使用深度学习方法是否可以预测潜伏HIV病毒库的分子微环境？

《Journal of Virology》：Is the molecular microenvironment of the latent HIV reservoir predictable using deep learning approaches?

　　

3. 摘要翻译 尽管目前的抗逆转录病毒治疗（ART）能有效抑制感染个体的病毒复制，但感染仍无法治愈。造成这一现状的主要原因之一是潜伏HIV储库（latent HIV reservoir）分子微环境（MME）的不确定性。如果能精确靶向这一微环境，就能提高现有抗逆转录病毒治疗的疗效。为了更好地描绘潜伏HIV储库的潜在微环境，首先必须了解导致某些病毒具有转录活性而其他病毒保持沉默的机制。目前，利用深度学习方法结合表观遗传学从DNA序列预测基因活性已变得可行。关于潜伏HIV储库的多维数据集已取得实质性进展。因此，迫切需要实施深度学习来挖掘潜在属性，从而表征和预测潜伏HIV储库的微环境。本篇小型综述讨论了可整合到深度学习方法中的潜在特征，以从不同层级结构的潜伏HIV储库组织中预测潜在微环境的可能性，并提出了利用深度学习解决该问题的总体工作流程。此外，还提供了当前深度学习模型在预测应用中的局限性，以及关于如何基于小规模HIV队列增强潜伏MME预测结果可解释性的观点。为了方便实验病毒学家阅读，文末提供了与深度学习建模相关的术语表（所有以斜体书写的术语）。

4. 论文主体内容总结

潜伏HIV储库的异质性本质：分子微环境的存在

人类免疫缺陷病毒（HIV）储库的异质性可以从多个角度考虑，包括不同的储库细胞类型、特定的解剖 sanctuary、原病毒基因组完整性（完整与缺陷型）、HIV整合位点（IS）偏向性及其与转录和再激活的关联，以及复制适应性。尽管这些机制均反映了潜伏分子微环境（MME）的存在，但目前尚无法精确定位潜伏MME，导致当前抗病毒治疗和功能性治愈无效。能够挖掘复杂数据集中隐藏特征并串联不同“组学”读数信息的先进计算方法至关重要。本文讨论了与MME组织不同层级相关的潜在特征，包括HIV IS、调节HIV转录的储库细胞状态、HIV基因组完整性以及插入物特异性HIV转录和潜伏期逆转，并提出了利用深度学习（DL）预测潜伏MME的理论流程。

Section I—与HIV IS相关的潜在特征

HIV DNA整合到宿主基因组是其生命周期的特征，对储库细胞中的持续感染至关重要。HIV IS的选择并非随机过程，在三维（3D）基因组组织水平上，HIV IS倾向于靠近核孔复合体以及与超级增强子相关的活跃染色质区域（A1和A2区室），这些区域覆盖有组蛋白H3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）和组蛋白H3赖氨酸36三甲基化（H3K36me3）的染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）信号。此外，拓扑特征，包括拓扑相关结构域边界、CCCTC结合因子（CTCF）和R-loop（DNA:RNA杂交体）也与HIV IS协调作用。RNA剪接解旋酶Aquarius可将HIV整合导向主要转录活跃基因内含子序列中的R-loop区域。鉴于R-loop对基因表达（正义和反义转录本[AST]）至关重要，进一步研究R-loop依赖性机制对于理解HIV IS如何决定其插入特异性转录十分必要。值得注意的是，尽管在HIV脑储库细胞——小胶质细胞中观察到了类似的HIV IS空间模式，但仍存在差异，这表明即使目前难以实现细胞类型特异性的高精度预测，未来的分类模型仍需明确细胞类型特异性特征。

Section II—与储库细胞状态调节HIV转录相关的潜在特征

HIV潜伏期被广泛认为是病毒嗜性针对活化CD4+ T细胞的结果，这些细胞可转变为不支持复制的静息记忆状态，表明原病毒潜伏期在一定程度上受宿主细胞活化状态控制。潜伏HIV原病毒可持续存在于静息记忆CD4+ T细胞中，估计半衰期为44个月，因此需要终身治疗。虽然关于初始T细胞在HIV持续性中的作用仍有争议，但中央记忆（T_CM）、效应记忆（T_EM）和过渡记忆（T_TM）T细胞亚群已被确认为主要的储库细胞。近期研究表明，随着抗逆转录病毒治疗（ART）时间的延长，可诱导储库向分化程度更高的T细胞区室转移，提示储库细胞组成随ART治疗动态变化。此外，静息记忆状态与HIV启动子表观遗传沉默增加以及激活HIV转录的转录因子胞质隔离有关。值得注意的是，潜伏HIV储库可在感染急性期早期建立，潜伏期被视为一种“风险对冲策略”，允许部分感染细胞存活足够长时间以穿越粘膜屏障。最近一项研究鉴定出一种具有独特特征的潜伏细胞亚群，其HIV IS倾向于非基因区域，靠近锌指基因和异染色质区域，这种整合偏向类似于精英控制者（elite controllers）中储库的表征，提示宿主免疫选择的作用。继续探索标记独特储库细胞群体的表型特征将丰富细胞水平上与不同潜伏MME相关的特征复杂性。

