用酶法水解木质纤维素生产生物乙醇，面临商业纤维素酶成本高昂的瓶颈，限制了其经济可行性。此外，尽管已有研究探索利用水果残渣生产生物乙醇，但关于利用芒果皮和柠檬果渣进行现场、低成本纤维素酶生产，并将其集成于一个连续的生物精炼流程（从酶生产到糖化再到乙醇发酵）的系统性研究相对有限。特别是对于富含果胶、持水能力强的柑橘类果皮残渣，传统的固态发酵（Solid-State Fermentation, SSF）可能因传质、传氧和散热问题而效率不佳，需要探索更合适的发酵模式。
因此，本研究旨在应对上述挑战，探索一种循环生物精炼策略。核心目标在于验证利用本地易得的芒果皮和柠檬果渣作为原料，通过深层发酵（Submerged Fermentation, SmF）进行现场纤维素酶生产的可行性，并随后使用这些自产酶对同种废物进行水解，所得糖液最终用于生物乙醇发酵，从而构建一个从废物到高附加值产品（酶和燃料）的集成化、可持续的技术路径。该研究为降低生物炼制过程对昂贵商业酶的依赖、推动循环生物经济发展提供了一个概念验证。本论文发表在《Biomass and Bioenergy》期刊。
二、 关键技术方法概述
研究人员采用了集成化的生物工艺路线，主要包括以下关键步骤：1. 原料采集与表征：从墨西哥特科曼的加工厂收集湿基芒果皮（MP）和柠檬果渣（LP，来自柠檬皮果胶酸提取的工业副产品），并进行近似组成（水分、灰分、蛋白质、脂肪、碳水化合物、木质素等）分析。2. 菌株分离与鉴定：从环境中分离得到一株真菌，通过形态学观察和基于内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）区域的系统发育学分析，鉴定为草酸青霉（Aspergillus welwitschiae）。3. 现场酶生产与优化：以MP和LP为碳源，在深层发酵系统中培养Aspergillus welwitschiae生产纤维素酶。采用23全因子实验设计，优化了发酵的物理参数（底物粒径、固液比、搅拌速度）。发酵粗酶液通过切向流超滤进行浓缩。4. 酶法水解优化：使用上述自产的浓缩酶液，对MP和LP进行糖化。通过实验评估了酶负载量和底物固体负载量对还原糖得率的影响。5. 乙醇发酵：将酶解得到的富含还原糖的水解液，接种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行酒精发酵，测定乙醇产量。
三、 研究结果
3.1 芒果皮和柠檬果渣样本表征
分析显示，MP和LP均富含碳水化合物（MP: 78.6%， LP: 75.4%，干基）且木质素含量较低（MP: 7.9%， LP: 9.5%），证实它们是用于糖化发酵的合适木质纤维素原料。LP的果胶含量显著高于MP。
3.2 真菌显微培养与分生孢子头分支形态
分离的真菌在PDA培养基上形成黑色颗粒状表面、边缘白色的菌落。显微镜观察显示其产生深色、球形的分生孢子以及分支的棉状菌丝体，这些形态特征与曲霉属（Aspergillus）真菌一致。分子鉴定结果（ITS序列分析）最终将其确认为Aspergillus welwitschiae。
3.3 酶生产：深层发酵优化与浓缩
以MP和LP为碳源的深层发酵成功生产了纤维素酶和果胶酶。优化实验（23因子设计）表明，对于MP，较小的粒径（0.5 mm）、较高的固液比（1:15 g/mL）和较高的搅拌速度（200 rpm）有利于酶生产；对于LP，最佳条件则是粒径2.0 mm、固液比1:10 g/mL、搅拌速度150 rpm。在最佳条件下，MP和LP粗酶液的羧甲基纤维素酶（Carboxymethylcellulase, CMCase）活性分别为0.54 U/mL和1.45 U/mL。通过切向流超滤浓缩后，酶活性显著提升，MP和LP的CMCase活性分别增至1.37 U/mL和2.09 U/mL。浓缩酶液还表现出果胶酶活性，MP为3.02 U/mL，LP为4.01 U/mL。
3.4 酶法水解：固体与酶负载量的影响
使用浓缩酶液对MP和LP进行糖化。研究发现，底物固体负载量对还原糖产量的影响大于酶负载量。对于MP，在20%固体负载和15 FPU/g酶的条件下，还原糖产量最高，达23.47 g/L。对于LP，在10%固体负载和20 FPU/g酶的条件下，还原糖产量最高，为15.44 g/L。MP的更高糖产量可能与其更高的碳水化合物含量和更易被酶攻击的结构有关。
3.5 乙醇发酵
将上述最佳糖化条件下获得的水解液（未进行脱毒处理）用于乙醇发酵。MP和LP水解液在发酵24小时后，分别产生了3.07 g/L和3.2 g/L的乙醇。乙醇得率（基于理论糖产量）对于MP和LP分别为19.3%和23.7%。研究表明，使用现场生产的酶对MP和LP进行水解和发酵，生产生物乙醇在技术上是可行的。
四、 讨论与结论
讨论总结：研究对结果进行了深入讨论。首先，通过与文献对比，指出本研究获得的酶活性与使用其他农业残留物报道的结果相当甚至更优，凸显了MP和LP作为低成本酶生产基质的潜力。其次，讨论了固体负载量在糖化中的主导影响，强调高固体含量导致的传质限制和抑制物浓度升高是未来工艺放大的关键挑战。第三，分析了MP和LP在成分和结构上的差异（如果胶含量、纤维素可及性）如何导致其酶解效率和糖产量的不同。第四，探讨了乙醇得率相对较低的原因，可能包括水解液中存在发酵抑制物（如糠醛、5-羟甲基糠醛、有机酸），以及未对水解液进行脱毒处理。最后，从循环生物精炼和可持续性的角度，评估了本研究提出的集成工艺（现场酶生产-废物糖化-乙醇发酵）在降低商业酶成本、实现农业废物增值以及贡献于可持续能源（SDG 7）和气候行动（SDG 13）目标方面的潜在优势。同时，也指出了未来研究需要优化发酵条件以提高酶活性和乙醇得率，并评估工艺的经济性与环境生命周期影响。
研究结论翻译：
本研究成功证明了利用MP和LP农业工业废物生产生物乙醇的集成生物工艺在技术上是可行的。通过利用Aspergillus welwitschiae进行深层发酵现场生产纤维素酶，该研究为生物乙醇合成提出了一条替代性的、技术上可行且可持续的路径。
对Aspergillus welwitschiae的详细形态学和分子鉴定证实了其适用于从所研究的农业废物中生产酶。该真菌在两种底物上均能产生纤维素酶和果胶酶。
发酵参数的优化（粒径、固液比、搅拌）使得能够获得具有显著CMCase活性的提取物，经浓缩后活性增加。酶水解实验表明，固体负载是影响还原糖释放的关键参数，对于MP和LP，分别获得了高达23.47 g/L和15.44 g/L的糖产量。
随后使用酿酒酵母进行酒精发酵，在24小时分别从MP和LP获得了3.07 g/L和3.2 g/L的乙醇浓度。该过程展示了从这些丰富且低成本的原料生产第二代生物燃料的潜力。这项工作代表了一种有前景的、环境友好的农业废物管理方法，将其转化为能源产品，符合循环生物经济原则。
