反射增强型激光诱导荧光（Reflection-enhanced LIF）技术用于提升血液炎症的无标记检测能力，并通过补充的激光诱导击穿光谱（LIBS）验证方法进一步验证其有效性

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Reflection-enhanced LIF for improved label-free classification of blood inflammation with complementary LIBS validation

　　摘要
本研究介绍了一种反射增强型激光诱导荧光（RELIF）技术，用于无标记地分类血清中三种不同程度的炎症严重程度。RELIF克服了传统激光诱导荧光（LIF）的关键限制，特别是低荧光灵敏度和“前带效应”，这些问题在传统免疫测定中经常出现。在RELIF中，使用一个具有反射表面的比色皿来接收入射激光束，从而将二极管激光泵浦的荧光信号放大，放大倍数远高于标准LIF。同时，使用Q开关Nd:YAG激光对干燥的血清样本进行了互补的激光诱导击穿光谱（LIBS）测量，以验证不同炎症类别之间的元素差异。RELIF提供了更高的光谱分辨率和灵敏度，荧光信号强度大约是传统LIF的1.30倍至1.53倍。虽然标准LIF在严重炎症样本上的性能下降，但RELIF能够清晰区分所有炎症类别，捕捉到细微的光谱变化，并实现了更高的信噪比。值得注意的是，RELIF正确地将严重炎症识别为荧光信号最弱的类别，从而避免了与前带效应相关的假阴性结果，且无需样本稀释。LIBS分析通过Ca原子和CN分子的发射差异进一步支持了类别区分。使用偏最小二乘回归（PLSR）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）的多变量分析显示了高预测准确性和稳健的区分能力。通过接收者操作特征（ROC）曲线进一步评估了模型性能；基于RELIF的模型表现优于LIF，其曲线下面积（AUC）为0.94，而LIF为0.84，表明了强大的分类能力。总体而言，RELIF-LIBS组合策略提供了一种快速、经济且非破坏性的炎症分类工具。

引言
炎症是对感染、损伤或组织损伤的基本生物学反应，在多种疾病中起着核心作用。这些情况会导致发病率和死亡率的显著增加，从而造成巨大的社会经济负担[1]。因此，准确评估炎症的严重程度对于临床诊断和监测疾病进展至关重要。然而，在实际操作中，实验室对炎症的评估仍然严重依赖于医生的专业知识，这可能会引入诊断变异性和错误。传统的免疫测定和生化测试被广泛用于测量炎症生物标志物，但它们通常需要复杂的样本制备、专门的试剂和漫长的分析时间[2]。在基于血液的生物标志物中，白细胞计数、中性粒细胞和淋巴细胞百分比以及C反应蛋白（CRP）浓度是常用的指标。CRP是一种由肝脏合成的蛋白质，在血清中测量，具有很高的信息价值[3]。临床上，CRP水平通常被分为三个范围：正常/轻微（0.1–<3.0 mg/L）、中度（3.0–10 mg/L）和严重炎症（>10 mg/L）[4]。轻微的CRP升高可能出现在抑郁症、肥胖、糖尿病、妊娠、吸烟或遗传多态性等情况下。相比之下，中度的CRP升高通常与病毒或细菌感染以及重大创伤相关。而极高的CRP浓度（>50–100 mg/L）可能导致“前带效应”，即免疫测定结果出现假阴性或甚至阴性，尽管抗原水平明显升高[5]。这种现象具有严重的临床意义，包括误诊、治疗延迟和不必要的额外检测。实验室试图通过样本稀释、改进的测定设计[6]或动力学测量来缓解这一问题。这些限制激发了对快速、无标记的光学诊断技术的兴趣，这些技术可以在最小化样本损伤的情况下提供生化信息。光学方法已经在生物医学分析中显示出潜力，例如，利用全息图的三维重建来区分正常和癌变血液样本[7]。在光谱技术中，激光诱导荧光（LIF）因其高灵敏度[8]和探测内源性荧光团的能力而特别吸引人[8]。该技术被应用于各种领域，包括生物医学研究[9]、环境科学[10]、化学[11]和医学[12]。在典型的LIF实验中，单色激光激发样本，光电探测器收集发射的荧光，液体样本通常放置在一个石英或熔融石英比色皿中。然而，在高吸收或强散射的生物样本中，荧光收集效率可能受到限制，从而降低诊断灵敏度。为了克服这一问题，已经探索了几种提高灵敏度的策略，包括使用纳米颗粒[13]、量子点[14]和专门的光学配置[15, 16]。在相关的基于荧光的测定中，金或银等纳米颗粒被用来通过等离子体场增强进一步放大荧光信号[17]。然而，所有这些LIF增强方法都复杂、成本高昂，并且在纳米颗粒的情况下会对样本材料造成侵入性影响。Abdel-Harith和Abdel-Salam[18]的最新创新引入了反射增强型激光诱导荧光（RELIF）。这种简单、无标记的方法显著提高了LIF的灵敏度及其在生物医学应用中的潜力。在这种方法中，面对激发光束的比色皿壁涂有一层反射性的银或铝。这种镜面状表面将激发光束重新导向样本内部，同时将发射的荧光反射到探测器。因此，有效的激发路径长度和荧光收集效率都得到了提高。

