一种用于定量细胞内半胱氨酸的亲水相互作用液相色谱-串联质谱方法及其在半胱氨酸沉积症研究中的应用

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：A hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the quantification of intracellular cystine and its application in cystinosis research

　　摘要：半胱氨酸贮积症是一种罕见的溶酶体贮积性疾病，由编码溶酶体半胱氨酸转运蛋白的CTNS基因突变引起，导致溶酶体内半胱氨酸积累，这是该病的典型表型特征，并伴随细胞功能逐渐衰退。因此，准确量化半胱氨酸水平对于评估溶酶体转运缺陷和治疗反应至关重要。体外细胞模型为研究疾病机制和评估新兴治疗策略提供了可控的平台。为了确定这些模型中的细胞内半胱氨酸浓度，需要适当的样品制备、储存以及高灵敏度的分析方法。在这项工作中，我们开发了一种快速亲水相互作用液相色谱-串联质谱（HILIC-MS/MS）方法，用于直接测定细胞提取物中的半胱氨酸含量。使用PEEK内衬的HILIC-Z柱对于减少金属引起的峰尾效应和提高色谱性能至关重要。5分钟的总运行时间使得高通量分析成为可能，从而有助于在细胞系统中高效筛选新的治疗方法。验证结果显示该方法具有出色的线性（R2≥0.9986）和较低的定量限（LLOQ）为12.5 nM，比报道的反相LC方法提高了8倍以上。在细胞裂解前加入N-乙基马来酰亚胺（NEM）能有效限制半胱氨酸的氧化并保持样品在4°C下的稳定性。该方法在同源的HEK293T细胞模型中得到了应用，CTNS敲除（KO）细胞的细胞内半胱氨酸水平显著高于野生型（WT）细胞。作为额外的对照，通过半胱胺治疗或慢病毒载体（LV）介导的CTNS蛋白重新表达后，半胱氨酸水平成功恢复。因此，所开发的方法为半胱氨酸贮积症研究中新型治疗策略的体外评估提供了一个灵敏且可靠的分析平台。

引言：半胱氨酸贮积症是一种罕见的常染色体隐性溶酶体贮积性疾病，由编码溶酶体半胱氨酸转运蛋白CTNS基因的突变引起，导致溶酶体内半胱氨酸积累，这是该病的典型表型特征，并伴随细胞功能逐渐衰退。因此，准确量化半胱氨酸水平对于评估溶酶体转运缺陷和治疗反应至关重要。体外细胞模型为研究疾病机制和评估新兴治疗策略提供了可控的平台。为了确定这些模型中的细胞内半胱氨酸浓度，需要适当的样品制备、储存以及高灵敏度的分析方法。在这项工作中，我们开发了一种快速亲水相互作用液相色谱-串联质谱（HILIC-MS/MS）方法，用于直接测定细胞提取物中的半胱氨酸含量。使用PEEK内衬的HILIC-Z柱对于减少金属引起的峰尾效应和提高色谱性能至关重要。5分钟的总运行时间使得高通量分析成为可能，从而有助于在细胞系统中高效筛选新的治疗方法。验证结果显示该方法具有出色的线性（R2≥0.9986）和较低的定量限（LLOQ）为12.5 nM，比报道的反相LC方法提高了8倍以上。在细胞裂解前加入N-乙基马来酰亚胺（NEM）能有效限制半胱氨酸的氧化并保持样品在4°C下的稳定性。该方法在同源的HEK293T细胞模型中得到了应用，CTNS敲除（KO）细胞的细胞内半胱氨酸水平显著高于野生型（WT）细胞。作为额外的对照，通过半胱胺治疗或慢病毒载体（LV）介导的CTNS蛋白重新表达后，半胱氨酸水平成功恢复。因此，所开发的方法为半胱氨酸贮积症研究中新型治疗策略的体外评估提供了一个灵敏且可靠的分析平台。

