Development of a high-throughput growth assay for bacteria or yeasts using an agar-based insoluble carbon source immobilization method（利用基于琼脂的不溶性碳源固定化方法开发用于细菌或酵母的高通量生长分析方法）

《Microbiology Spectrum》：Development of a high-throughput growth assay for bacteria or yeasts using an agar-based insoluble carbon source immobilization method

　　

微生物对多糖的降解是推动全球营养循环、开发可再生燃料或化学品以及促进人类肠道健康的关键。然而，复杂多糖通常不溶于水，这给利用可溶性酶研究其降解或测量微生物生长带来了挑战。已有若干方案应对这一挑战，包括使用3D打印的生物质捕获装置（BCD）或琼脂捕获系统（ACS）以促进不溶性碳水化合物的降解研究。这些方法虽然有效，但受限于底物负载量的可变性和耗时的制备过程。为克服这些不足，研究人员设计并测试了一种3D打印的移液器（Agar Pipette, AP），作为新开发的琼脂固定化方法的一部分，用于定量监测不溶性多糖在96孔微孔板分析中的降解。该移液器和方法通过两种机制进行了验证。首先，利用葡萄糖、大麦β-葡聚糖、淀粉、纤维素、几丁质、果胶、半乳聚糖或完整酵母生物质作为唯一碳源，对日本纤维弧菌（Cellvibrio japonicus）野生型及bgl2A、cbp2D、cbp2E单缺失突变株进行了生长分析，以新方法对标先前描述的方法。其次，利用琼脂移液器筛选了能够利用不溶性多糖作为唯一碳源的细菌或酵母的生长。3D打印移液器和琼脂固定化方法为使用不溶性碳水化合物进行细菌或酵母生长的高通量筛选提供了一种更快、更一致且经济高效的方式，表明其可成为环境和应用微生物研究的有用工具。

一、研究背景、问题与目的

不溶性多糖（如纤维素、几丁质等）的微生物降解在自然界养分循环、可再生能源（如生物燃料）生产和人类健康等领域具有核心意义。然而，由于这些基质的不可溶特性，传统研究方法面临两大主要挑战：（1）许多筛选方法使用可溶性或显色多糖衍生物，其化学与结构性质与真实环境中的多糖存在差异，导致需大量二次筛选才能鉴定真正的降解菌；（2）在液体培养中，不溶性底物会散射光源，干扰基于光密度（OD）的微生物生长测量，而其他方法（如菌落计数、蛋白质测定）通常需破坏性取样、难以实现高通量且无法实时监测。先前已开发出生物质捕获装置（BCD）、微孔板生物质捕获装置（mBCD）以及琼脂捕获系统（ACS）等方法来隔离不溶性颗粒，但它们在底物负载一致性、制备时间、成本以及对细小颗粒底物的适用性方面仍存在局限。因此，本研究的目的是开发一种更高效、可靠且适用于高通量筛选的微生物生长分析方法，以促进不溶性多糖降解机制的研究及其在生物技术中的应用。

二、主要技术方法

本研究核心方法为“琼脂移液器提取（Agar Pipette Extraction, APE）测定法”。研究人员首先使用立体光刻3D打印技术制造了一种可重复使用、可灭菌的定制移液器（Agar Pipette, AP），其设计为带内部捕获袋和外部导向鳍的圆柱体，用于从96孔板中精确切割并提取直径为4 mm的琼脂柱塞。将不溶性底物与琼脂混合、灭菌后，分装至微孔板中凝固形成底物-琼脂微孔板。使用AP移除中心琼脂柱塞后，向孔中加入无碳源培养基并接种微生物，随后在微孔板读数器中通过OD₆₀₀测量实时监测生长。该方法与先前报道的mBCD/ACS方法及传统BCD方法进行了比较验证。实验所用菌株包括模式腐生细菌日本纤维弧菌（Cellvibrio japonicus）的野生型及多种缺失突变株（如Δgsp、Δbgl2A、Δcbp2D、Δcbp2E等），以及从松林腐解子实体中分离的环境细菌和酵母菌株。生长分析均在生物三重重复下进行，使用GraphPad Prism软件计算生长速率和标准偏差。