血清中含有多种内在荧光团，包括黄素（FAD、FMN）、NADH/NADPH辅因子、芳香族氨基酸和卟啉衍生物，它们产生特征性的自荧光光谱[19]。血清成分的病理变化会改变荧光团的浓度及其微环境，从而导致荧光强度和光谱特征的可测量变化[20]。突出这些光谱变化有助于理解它们在生物医学分析中的诊断意义。作为LIF的补充，激光诱导击穿光谱（LIBS）是一种多功能的光学发射技术，在冶金[21]、制药[22]、法医学[23]和生物学[24]等领域有广泛应用。LIBS能够以最小的样本制备实现定性和定量元素分析。高功率Nd:YAG激光烧蚀样本，产生等离子体，其原子发射特征性的光谱线。这些发射通过阶梯光谱仪与积分电荷耦合器件（ICCD）相机收集，便于元素识别。先前的基于LIBS的研究已成功使用化学计量模型区分了正常和炎症血清样本[2]。Zhao等人[2]基于LIBS特征实现了血清样本的二元分类，而Abdelazeem等人[24]结合了LIF、LIBS和化学计量学进行类似的分类任务。鉴于最近的进展，本研究旨在三个关键领域增强诊断能力。首先，引入RELIF以提高荧光灵敏度，从而清晰区分三种程度的炎症：轻微、中度和严重。这一策略还有助于克服严重情况下可能出现的前带效应。其次，RELIF（提供分子和荧光团对比度）将与LIBS（提供元素和蛋白质相关对比度）结合，以交叉验证得到的光谱特征。最后，将报告定量增强因子和化学计量指标，以证明在不同炎症类别之间可靠的、可重复的区分能力，从而支持更自信、一致的诊断决策。

材料与方法
样品收集与制备
本研究中使用的血清样本来自开罗大学的Al-Kasr Al-Aini医院。这些样本的收集方案获得了开罗大学“NILES伦理委员会”的伦理批准。为了将血液转化为血清，样本被收集在微量离心管中，并在室温下孵育15–30分钟以凝固。然后通过将试管在冷藏单元中离心10分钟来分离凝块。离心后立即使用移液管将血清小心转移到新的微量离心管中。对于短期使用，收集的血清应保持在2–8°C。对于长时间存储，建议温度低于-20°C，因为反复的冻融循环会降解许多血清成分。在本研究中，选择了三个不同的CRP范围以最大化光谱区分：正常/轻微炎症（0.1–2.8 mg/L）、中度炎症（5–50 mg/L）和严重炎症（>100 mg/L）。尽管标准临床实践通常使用不同的阈值，但选择这些特定范围是为了研究具有明显生化特征的极端情况。值得注意的是，每个类别我们测试了25个样本，每个样本测量10次。然后对每个类别的测量结果进行平均。