半胱氨酸贮积症是一种罕见的常染色体隐性溶酶体贮积性疾病，由编码溶酶体半胱氨酸转运蛋白CTNS基因的突变引起，导致溶酶体内半胱氨酸积累，这是该病的典型表型特征，并伴随细胞功能逐渐衰退。因此，准确量化半胱氨酸水平对于评估溶酶体转运缺陷和治疗反应至关重要。体外细胞模型为研究疾病机制和评估新兴治疗策略提供了可控的平台。为了确定这些模型中的细胞内半胱氨酸浓度，需要适当的样品制备、储存以及高灵敏度的分析方法。在这项工作中，我们开发了一种快速亲水相互作用液相色谱-串联质谱（HILIC-MS）方法，用于直接测定细胞提取物中的半胱氨酸含量。使用PEEK内衬的HILIC-Z柱对于减少金属引起的峰尾效应和提高色谱性能至关重要。5分钟的总运行时间使得高通量分析成为可能，从而有助于在细胞系统中高效筛选新的治疗方法。验证结果显示该方法具有出色的线性（R2≥0.9986）和较低的定量限（LLOQ）为12.5 nM，比报道的反相LC方法提高了8倍以上。在细胞裂解前加入N-乙基马来酰亚胺（NEM）能有效限制半胱氨酸的氧化并保持样品在4°C下的稳定性。该方法在同源的HEK293T细胞模型中得到了应用，CTNS敲除（KO）细胞的细胞内半胱氨酸水平显著高于野生型（WT）细胞。作为额外的对照，通过半胱胺治疗或慢病毒载体（LV）介导的CTNS蛋白重新表达后，半胱氨酸水平成功恢复。因此，所开发的方法为半胱氨酸贮积症研究中新型治疗策略的体外评估提供了一个灵敏且可靠的分析平台。

半胱氨酸贮积症是一种罕见的常染色体隐性溶酶体贮积性疾病，由编码溶酶体半胱氨酸转运蛋白CTNS基因的突变引起，导致溶酶体内半胱氨酸积累，这是该病的典型表型特征，并伴随细胞功能逐渐衰退。因此，准确量化半胱氨酸水平对于评估溶酶体转运缺陷和治疗反应至关重要。体外细胞模型为研究疾病机制和评估新兴治疗策略提供了可控的平台。为了确定这些模型中的细胞内半胱氨酸浓度，需要适当的样品制备、储存以及高灵敏度的分析方法。在这项工作中，我们开发了一种快速亲水相互作用液相色谱-串联质谱（HILIC-MS）方法，用于直接测定细胞提取物中的半胱氨酸含量。使用PEEK内衬的HILIC-Z柱对于减少金属引起的峰尾效应和提高色谱性能至关重要。5分钟的总运行时间使得高通量分析成为可能，从而有助于在细胞系统中高效筛选新的治疗方法。验证结果显示该方法具有出色的线性（R2≥0.9986）和较低的定量限（LLOQ）为12.5 nM，比报道的反相LC方法提高了8倍以上。在细胞裂解前加入N-乙基马来酰亚胺（NEM）能有效限制半胱氨酸的氧化并保持样品在4°C下的稳定性。该方法在同源的HEK293T细胞模型中得到了应用，CTNS敲除（KO）细胞的细胞内半胱氨酸水平显著高于野生型（WT）细胞。作为额外的对照，通过半胱胺治疗或慢病毒载体（LV）介导的CTNS蛋白重新表达后，半胱氨酸水平成功恢复。因此，所开发的方法为半胱氨酸贮积症研究中新型治疗策略的体外评估提供了一个灵敏且可靠的分析平台。