三、研究结果

1. 1.
   APE方法验证
   研究人员将APE测定法与基于mBCD的ACS方法进行对比，评估了日本纤维弧菌野生型和Δgsp突变株在多种不溶性底物（葡萄糖、大麦β-葡聚糖、马铃薯淀粉、灭活酵母细胞）上的生长。结果显示，两种方法均能检测到Δgsp突变株在β-葡聚糖上的轻微生长缺陷以及在淀粉和酵母细胞上无法生长的表型，与预期一致。重要的是，APE测定在多种底物上提供了更优的动态范围（即野生型与突变株之间OD₆₀₀的最大差值更显著），尤其是在使用酵母细胞时，其初始OD₆₀₀读数更高，减少了底物颜色对测量的干扰。这表明APE方法能以匹配或超越现有方法的精度和动态范围，定量测量细菌在多种复杂不溶性多糖上的生长。
2. 2.
   APE测定生长分析鉴定日本纤维弧菌中复杂多糖利用所需的必需CAZyme编码基因
   利用APE方法，研究人员系统评估了多个CAZyme（碳水化合物活性酶）基因缺失突变株在不同多糖底物上的生长表型。
   • •
     Δbgl2A突变株：在果胶上生长与野生型相似，但在马铃薯半乳聚糖上表现出可重复的生长缺陷，表明Bgl2A（一种预测的β-半乳糖苷酶）对半乳聚糖的完全降解和利用至关重要，而对果胶降解非必需。
   • •
     Δcbp2D和Δcbp2E突变株：在以滤纸（纤维素）为唯一碳源时，与野生型相比显示出预期的生长缺陷和最终OD₆₀₀降低，而Δcbp2DΔcbp2E双突变株的表型与单突变株相似，支持了Cbp2D和Cbp2E作为异源二聚体共同发挥功能的假说。在以木聚糖、果胶、灭活酵母细胞或β-几丁质为碳源时，这些突变株的生长与野生型无差异，表明Cbp2D/E蛋白可能特异性结合纤维素。
3. 3.
   APE系统用于环境细菌和酵母菌株的筛选，支持在简单和复杂底物上比较生长
   研究人员使用APE测定法筛选了四株环境细菌和四株环境酵母在葡萄糖、几丁质、β-葡聚糖以及双孢蘑菇（Agaricus bisporus）坏死物等碳源上的生长。所有菌株在葡萄糖上普遍生长最佳（Apiorichum酵母在坏死物上生长最佳）。总体而言，酵母在几丁质和葡聚糖等不溶性聚合物上的最大生长量低于细菌。在细菌中，Flavobacterium和Pedobacter菌株在几丁质和葡聚糖上显示出生长能力，而Delftia和Pseudomonas菌株则无法利用这两种聚合物。该实验证明了APE测定法能够有效捕获不同微生物在多种环境相关底物上的生长动态，适用于跨域比较。
4. 4.
   APE测定促进β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的高通量定量
   为验证APE方法在酶活性测定中的适用性，研究人员使用显色底物4-硝基苯基 N-乙酰-β-D-葡糖胺（NP-GlcNAc）和β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶S（NAGase）进行了消化反应。在APE体系中，酶促反应成功产生黄色产物4-硝基苯酚，并通过OD₄₀₅进行了定量。与液体反应体系相比，APE体系中的最终OD₄₀₅约为其三分之一，表明琼脂扩散是酶促反应的一个限制因素，但该方法仍能有效检测酶活。此外，通过将琼脂固定的不溶性玉米淀粉与耐热α-淀粉酶共孵育，并利用GAGO检测试剂盒定量释放的葡萄糖，证实了APE方法可用于量化不溶性多糖的酶促降解。这些结果说明，除了鉴定生长表型，APE测定还可用于高通量定量复杂不溶性多糖的酶促降解。

四、讨论与结论

APE测定法相较于现有的不溶性多糖降解分析方法（如BCD、mBCD、ACS）具有多重优势：（1）更高效经济：制备时间减少一半以上，底物培养基所需浓度仅为终浓度的4倍（ACS需10倍），降低了成本。（2）操作更简便：AP实现了琼脂柱塞的快速精准提取，简化了微孔板制备。（3）动态范围更优、变异性更低，有利于检测细微的生长表型差异。（4）应用广泛：已验证适用于多种不溶性细微颗粒底物、不同微生物（细菌、酵母）以及酶活性测定，在微生物生态学和生物技术研究中具有潜力。

本研究通过生长表型分析，揭示了日本纤维弧菌中Bgl2A在半乳聚糖利用中的关键作用，以及Cbp2D/E蛋白在纤维素降解中的特异性功能，拓展了对相关CAZyme生理功能的理解。同时，对环境分离株的筛选展示了该方法在揭示微生物底物利用策略多样性方面的实用性。

结论：研究人员开发了一种新型的基于3D打印琼脂移液器（AP）的琼脂固定化方法（APE测定），用于在96孔微孔板格式中高通量筛选微生物在不溶性多糖上的生长。该方法相比现有方案更省时、经济、易于操作，并提供了更优的动态范围和可重复性。验证实验表明，APE测定能有效用于鉴定突变表型、筛选环境微生物以及量化酶活性，是不溶性多糖微生物降解研究中的一个有力工具。尽管该方法要求微生物分泌可溶性酶，且不适用于需附着底物降解的微生物或能产生琼脂酶的海洋细菌，但其为高通量研究微生物不溶性多糖降解提供了一种有效且直接的方法。

（论文发表于《Microbiology Spectrum》）