实验装置
图1所示的RELIF实验装置包括一个波长为405 nm的连续波（CW）激光器、一个镀层的比色皿、两个焦距为100 mm的聚焦透镜（FL）、一根光纤（FO）电缆和一个光谱仪。激光源由长春新产业光电技术有限公司（中国）制造。5 mW的激光束聚焦在石英比色皿中的样本上。使用的比色皿尺寸为12.5 mm × 12.5 mm × 45 mm（宽×深×高）。其一侧涂有一层薄铝（Al），该涂层由热涂层单元（Edwards E306，英国）沉积，并配备了厚度监测控制功能[18]。涂层表面经过目视检查后，外部添加了一层隔离层以防止机械划痕和空气氧化。镜面层的厚度为300 nm。荧光发射通过FO电缆垂直于入射激光束聚焦并收集，然后传入光谱仪（USB2000 FLG，Ocean Optics，美国）。它由内置的CCD相机检测，并传输到笔记本电脑。使用商业软件SpectraSuit（OceanOptics，美国）处理收集到的荧光光谱。对于每个诊断类别，分析了25个独立样本，每个样本记录10次技术重复测量。这些测量结果被平均以生成每个类别的代表性光谱轮廓。为了确保RELIF信号的可重复性，我们实施了严格的方案，包括标准化的样本清洗和使用定制设计的支架来固定激发和收集几何结构。此外，在数据采集过程中持续监测激光稳定性和环境条件，以减少实验漂移。

图1
反射增强型激光诱导荧光（RELIF）实验装置的示意图。CW激光器，连续波激光；FL，焦距为100 mm的聚焦平凸透镜；FO，光纤。

LIBS装置
图2显示了LIBS实验装置的示意图；更多技术细节见[25]。简而言之，该系统使用一个Q开关Nd:YAG激光器（Brio，Quantel，法国），工作波长为1064 nm，输出50 mJ、5-ns的脉冲，重复率为20 Hz。光学路径包括一个聚焦透镜（FL）、信号收集光学系统和一个与积分电荷耦合器件（ICCD）相机相连的阶梯光谱仪，用于高分辨率光谱采集。

图2
激光诱导击穿光谱（LIBS）实验装置的示意图。FL：焦距为100毫米的平凸透镜；FO：光纤；S：样品；ICCD：增强型电荷耦合器件。血清样品被分配到无灰滤纸（厚度176微米，Whatman，Maidstone，英国）上直至完全吸收，然后在干燥空气中放置约15分钟，以确保纸上的吸收完全。激光脉冲通过焦距为100毫米的平凸透镜聚焦到血清样品上。样品位置通过XY微调平台进行控制。激光脉冲以单脉冲的形式发射十次，每次脉冲之间相隔20微米。这个过程在样品表面的五个位置重复进行，以收集50个光谱。收集到的50个光谱被平均处理，以补偿表面的不均匀性。使用一根长度为2米、芯径为600微米的光纤（FO）来收集激光诱导等离子体发出的光。光纤被引入到阶梯光谱仪（Mechelle 7500，Multichannel Instruments，瑞典）的入口狭缝中，该光谱仪连接到一个ICCD相机（DiCAM-Pro，PCO，Computer Optics，德国）作为检测器。在收集光谱时，使用了2500纳秒的最佳门宽和1500纳秒的延迟时间来限制连续谱的发射。光谱处理和不同元素光谱线的识别是使用商业软件LIBS++ [26]完成的。

结果与讨论
在本研究中，血清样品是使用全自动临床化学分析仪（Beckman AU480，美国）进行测量的。该分析仪基于浊度测量技术[27]。这是一种通过测量光通过溶液时的衰减程度来估计溶液的浑浊度或浑浊程度的分析技术。系统测量悬浮在溶液中的颗粒散射或吸收的光量。根据估计的CRP值，结果分为三个不同的类别，每个类别包含25个样品。轻度/中度炎症的CRP值在0.1 mg/L到2.8 mg/L之间。中度炎症的CRP值在5 mg/L到50 mg/L之间。重度炎症的CRP值>100 mg/L。收集的样品来自44至47岁的女性。限制人口统计范围最小化了与年龄和性别相关的生物学变异性。这使我们能够确保观察到的光谱差异主要与炎症的严重程度有关。
应当注意的是，CRP值的范围被有意选为0.1–2.8 mg/L（轻度）、5–50 mg/L（中度）和>100 mg/L（重度），以最大化光谱区分度，并研究具有明显生化特征的极端情况。重要的是，选择这两个较高类别（中度和重度）来测试RELIF克服前带效应的能力，这种效应在CRP浓度超过50–100 mg/L时很常见。

使用LIF和RELIF进行的光谱研究
总共分析了七十五个血清样品，每个样品测量了十次，并对得到的光谱进行了平均处理。所有测量都是在405纳米的激发波长下进行的。图3(a)、(b)和(c)展示了LIF和RELIF为这三个样品类别获得的荧光信号。总体而言，RELIF技术在轻度/中度炎症组中将荧光信号强度提高了1.30倍，在中度炎症组中提高了1.53倍，在重度炎症组中提高了1.29倍。