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细胞样品制备：
从Synthergo（美国加利福尼亚州）购买了一个HEK293T克隆。使用Nanoblades和CRISPR-Cas9技术，针对CTNS的第4外显子生成了CTNS敲除（KO）细胞，该方法之前由Medaer等人描述过[35]。所有细胞都在添加了8%胎牛血清（Gibco?，Thermo Scientific，比利时Dilbeek）和50 μg/mL庆大霉素（Gibco?，Thermo Scientific）的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。细胞在37°C和5%（v/v）CO2的条件下生长。

人类CTNS编码序列在其3′端被标记了一个双血凝素标签序列（2HA tag）和一个HiBiT序列，并被克隆到Medaer等人之前报道的自失活慢病毒（SIN-LV）骨架中[36]。慢病毒载体（LVs）被生产出来，CTNS KO细胞按照Medaer等人之前的方法进行处理[35]。

代谢提取：
为了进行代谢提取，使用Z1粒子计数器（Beckman Coulter，美国Brea）对细胞进行计数，并将26,000个细胞/cm2接种到6孔板上。如果需要，细胞在接种后24小时用100 μM的半胱胺处理。在处理细胞之前，半胱胺溶液通过0.22-μm的Millex注射器孔径过滤器（Merck，德国Darmstadt）过滤。48小时后，用0.9% NaCl溶解在Milli-Q水中的溶液清洗细胞一次。细胞在冰上（4°C）与提取溶液一起孵育2分钟，以最小化酶活性。提取溶液由80%甲醇组成，这有助于破坏细胞膜并有效释放细胞内代谢物。对于在裂解后添加NEM的条件，将在不含NEM的提取溶液孵育2分钟后，加入100 μL的5 mM NEM PBS溶液。使用细胞刮刀将提取物转移到Eppendorf管中。蛋白质通过4°C下20,000 × g的离心作用沉淀出来，然后使用Pierce? BCA蛋白测定法（Thermo Scientific）测定其浓度。上清液转移到新的Eppendorf管中，并在-80°C下储存，直到进行LC-MS分析。在LC-MS分析之前，样品在室温下解冻，并直接在瓶插管中以1:10的比例稀释到流动相中（Agilent）。稀释后的样品进行三次重复分析。

方法验证：
方法验证是根据欧洲药品管理局（EMA）的生物分析方法验证指南[37]进行的。验证包括选择性、定量下限（LLOQ）、线性、精度、准确性和基质效应的评估。此外，还评估了使用NEM来防止样品制备和储存过程中半胱氨酸氧化为胱氨酸的效果。

选择性：
通过分析加入和未加入NEM的提取溶液来评估选择性，以评估半胱氨酸及其IS保留时间处的潜在干扰。监测定量和定性MRM跃迁，以检测潜在的共洗脱化合物。此外，还确定了离子比率（定性/定量）并将其与校准标准品获得的比率进行比较，以验证分析物的身份。

线性、检测限（LOD）和定量下限（LLOQ）：
通过绘制半胱氨酸与IS的峰面积比率与校准标准品浓度（6.25、12.5、25、50、100、200和400 nM）的关系来评估线性。应用最小二乘线性回归来描述信号响应与浓度之间的关系。使用决定系数（R2）来评估拟合度。灵敏度是通过基于信噪比3:1和10:1分别计算检测限（LOD）和LLOQ来确定的。

精度和准确性：
通过在LLOQ（12.5 nM）以及低（20 nM）、中（150 nM）和高（350 nM）浓度水平下分析半胱氨酸QC样品来评估准确性和精度。在同一天对同一样品进行五次重复注射，以评估日内（运行内）的准确性和精度。对于日间（运行间）的准确性和精度，分别在三天内新鲜制备重复样品，并对每个样品进行五次重复注射。准确性基于与标称值的偏差来计算，而精度则表示为重复测量的相对标准偏差（RSD%）。

