利用长读长基因组测序技术，重新完成了当代黑腹果蝇（Drosophila simulans）中沃尔巴克氏体（Wolbachia）内共生菌的完整组装

《Microbiology Resource Announcements》：Complete de novo assembly of Wolbachia endosymbiont of contemporary Drosophila simulans using long-read genome sequencing

　　

摘要

我们呈现了一种高质量的、全新的 Wolbachia pipientis（wRi Merrill 23，OZ411647）基因组组装结果，这种细菌是 Drosophila simulans (D. simulans) 的α-变形菌内共生体。该基因组是通过使用长读长测序技术对 2023 年 10 月从加州大学圣克鲁兹分校 Merrill 学院收集的感染了 wRi 的 D. simulans 胚胎进行测序获得的。

公告

Wolbachia pipientis 可感染多种节肢动物和线虫，通过细胞质不相容性（CI）、杀死雄性以及恢复生育能力等方式改变宿主表型（1, 2）。Riverside 菌株（wRi）于 20 世纪 80 年代首次在加州 Drosophila simulans (D. simulans) 中被发现（3），由于其极强的细胞质不相容性而迅速在整个州范围内传播（4）。尽管该菌株具有重要意义（5），但目前唯一的参考基因组仍基于 1984 年的 wRi 版本（3, 6）。在这里，我们提供了基于 2023 年 10 月在加州大学圣克鲁兹分校 Merrill 学院 Alan Chadwick Garden 收集的现代 D. simulans 样本的完整 de novo wRi 基因组组装结果。

为了获得现代的 wRi 基因组序列，我们收集了野生 D. simulans 飞虫，建立了纯雌系，并对感染了 wRi 的胚胎进行了测序。我们通过放置装有香蕉诱饵的瓶子吸引雌虫约 5 天，然后将怀孕的雌虫收集到白色培养基上。后代孵化后，通过表型鉴定雄性并使用 silf-F/R 引物通过 PCR 鉴定 D. simulans 与 D. melanogaster 的区别（7），并使用 wsp_1F/592R 引物确认 wRi 的存在（8）。我们使用 Wizard HMW DNA Extraction Kit（Promega）提取了感染 wRi 的胚胎的 DNA，并使用 Native Barcoding Kit V14（SQK-NBD114-24）制备文库，未进行大小筛选。这些文库在 Nanopore MinION Mk1B 测序仪上使用 R10 流式细胞（FLO-MIN-114）和 MinKNOW v23.07.8 软件（采用自适应采样快速模式）进行测序，以去除 D. simulans 的序列（GCF_016746395.2），最终获得了 4.26M 个读段（N50 749 bp，20 h），并使用 Dorado（v0.7.3，hac 模式，--min-qscore 10）进行碱基调用。过滤掉长度超过 3 kb 的非宿主序列后（剩余 93K 个读段，N50 10.5 kb），我们根据 Jacobs 和 Nakamoto 等人的方法（9，10）使用 Flye 工具组装了 wRi 基因组，得到了一个覆盖率为 30× 的 1.26 Mb 环状基因组。Flye 工具还确定了基因组的环化情况（最小重叠长度为 4,000 bp），并且基因组没有发生旋转。

为了进一步完善基因组组装，我们从整个感染了 wRi 的 D. simulans 飞虫（Merrill 23 菌株）中获得了 Illumina 的短读长全基因组测序数据。Illumina 文库是使用基于 Tn5 的标签化协议制备的（11）。Tn5 酶（Tn5R27S、E54K 和 L372P）来自加州大学伯克利分校的 QB3 MacroLab。标签化过程同时切割了基因组 DNA 并连接了适配子序列（Tn5-A: FC-121-1030、Tn5-B: FC-121-1031 和 Tn5-rev；IDT）。文库使用 Nextera XT Index Kit v2（i5/i7 适配子，Illumina）和 KAPA HiFi（Roche）进行索引和扩增，然后在 NovaSeqX Plus（2 × 150 bp）上进行测序。使用 fastp v1.0.1（11）去除测序适配子和低质量区域，再使用 Pilon v1.24（12）对基因组进行优化（图 1）。我们使用 BUSCO v5.7.0（13）（rickettsiales_odb10）评估了优化后的基因组完整性，达到 99.2%；使用 Prokka v1.1.1（14）（kingdom:bacteria）对基因组进行了注释（表 1）；并使用 Proksee v1.1.2（15）计算并可视化了基因组的 GC 含量和 GC 偏斜（图 1）。除非另有说明，否则使用默认参数。