图3
(a)正常/轻度炎症，(b)中度炎症，(c)重度炎症的LIF和RELIF光谱比较。(d)三个类别的强度箱形图。(e)三个类别的强度箱形图
图3(d)比较了三个炎症类别的荧光响应。数据显示，荧光信号强度随炎症程度的不同而有显著变化。中度炎症显示出最强的荧光信号，峰值强度在518纳米处，而正常/轻度炎症类别的信号较弱。这种趋势可以通过炎症进展过程中血清中荧光生物分子浓度的变化来解释。518纳米附近的峰值主要归因于黄素（FAD/FMN）和氧化脂色素。在炎症氧化应激期间，NADH与黄素（氧化还原）的比例发生变化，这解释了在重度炎症组观察到的荧光光谱的减弱[19]。在重度炎症中，CRP浓度超过100 mg/L时，荧光信号显著降低。这可以归因于多种机制：(i) 在较高CRP浓度（即>100 mg/L）时，内源性淬灭剂的积累。(ii) 蛋白质聚集（高浓度CRP和急性期蛋白质）形成聚集体，减少了荧光团的浓度并增加了光散射。这反过来导致激发光子和发射光子的衰减。值得注意的是，测量是在比色皿中的标准化工作体积的未稀释血清样品上进行的，并且在相同条件下比较了三个类别的原始光谱。

图3(e)展示了一个强度（a.u.）的箱形图，有助于标准化测量并减少变异性。箱形图清楚地根据450–750纳米波长范围内的强度区分了三个类别。结果显示，正常/轻度炎症类别的强度范围相对较窄，中度类别的强度范围明显较宽，而重度类别的强度最低。通过使用反射增强型激光诱导荧光（RELIF）这种非免疫学、无标记技术，可以有效地克服前带效应。与传统免疫学方法不同，RELIF通过其独特的光学配置（具有镜面般的反射表面）来减轻这种效应。该表面将剩余的激发激光束反射通过样品，有效地使激发路径长度加倍，增加了荧光团激发的概率。这种机制通过重新激发样品并捕获原本会因自吸收或血清样品的浑浊而丢失的光子来补偿信号损失。因此，信噪比得到充分增强，可以检测到在标准LIF配置中通常产生最弱信号的重度炎症样品。通过这种方式，RELIF防止了与标准LIF [20] 相关的假阴性结果。这种便携且成本效益高的系统集成了一个一次性反射比色皿、一个紧凑的连续波（CW）激光器和光纤检测器，能够在临床环境中实现实时、现场分类血清。

接收者操作特征（ROC）曲线
为了评估学习模型的预测性能，使用了接收者操作特征（ROC）曲线。这些曲线展示了灵敏度和特异性之间的权衡，提供了关于每个模型在区分健康个体（正常）、中度患者和重度患者方面的能力的清晰见解。通过检查灵敏度、特异性、真阳性率和真阴性率，并考虑这些指标之间的关系，来评估整体模型性能。然后使用曲线下面积（AUC）来数值总结每个模型的分类性能，接近1.0的值表示在正例和负例之间的优秀区分能力[28]。如图4所示，每个模型的AUC值反映了它们区分正常、中度和重度类别的能力。在评估的模型中，RELIF和LIF的表现最好，AUC得分分别为0.94和0.84。这些发现表明RELIF模型在三个临床类别中的区分能力优于LIF模型。这也验证了反射增强配置在克服前带效应方面的有效性，这种效应在CRP浓度超过50–100 mg/L时很常见。

图4
RELIF（绿色）与LIF（蓝色）在炎症严重程度分类上的ROC分析。RELIF显示出更高的曲线下面积（AUC），表明其诊断性能更优越。红色标记表示最佳切点；RELIF模型的灵敏度约为80%，假阳性率显著较低。