Section III—与HIV基因组完整性相关的潜在特征

HIV DNA整合后，仅有2%–10%的原病毒保持遗传完整性，其余遗传缺陷型携带大片段缺失、序列倒位、超突变及剪接供/受体位点缺陷，阻止病毒复制。目前认为携带完整原病毒的储库细胞是病毒反弹的主要来源。近期研究指出存在自发性活跃的HIV储库，主要由缺陷型原病毒主导，并在大多数接受ART抑制的HIV感染者（PLWH）中预示HIV特异性免疫。基于长期ART治疗个体和精英控制者的纵向队列研究进一步表明，免疫介导选择力的多样性可以重塑携带遗传完整原病毒的潜伏HIV储库配置，从而更新了HIV深度潜伏（或沉默）的概念。HIV深度潜伏源于1990年代，指对再激活具有难治性的潜伏原病毒，通常与表观遗传特征（如DNA甲基化）或特定染色体构象（如异染色质）相关。这些与HIV深度潜伏相关的特征在精英控制者的HIV IS偏好于着丝粒卫星DNA或含Krüppel相关盒结构域的锌指（KZNF）基因中被揭示。事实上，基于急性与慢性队列的纵向分析显示，在治疗1年后早期治疗个体的异染色质区域即可检测到HIV IS，并在ART治疗5年后逐渐富集。此外，基于图论工具构建的HIV靶向基因网络图同构性差异及马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）方法模拟的图进化轨迹也提示了这些两类HIV感染者之间HIV储库的内在属性不同。未来对来自精英控制者的独特MME生物标志物和基因组特征的深入鉴定，将有助于在“阻断与锁定”（block-and-lock）策略框架下推动新型功能性治愈方法的开发。

Section IV—与插入特异性HIV转录和潜伏期逆转相关的潜在特征

Jordan及其同事的开创性研究开辟了HIV转录依赖于HIV IS的新途径，这一现象类似于经典的“位置效应斑驳”（Position Effect Variegation），表明HIV IS决定了体外HIV基因表达。HIV IS与最接近的内源性增强子之间的距离存在相关性：在Jurkat T细胞环境中，HIV表达与由H3K27ac ChIP-seq信号表示的内源性增强子距离密切相关。HIV IS还影响潜伏原病毒对潜伏期逆转剂（LRAs）和促进剂（LPAs）的反应。在LRAs治疗中，靠近H3K27ac标记内源性增强子的潜伏原病毒对伏立诺他（vorinostat）比植物血凝素（PHA）更敏感。Battivelli等人进一步估计，不到5%的原发性CD4+ T细胞可被测试的LRAs诱导。不同的组蛋白修饰（如H3K27ac、H3K4me1、H3K36me3、H3K9me3和H3K27me3）在产品感染细胞（PIC）、再激活潜伏感染细胞（RLIC）和非再激活潜伏感染细胞（NRLIC）中显示出不同的表观遗传谱。值得注意的是，当潜伏原病毒受到不同LRAs处理时，可检测到来自两个HIV LTR的不同启动子活性。在LPAs治疗中，LEDGINs虽能将HIV IS重定向至不利于基因表达的区域，但仍有少量重定向的原病毒保持转录活跃。这些发现提示，仅基于HIV IS结合表观遗传特征可能无法实现对潜伏MME的精确预测。

CpG甲基化的表观遗传调控

表观遗传调控广泛参与HIV潜伏期的建立和维持。HIV 5'LTR被两个精确定位的核小体（Nuc-0和Nuc-1）占据，其重塑和修饰直接影响HIV潜伏期。此外，HIV启动子区域包含两个保守的CpG岛，在潜伏状态下形成DNA甲基化位点，由DNA甲基转移酶1（DNMT1）修饰并由甲基-CpG结合域蛋白2（MBD2）维持。研究发现HIV感染导致宿主基因组平均甲基化状态的改变（既有高甲基化也有低甲基化），这可能作为潜在的MME，使得HIV IS在免疫介导选择的压力下得以维持，从而导致原病毒在更深层次潜伏中的持续性。