内标回收率和基质效应评估：
评估回收率和基质效应，以评估样品制备方法的性能以及基质对电离效率的潜在影响。因为IS是在提取前以已知浓度添加的，所以通过比较提取前后添加的样品的峰面积来确定其回收率。通过将提取前添加的样品与提取后添加等浓度（50 nM）的样品的峰面积进行比较来确定IS的回收率。使用标准添加曲线来评估基质效应，该曲线是通过将已知浓度（100、200和400 nM）的半胱氨酸添加到三种独立的野生型（WT）HEK293T细胞提取物中获得的，然后将其稀释10倍。通过绘制峰面积比率（半胱氨酸/IS）与添加的半胱氨酸浓度来构建标准添加曲线。通过比较标准添加曲线（SlopeMATRIX）和流动相中的标准曲线（SlopeMOBILE PHASE）在相同浓度范围内的斜率来计算ME：$$\begin{array}{c}ME \left(\text{\%}\right)=\frac{{\text{Slope}}_{\text{MATRIX}}}{{\text{Slope}}_{\text{MOBILE PHASE}}} \times 100\%\end{array}$$ （1）

N-乙基马来酰亚胺（NEM）对半胱氨酸保存和稳定性的影响：
为了研究NEM对半胱氨酸稳定性的影响，在WT和CTNS KO HEK293T细胞裂解前和裂解后都添加了NEM，并与未经处理的对照组进行了比较。所有条件都进行了三次重复实验，除了裂解前添加NEM的样品（n = 6），并且立即进行了分析。此外，未添加和添加NEM的样品分别在三种不同温度（4°C、-20°C和-80°C）下储存了1周和1个月。使用经过验证的HILIC-MS/MS方法对半胱氨酸浓度进行了三次重复测量。统计比较使用了两因素ANOVA和Benjamini、Krieger和Yekutieli的两阶段设置方法进行错误发现率的校正。

统计分析：
除非另有说明，数据以平均值±标准偏差（SD）的形式呈现，每个组中的个别数据点也显示出来（生物重复）。使用GraphPad 10.4.2绘制所有图表并进行统计分析。

结果和讨论：
方法优化：用于半胱氨酸评估的HILIC-MS：
这项工作的主要目标是开发一种稳健的HILIC-MS方法，该方法在生物基质中对半胱氨酸具有增强的保留和电离效率，同时最小化分析时间并消除衍生化。这是由于现有基于RPLC的方法的局限性（需要衍生化且保留效果不佳）以及现有HILIC方法对半胱氨酸分析的灵敏度不足[12, 14, 15, 16, 17, 19, 33]。

选择Poroshell HILIC-Z柱是基于这样一个假设：在酸性pH下，半胱氨酸的正电荷氨基会与两性离子固定相的负电荷磺酸基团相互作用。半胱氨酸的极性官能团与固定相表面富水层之间的亲水分配也有助于保留。为了研究流动相酸度对保留和峰形的影响，系统地调整了pH值。向水相（pH 2.7，流动相的20%）和有机相（ACN）中各添加0.1% FA，提高了正ESI模式下的电离效率。将含有0.1% FA的水相pH调整到4，并用氢氧化铵处理后，保留时间增加，峰宽减小。随后，逐步将流动相中的水含量从20%增加到30%，以研究其对保留和峰形的影响。最终选定的等度流动相组成是27%水相（0.1% FA，pH 4）和73%有机相（0.1% FA在ACN中），因为它提供了足够的保留时间，同时产生了最窄的峰宽（图1a）。

图1：
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

全尺寸图像：
代表性的半胱氨酸（400 nM；1 μL注射体积）的MRM色谱图，在（a）PEEK涂层的HILIC-Z柱（150 × 2.1 mm；2.7 μm）和（b）非PEEK涂层的HILIC-Z柱（50 × 2.1 mm；1.9 μm）上获得。流动相（27:73，v/v）由0.1% FA在水（pH 4.0，用氢氧化铵调节）和0.1% FA在ACN中组成，操作流速为0.6 mL/min，柱温为30°C。