LIBS结果
图5(a)显示了轻度、中度和重度炎症类别的LIBS光谱，每个光谱代表25次测量的平均值。图5(b)突出了三个类别中碳（C）、氰化物（CN）带和钙（Ca）的关键光谱特征。
在247.8纳米处的碳发射线（上图）在中度和重度炎症类别的光谱中清晰可见，但在轻度炎症类别中基本不存在。同样，386纳米处的CN分子带（中图）在三个组之间显示出明显的强度差异。尽管部分CN发射是通过碳和氮的重组由等离子体诱导的，但其强度也反映了血清中的总体蛋白质和氨基酸含量。422.7纳米处的Ca线（下图）也显示出类似的强度变化，有助于区分炎症程度。
重度炎症光谱中明显的CN带表明蛋白质含量高于中度和轻度组。C反应蛋白（CRP），作为炎症的关键生物标志物，是这种蛋白质负荷增加的主要贡献者。值得注意的是，LIBS得出的蛋白质估计值与实验室测量的CRP浓度吻合良好。重度炎症中C（247.8纳米）和Ca（422.7纳米）发射线的强度增加进一步支持了这种关联。总的来说，这些相关性表明LIBS可以作为快速、无损的确认工具，用于评估CRP水平以及更广泛的生物样本中的蛋白质含量。
光谱强度与炎症严重程度之间的定量关系强调了LIBS的诊断潜力。与传统的生化测定方法相比，LIBS提供了几个实际优势，包括最小的样品准备、近乎实时的分析和降低的每次测试成本。此外，基于LIBS的指标与参考CRP测量之间的强一致性证实了该技术的分析可靠性。
最后，图5(c)和(d)中的条形图定量展示了CN和Ca强度差异的统计显著性。重度炎症类别的CN强度大约是轻度炎症类别的2–3倍，Ca强度大约是3.5倍。这些明显的对比突出了LIBS在区分不同炎症程度方面的灵敏度和精确度。

偏最小二乘回归
偏最小二乘（PLS）是一种多变量统计技术，它结合了主成分分析和多元回归的特点。它在保持预测因子和结果之间关系的同时有效地降低了维度[29]。使用OriginPro 2021中的“PLS”函数对实验数据进行了偏最小二乘回归（PLSR）的统计分析。PLSR模型通过三个PLS组件进行了优化，以实现模型复杂性和预测准确性之间的最佳平衡。
图6(a)、(b)和(c)中显示的RELIF结果的PLS模型在三个炎症类别中表现出色。实际光谱数据与拟合预测值之间的方差产生了较高的决定系数（R2），分别为轻度炎症类别0.93、中度炎症类别0.96和重度炎症类别0.90。中度炎症类别的R2值为0.96，表明其可预测性最高。获得的结果表明RELIF光谱技术可以可靠地预测三个炎症类别的荧光强度。

图5
(a)轻度、中度和重度炎症类别的LIBS光谱。(b) 三个炎症类别中碳（C）247.8纳米原子线（上）、氰化物（CN）带（中）和钙（Ca）422.8纳米原子线（下）的比较。(c) 和 (d) 三个类别中CN和Ca元素的箱形图
同样，LIBS结果的PLS模型在三个炎症类别中也表现出色。R2值分别为0.92、0.99和0.98（见图6(d)、(e)和(f)）。中度炎症的异常高的R2值表明该类别可能在三个类别中具有最独特的光谱特征，这与RELIF技术的PLS结果完全一致。这种PLS分析表明RELIF和LIBS技术都可以可靠地区分不同程度的炎症严重性。这三个类别的高R2值表明所提出的技术可以发展为定量诊断工具，有可能替代传统的炎症检测方法。

偏最小二乘判别分析（PLS-DA）
为了进一步验证RELIF和LIBS技术的判别能力，对其光谱数据进行了偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。PLS-DA是一种监督多变量分类方法，通过将原始光谱变量映射到由潜在变量（组件）定义的较低维空间来最大化不同类别之间的分离[30]。图7展示了PLS-DA得分图，显示了三个炎症类别在第一和第二两个组分（组分1和组分2）上的分布情况。图7(a)展示了RELIF光谱数据的PLS-DA结果，组分1和组分2的方差分别为99.9%和0.096%。图7(b)展示了LIBS光谱数据的PLS-DA结果，组分1和组分2的方差分别为80.6%和19.4%。所获得的结果显示了出色的类别分离效果，没有重叠现象。每个类别都表现出紧密的聚集，表明它们之间具有高度相似性和强烈的区分度。PLS-DA对RELIF光谱数据实现的清晰分离证实了其光谱特征包含了足够的区分信息，可以可靠地对这三个类别进行分类。这种分类性能支持了RELIF作为快速、无创诊断工具的临床适用性。仅通过两个组分就实现了这样的分离效果，表明炎症类别之间的光谱差异是稳健且无噪声的，进一步验证了RELIF技术的有效性。该模型使用了交叉验证测试[31]进行验证，在该测试中，每个炎症类别的数据集（每个类别25个样本）被迭代地划分为训练集和测试集。在本研究中，我们在每个类别内部采用了留一法交叉验证（LOOCV）。在每次迭代中，一个样本被保留作为测试观测值，模型在剩余样本上进行训练，然后对保留的样本进行预测。这个过程对每个类别的25个样本都重复进行。