HIV转录机制

HIV转录受5'LTR启动子严密调控，HIV劫持宿主细胞转录因子来控制其基因表达。感染后，募集的宿主细胞转录因子足以启动HIV转录，但此时产生的全长转录本水平极低。为了提高表达，HIV反式激活蛋白Tat通过增强HIV 5'LTR启动子的转录延伸发挥重要作用，这被称为启动子“开启”（ON）状态。最终，Tat正反馈回路在“关闭”（OFF）状态松弛，从而导致潜伏期的建立。经典的双态启动子模型（ON vs OFF）代表了HIV转录噪声（gene expression episodic process）的经典模型，用于解释基因表达的爆发表型。然而，该模型未能产生具有确定性双稳态的清晰阈值响应，也无法代表HIV潜伏感染可在感染早期建立的生理条件。这些观察结果表明，很可能有额外的未知决定因素或机制参与调控随机HIV转录。随着更多独特潜伏MME相关特征的识别，这些算法的特异性（例如纳入更多参数）对于更好地区分不同潜伏MME将是必要的。

ASTs在促进潜伏期中的潜在作用

病毒已发展出多种策略建立潜伏状态以确保其在宿主体内的持续性。对于逆转录病毒而言，它们通过转录沉默持续存在，且不编码潜伏期蛋白。事实上，在其他人类逆转录病毒如HTLV-1中，其反义基因产物HBZ已被证明能促进感染细胞的存活和增殖。HIV反义转录本（ASTs）被认为可抑制正义RNA转录。我们对HIV反义转录的理解仍显不足，多个具有蛋白质编码和非编码功能的HIV ASTs由Tat非依赖性的HIV 3'LTR驱动，并与正义RNA转录竞争。在未刺激的PLWH外周血单个核细胞中存在ASTs，且ASTs的异位表达可抑制HIV转录和潜伏期逆转，进一步证实了它们在PLWH中的自然发生。值得注意的是，超过60%来自精英控制者和长期ART治疗患者的HIV IS相对于宿主基因呈相反方向。这一观察可能推断宿主基因的通读转录可促进HIV反义转录，随后抑制HIV正义转录并促进携带更深层次潜伏原病毒的潜伏MME的建立。相比之下，宿主基因通读转录本与HIV正义转录本之间发生的转录干扰导致了HIV潜伏期的建立。

潜伏期逆转与细胞间传播

目前的抗逆转录病毒治疗可以阻断易感细胞的新发感染，但不能消除潜伏原病毒细胞的病毒产生。潜伏感染细胞形成的潜伏储库可能导致中断治疗后病毒反弹。正在进行的潜伏感染细胞的自然再激活导致淋巴组织中的病毒释放，血浆中病毒载量较低（约2拷贝/mL）。一旦停止ART，指数级HIV生长会在几周内反弹，这与一系列随机过程一致。准确预测原病毒反弹行为对于设计更好的抗病毒方案至关重要。普通微分方程（ODE）曾被用于模拟ART中断后的HIV反弹。随机建模，如MCMC算法、Gillespie算法和贝叶斯推理，也被用于预测中断ART后的病毒反弹。目前已用于建立模型的预测变量包括潜伏储库的衰减率、潜伏储库产生活跃感染细胞的速率、任何活化细胞在其谱系死亡前产生反弹感染的概率、感染重启后的净增长率、静息记忆和潜伏感染CD4+ T细胞数量以及HIV RNA拷贝数。目前，与患者间差异相关的参数尚未频繁纳入模型构建中。近期一项研究指出，临床特征（如性别）会影响与免疫相关的HIV储库组成。未来在预测与潜伏期逆转相关的潜伏MME时，也应纳入群体和队列水平的参数。

Section V—利用DL方法预测潜伏MME

CD4+ T细胞中极低的原病毒频率（0.01%–0.1%）使得精确定位潜伏MME变得困难。准确预测潜伏MME不仅依赖于对决定原病毒命运机制的理解，还需要能够分析涵盖众多层级的潜伏MME本质的大规模序列数据的强大工具。深度学习（DL）作为机器学习（ML）的一个分支，能产生端到端模型（如深度神经网络）来计算更复杂的特征，被视为一种潜在选择。除了基础模型如卷积神经网络（CNNs）和循环神经网络（RNNs），近期的DL架构创新还包括Transformer、图卷积网络（GCNs）、胶囊网络、生成对抗网络（GANs）以及训练技术的进步。下文将重点讨论利用DL检查和预测潜伏MME可能性的基本原理及潜在工作流程。