在优化的色谱条件下，使用非PEEK涂层的柱子观察到明显的拖尾（图1b），而使用PEEK涂层的柱子获得了更对称的峰形（图1a）。这也反映在峰拖尾因子（T）上，使用公式（2）计算得出：$$\begin{array}{c}T =\frac{{W}_{0.05}}{2 f}\end{array}$$ （2）其中W0.05代表峰高5%处的峰宽，f是从峰顶到峰高5%处的前沿的距离。非PEEK涂层的柱子的拖尾因子T = 3.4，而PEEK涂层的柱子的T值显著改善为1.6，表明峰对称性显著提高。这种色谱性能的改进也反映在半胱氨酸的回收率上，该回收率在两个浓度（25 nM和400 nM）下进行了测定。通过比较两种柱子上获得的峰面积与不使用柱子（即使用零死体积联结）获得的峰面积来评估回收率。对于PEEK涂层的柱子，回收率分别为96%和92%，表明分析物的损失最小。相比之下，非PEEK涂层的柱子在较低浓度下导致回收率分别为77%和94%，表明半胱氨酸有显著损失。这些观察结果突显了在半胱氨酸分析中减少与暴露金属表面的二次相互作用的重要性。在传统的不锈钢柱中，金属位点可能通过吸附机制与极性分析物相互作用。这对于半胱氨酸尤其相关，因为它的氨基和羧基可以促进这种相互作用。相比之下，PEEK涂层的柱子提供了无金属的流动路径，因为柱子的内部表面涂有PEEK，从而最小化了分析物与金属表面的相互作用[38]。注意，图1a和b之间的保留时间差异是由于非PEEK涂层的柱子长度为50 mm，而PEEK涂层的柱子长度为150 mm。

等度洗脱被认为有利于常规分析，因为它消除了柱子重新平衡的需要，并缩短了总体运行时间[39]。在注射超过200个样品后没有观察到保留时间的变化（RSD = 0.4%），并且在注射高浓度样品（400 nM）后直接分析空白样品时没有观察到携带效应（数据未显示）。评估了0.5到0.7 mL/min之间的流速，但只观察到对峰形的轻微影响。最终选择了0.6 mL/min的流速，导致半胱氨酸的保留时间为3.37分钟，总运行时间为5分钟。

分析方法验证：
通过分析加入和未加入NEM的提取溶液来确认方法的选择性。在半胱氨酸或其IS的保留时间处没有检测到干扰峰（数据未显示）。实际研究样品中定性跃迁和定量跃迁之间的离子比率与校准标准品中观察到的比率一致，表明该方法具有选择性且无基质相关的干扰。

线性：
该方法在12.5–400 nM的浓度范围内表现出良好的线性，R2 ≥ 0.9986。残差分析显示在校准范围内没有系统偏差，证实了回归模型的适用性。

准确性和精度：
方法在LLOQ和三个QC水平下的准确性和精度在表2中报告。日内精度范围为4%到10%，而日间精度范围为2%到10%，表明方法具有良好的重复性。同样，LLOQ下的日内准确率为82%，而对于QC样品，其范围为93%到103%。日间准确率为LLOQ下的84%，而对于QC样品，其范围为91%到101%。这些结果表明该方法在测试条件下提供了可靠的半胱氨酸定量。精度性能归因于一致的保留和稳定的电离响应。表2 在LLOQ、低、中、高浓度水平（12.5、20、150和350 nM）下测定的半胱氨酸的日内和日间精度和准确度结果
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检测限（LOD）和定量下限（LLOQ）
通过确定LOD和LLOQ来评估方法的灵敏度。LOD为5 nM，而LLOQ定义为满足可接受精度（≤15% RSD）和准确度（80–120%）的最低浓度，为12.5 nM。与之前报道的RPLC方法相比，这代表了至少8倍的灵敏度提升，同时考虑了注射体积的差异（表3）[12, 16, 19]。图2显示了在LLOQ下的代表性色谱图（提取缓冲液中的标准溶液）和真实研究样本的色谱图，证明了足够的信号强度。所获得的高灵敏度可以归因于几个分析因素。HILIC-Z固定相为半胱氨酸提供了足够的保留时间，从而改善了与内源性基质成分的色谱分离[40]。此外，使用PEEK内衬的柱子提高了峰的对称性并减少了拖尾现象。此外，表面多孔颗粒由于柱高减少而使峰形更加锐利，增强了信号强度[30, 31, 41]。