图6的替代文本可能是使用AI生成的。

图7的替代文本可能是使用AI生成的。

PLS-DA得分图显示了基于(a) RELIF光谱数据（组分1和组分2的方差分别为99.9%和0.096%）和(b) LIBS光谱数据（组分1和组分2的方差分别为80.6%和19.4%）的三个炎症类别的清晰分离。图(c)和(d)的混淆矩阵量化了模型的预测性能，基于RELIF和LIBS的模型总体准确率分别为86.67%和73.33%。

图7的替代文本可能是使用AI生成的。

PLS-DA得分图基于(a) RELIF光谱数据和(b) LIBS光谱数据，分别显示了三个炎症类别的清晰分离。RELIF光谱数据的组分1和组分2的方差为99.9%和0.096%，LIBS光谱数据的组分1和组分2的方差为80.6%和19.4%。混淆矩阵(c)和(d)总结了模型的预测性能：RELIF数据在正常类别上的准确率为100%，在中度和严重炎症类别上的准确率分别为80%，总体准确率为86.67%；而LIBS数据在正常类别上的准确率为68%，在中度炎症类别上的准确率为72%，在严重炎症类别上的准确率为80%，总体准确率为73.33%。这些结果表明，尽管两种技术都有效，但基于RELIF的模型在这种特定的分类任务上提供了更优越的预测性能。

结论

本研究展示了两种光谱化学技术——反射增强激光诱导荧光（RELIF）和激光诱导击穿光谱（LIBS）在人类血清中分类炎症严重程度方面的成功应用。RELIF使用405纳米的激发光，产生了518纳米的特征发射峰，其强度随炎症阶段系统性地变化：中度炎症产生的信号最强，轻度炎症产生的信号中等，重度炎症产生的信号最弱。这些光谱趋势与荧光生物分子浓度的变化、淬灭剂的积累以及疾病进展过程中荧光团的结构变化一致。反射增强比色皿设计使荧光强度提高了大约1.30倍至1.53倍，从而提高了灵敏度，增强了信噪比，并减轻了前带效应。箱形图分析进一步证实了不同炎症类别之间的光谱分布差异，突显了RELIF的诊断稳健性。LIBS提供了补充的元素和分子信息，揭示了钙（Ca）原子线和氰化物（CN）分子带强度的显著差异。重度炎症与最高的Ca和CN水平相关，定量分析显示CN强度比轻度炎症高2-3倍，Ca强度高3.5倍。这些元素标记增强了分类框架的可靠性。使用偏最小二乘回归（PLSR）进行的统计验证显示了出色的预测准确性（LIF的R2值为0.90-0.96；LIBS的R2值为0.92-0.99），而偏最小二乘判别分析（PLS-DA）确认了类别之间的清晰分离。接收者操作特征（ROC）曲线进一步验证了RELIF相比传统LIF更优越的区分性能。

总体而言，RELIF和LIBS构成了互补的诊断策略。RELIF提供了快速、无标记、非破坏性的筛查方法，并具有增强的荧光灵敏度，特别适合常规监测和初步评估。其简单的低成本配置可以使用紧凑型激光器和光学组件进行微型化，从而实现便携式、实时的临床或初级护理环境中的分类。LIBS虽然更为复杂且资源需求更高，但它提供了确认性的元素和分子特异性，特别是对于与炎症严重程度密切相关的标记物（如Ca和CN）。因此，RELIF作为高效的一线筛查工具，而LIBS则通过生化验证增强了诊断的信心。通过结合分子灵敏度和元素特异性，这种双光谱化学方法实现了炎症状态的快速分类和定量验证。这一综合框架为开发非侵入性、成本效益高且可靠的炎症诊断和监测工具带来了巨大潜力。