利用DL模型预测HIV IS

DL模型已频繁应用于医疗保健领域。在HIV领域，DL模型已被用于诊断、耐药性预测、神经影像学和共病检测以及HIV IS的预测。DeepHINT是一个基于注意力机制的DL框架，能够基于仅DNA序列或与ChIP-seq H3K36me3信号数据集结合来预测HIV IS及其检测位点的机制解释（即序列基序）。原则上，DeepHINT首先采用多个卷积-池化模块自动从HIV IS上下游各1千碱基（kb）的DNA序列中学习信息性序列特征，随后进行独热编码（one-hot encoding）、位置权重矩阵运算并结合注意力机制。总之，仅DNA序列作为输入即可实现对HIV IS的预测；添加H3K36me3信号作为输入可提升预测性能。仅基于HIV IS周围DNA序列预测HIV IS的可行性，为预测潜伏MME的可能性提供了启示，现在的关键问题是HIV转录是否也可通过DL模型准确预测。

应用DL模型预测潜伏MME可能性的基本原理

尽管目前利用DL模型预测HIV潜伏期的研究较少，但在过去几年中DL已逐步应用于HIV研究。除HIV IS预测外，已有多项研究应用多层感知机（MLP）、双向循环神经网络（BRNN）、CNNs进行耐药性预测；应用HIV-Bidirectional Encoder Representations from Transformers (BERT)预测蛋白酶耐药性和核心ceptor嗜性；应用Rep2Mut（进化尺度建模蛋白质语言模型）分类野生型HIV Tat蛋白序列与突变序列；应用变分自编码器（VAE）筛选HIV蛋白酶抑制剂的新配体；应用cryoDRGN DL架构（tomoDRGN）揭示HIV衣壳复合物；应用长短期记忆（LSTM）VAE架构发现新型抗逆转录病毒药物；以及开发基于Transformer的DeepARV模型预测药物相互作用。事实上，基于DNA条形码的高通量技术已证实染色质位置对基因表达的影响，这与位置效应教条一致。此外，全基因组范围内自主启动子活性的图谱绘制表明，分离启动子的转录活性可解释相当比例（54%）的内源性启动子活性。这些结果为启动子DNA序列一级结构与基因表达水平变异性之间建立了明确的机制联系。由于HIV转录活性很大程度上受HIV IS和局部基因组环境影响，S2E模型可能为破译与HIV IS相关的DNA序列语言并有效预测HIV转录和不同MME提供一种有前景的方法。除序列水平预测能力外，DL模型还能捕捉预测变量与HIV转录之间的非线性关系，例如原病毒命运的二分叉和随机HIV转录。此外，DL模型克服了维度灾难，促进了单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据的整合。尽管目前DL模型尚未系统测试其在预测HIV转录和潜伏MME方面的有效性，但基于26个调控特征（包括核纤层蛋白亚区室状态、H3K27ac和染色质可及性）构建的传统二元逻辑回归模型已展示了基于AI方法的可行性。预计随着上述DL技术的突破，DL模型将提供优越的预测性能。

利用DL模型预测潜伏MME的理论工作流程

步骤1—训练输入数据集的准备

虽然DL模型以高数据需求著称，但确定特定预测目标的正确样本量仍然困难。对此，“十倍规则”（10-times rule）因其简单易用而备受青睐，意味着数据集数量应是数据集中参数数量的10倍。鉴于HIV研究经常面临小队列困境，一个潜在的解决方案是利用输入数据的质量，即参数的特异性，例如精确靶向更深层次潜伏的原病毒或特定于某些LRAs或LPAs的特征。此外，在训练前还应实施质量控制程序以过滤有问题的数据和异常值。目前可用于训练DL模型的数据集包括：（i）通过多种PCR技术（如连接介导PCR、线性扩增介导PCR、Integration Site Loop Amplification、INSPIIRED、LIS-seq）结合高通量测序绘制的HIV IS；（ii）通过B-HIVE测量的插入特异性单原病毒转录组学；（iii）HIV基因组的完整性（完整与缺陷）；（iv）RNA-seq和宿主转录组学；（v）针对PLWH在ART期间的scRNA-seq数据（如经典scRNA-seq、ECCITEseq、DOGMAseq、HIV-seq）；（vi）（表观）基因组数据集（如ChIP-seq、MNase-seq、ATAC-seq、HiC等）；（vii）HIV-人类蛋白质相互作用组学数据；（viii）临床纵向队列数据；（ix）HIV序列变异数据。