表3 报告的LC-MS/MS方法用于半胱氨酸定量

图2
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在PEEK内衬的HILIC-Z柱（150 × 2.1 mm；2.7 μm）上获得的半胱氨酸（1 μL注射体积）的代表性MRM色谱图。(a) LLOQ（12.5 nM）下的样本和(b) 真实研究样本。流动相（27:73，v/v）由0.1% FA在水（pH 4.0，用氢氧化铵调节）和0.1% FA在ACN中组成，流速为0.6 mL/min，柱温为30°C

回收率和基质效应
IS（50 nM）的回收率为94%，表明在样品制备过程中损失最小。通过比较样品基质中的标准添加曲线斜率与流动相中的标准曲线斜率来评估基质效应。对于1/10的样品稀释，观察到的ME为95 ± 12%（表4），符合常规分析的监管要求[37]。

表4 方法的基质效应

N-乙基马来酰亚胺（NEM）添加对半胱氨酸保存和稳定性的影响
为了确保测量的半胱氨酸浓度反映了实际的细胞内水平，在WT和CTNS KO HEK293T细胞中评估了样品制备过程中添加NEM的效果。样品制备过程中添加NEM对于防止半胱氨酸的快速氧化至关重要，因为氧化会人为地提高测量的半胱氨酸水平[13]。已发表的不同协议在NEM添加的时间上有所不同（在细胞裂解之前[12]或之后[17]）。由于NEM添加的时间可能很关键，我们通过在细胞裂解之前或之后添加NEM来评估其对测量半胱氨酸浓度的影响，并将结果与不添加NEM的情况进行比较（图3）。裂解后添加NEM显著降低了WT中的半胱氨酸浓度，从0.77降至0.47 nmol半胱氨酸/mg蛋白质（平均值，p = 0.0455；图3），而在CTNS KO细胞中未观察到显著差异（p = 0.0808；图3）。相比之下，裂解前添加NEM导致WT中的半胱氨酸浓度从0.77降至0.48 nmol半胱氨酸/mg蛋白质（平均值，p = 0.0245；图3），在CTNS KO细胞中从1.21降至0.86 nmol半胱氨酸/mg蛋白质（平均值，p = 0.0116；图3）。裂解前烷基化后半胱氨酸浓度的一致降低表明，早期硫醇稳定有效地限制了样品处理过程中的半胱氨酸氧化，从而提高了细胞内半胱氨酸测量的可靠性。使用NEM处理前后获得的半胱氨酸浓度差异，特别是在CTNS KO细胞中，表明应在样品制备过程中的细胞裂解之前和期间添加NEM。

图3
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NEM添加对WT（闭合符号）和CTNS KO HEK293T细胞（开放符号）中细胞内半胱氨酸水平的影响。NO NEM（n = 9），细胞裂解后添加NEM（n = 3），细胞裂解前添加NEM（n = 6）。数据以平均值±SD表示。统计分析采用双向ANOVA，并进行了多重比较校正以减少假发现率，使用Benjamini、Krieger和Yekutieli的两阶段设置方法。