步骤2—选择合适的DL模型架构

合适的DL模型可根据输入类型、预测任务和计算限制来确定。原则上，CNN适用于网格状数据，RNNs（特别是LSTM或GRU架构）适用于基于序列和时间序列的数据。值得注意的是，基于网络的“组学”数据分析是说明病原体-宿主相互作用的常用方法，并已广泛应用于HIV研究。考虑到这一因素，当输入数据集来自scRNA-seq或HIV-宿主分子相互作用组时，图卷积网络（GCNs）可作为预测潜伏MME的一种选择。在网络嵌入的GCNs中，每个实体可被视为顶点，边揭示了从“组学”数据中得出的两个相邻顶点之间的统计相似性或相关系数。与传统CNN操作于网格状数据不同，GCNs通过学习聚合单个顶点的邻居信息来捕捉图网络内的上下文信号和关系模式。核心GCNs更新规则涉及邻接矩阵?、度矩阵D、第l层的顶点特征H^(l)、可训练权重Θ^(l)和非线性激活函数σ。当堆叠时，多层GCNs允许信息跨图流动，实现深度学习。注意力图卷积网络（Attention-based GCNs）通过调整基于特征相关性的边权重进一步扩展了它们的能力，从而产生更稳健和可解释的预测。总体而言，针对不同类型和组学数据的建议DL方法及其优缺点已在文中表格中进行了系统总结。

步骤3—优化训练策略

训练DL模型是一个迭代过程，需要仔细监控和调整。在此步骤中，选择与预测任务一致的损失函数至关重要，交叉熵损失（cross-entropy loss）是分类的标准，而均方误差（MSE）和平均绝对误差（MAE）可用于回归。原则上，通过使用高复杂度的相关特征可以提高预测准确性。同样重要的是更新模型参数以优化算法并实施正则化技术以防止过拟合。

步骤4—验证预测性能

严格评估预测准确性是确保实验质量的关键，所有基于人工智能（AI）的研究都应如此。经典指标包括精确度、召回率、F1分数、ROC曲线和曲线下面积（AUC）、R平方、平均绝对误差和均方根误差。对于小型输入数据集，建议采用交叉验证。

步骤5—利用解释和科学见解

除了完成预测任务外，至关重要的是DL模型有助于从训练模型中提取可解释的见解以验证科学问题：HIV潜伏储库是否具有独特的MME，且它们是否可预测？建议进行特征重要性分析的性能评估，如排列重要性（permutation importance）和SHAP值，以量化预测变量对预测的贡献程度。目前，由于缺乏适当的金标准，使用DL模型解释的准确性测量具有挑战性。提高预测可解释性的直接策略是将多维数据集整合用于训练预测模型。同样值得注意的是，P-NET作为一个基于患者突变数据训练的最著名的生物学启发模型，已经例证了利用神经网络架构在前列腺癌临床前发现和临床预测中的可行性。此外，应考虑到涵盖群体水平HIV 1型基因组多样性和免疫相关参数的HIV临床数据集。基于HIV 1型亚型B部分pol基因和近全长基因组序列的队列研究表明，在抑制性ART下HIV潜伏储库的遗传力约为10%–20%。同时，应纳入纵向队列的临床特征，因为已表征了伴随HIV/AIDS疾病进展的免疫参数动态。实施纵向特征可能有助于重演潜伏MME的演变。另一个加强DL模型预测可解释性的可能策略是引入注意力机制，该机制专门设计用于通过训练额外的神经网络提取输入数据的重要区域，该网络从局部特征学习每个输入位置的相对重要性，并已应用于HIV IS的预测。

讨论与结语

HIV IS的偏向性与不同水平的HIV转录相关联，使我们设想存在独特的潜伏MME。这一概念得到了临床和实验发现的支撑，表明DNA序列结合基因组和表观遗传特征、储库细胞状态以及原病毒基因组的完整性紧密束缚于HIV转录和潜伏期逆转的调节。尽管目前尚不清楚不同潜伏MME的可能性是否可以精确预测，但HIV IS预测的成功以及S2E模型的可及性强调了在不久的将来预测