为了进一步评估长时间储存期间半胱氨酸的稳定性，用于裂解后NEM实验的提取物 aliquots在4°C、-20°C和-80°C下储存了1周和1个月，有或没有NEM。在4°C下储存的WT样品中，不添加NEM时，半胱氨酸浓度在1周后显著增加了约25%，1个月后增加了60%（p < 0.0001；图4a）。在这两个时间点，浓度都显著高于在4°C下添加NEM的相应样品（p < 0.0001；图4a）。相比之下，在-20°C或-80°C下储存的WT样品随时间没有显著变化，无论是否添加NEM。在CTNS KO样品中，由于已经表现出升高的基础半胱氨酸水平（见图3），在4°C下不添加NEM储存的提取物中的半胱氨酸浓度在1个月后显著高于在4°C下添加NEM的样品（p < 0.001；图4b）。在4°C下不添加NEM储存1个月后，半胱氨酸浓度进一步增加，与初始基线浓度相比（p < 0.0001；图4b），并且也显著高于在4°C下添加NEM的样品（p < 0.0001，图4b）。与WT样品一样，在-20°C或-80°C下储存也防止了随时间的变化，无论是否添加NEM。应当注意的是，这些实验仅使用了一个细胞模型（HEK293T WT和CTNS KO），代表了本研究的相关应用。需要进一步的研究来确定这些发现是否适用于其他细胞模型。总体而言，这些发现表明，在添加NEM后，半胱氨酸样品在4°C下至少可以稳定1个月，而在-20°C或更低温度下储存时，即使没有NEM也可以保持稳定性1个月。

图4
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储存条件和NEM添加对HEK293T细胞提取物中半胱氨酸稳定性的影响。(a) WT样品。(b) CTNS KO样品。在细胞裂解后不添加（开放符号）或添加NEM（闭合符号）的提取物在4°C（白色圆圈）、-20°C（白色正方形）和-80°C（白色三角形）下储存了1周和1个月。半胱氨酸浓度相对于基线测量值表示，基线测量值定义为样品制备后立即测定的浓度（第0天）。数据以平均值±SD表示。统计分析采用双向ANOVA，并进行了多重比较校正以减少假发现率，使用Benjamini、Krieger和Yekutieli的两阶段设置方法。****，p值< 0.0001与第0天的相同条件相比，###，p值< 0.001与特定时间点的+NEM条件相比。####，p值< 0.0001与该时间点的+NEM条件相比。

将开发的方法应用于评估半胱氨酸症的治疗策略
接下来，将开发的方法应用于评估半胱氨酸症的体外模型中的治疗干预措施，在细胞裂解前用NEM处理提取物。使用了两种治疗方法：(1) 向CTNS KO细胞中添加半胱胺；(2) 使用慢病毒载体引入编码CTNS的功能cDNA拷贝的基因治疗方法。HEK293T细胞中功能性CTNS基因的丢失导致细胞内半胱氨酸浓度显著增加，从0.49升至0.86 nmol半胱氨酸/mg蛋白质（p = 0.0016，图5），证实了预期的疾病表型。用半胱胺处理CTNS KO HEK293T细胞显著降低了半胱氨酸浓度（p = 0.0003，图5），降至与WT对照组相当的水平。同样，通过LV转导（LV_Addback）重新添加CTNS编码序列也显著降低了细胞内半胱氨酸水平（p < 0.0001）。LVs能够实现稳定的基因整合和功能性CTNS蛋白的持续表达，从而恢复溶酶体半胱氨酸的输出[35, 36]。

图5
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半胱胺处理在CTNS KO细胞（n = 3）和LV介导的CTNS编码序列添加（LV_Addback；n = 6）在CTNS KO HEK293T细胞中的效果。对应于WT和CTNS KO（n = 6）条件的点与图3中的相同（裂解前+NEM）。数据以平均值±SD表示。统计分析采用双向ANOVA，并进行了多重比较校正以减少假发现率，使用Benjamini、Krieger和Yekutieli的两阶段设置方法。

这些结果表明，开发的方法可靠地检测到了治疗引起的半胱氨酸水平变化，适用于体外评估药理学和基因治疗策略。能够量化半胱氨酸积累的逆转，突显了其在临床前评估新兴治疗策略中的潜在用途。