靶向敲除宿主过氧化物酶体肽酶赋予玉米致死性坏死病田间抗性

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Targeted knockout of a host peroxisomal peptidase confers field resistance to maize lethal necrosis

　　

摘要 玉米致死性坏死病 (Maize lethal necrosis, MLN) 是一种由玉米褪绿斑驳病毒 (maize chlorotic mottle virus, MCMV) 和马铃薯Y病毒科病毒 (通常为甘蔗花叶病毒, sugarcane mosaic virus, SCMV) 复合侵染引起的严重病害，严重威胁撒哈拉以南非洲地区 (sub-Saharan Africa, SSA) 的粮食安全。研究人员调查了一个来源于泰国自交系KS23-6、位于第6号染色体上具有主效的MLN抗性数量性状位点，命名为玉米致死性坏死病易感位点1 (maize lethal necrosis susceptibility locus 1, qMLNS1)。通过精细定位和CRISPR-Cas9编辑，研究人员在缩窄后的105 kb区间内，鉴定出一个过氧化物酶体肽酶是导致感病性的根本原因。共聚焦显微镜证实了MLNS1蛋白定位于过氧化物酶体内。在易感精英自交系CML536 (来源于SSA) 中靶向敲除Mlns1基因，在肯尼亚奈瓦夏进行的田间试验中，所获得的抗性与KS23-6相当。该敲除特异性地阻断了MCMV的积累，但不影响SCMV。在无病害条件下，编辑系未表现出产量损失或农艺性状缺陷。这些发现揭示了过氧化物酶体酶与病毒易感性之间的机制联系。同时，这也建立了一种快速、可扩展的基因编辑策略，用于将MLN抗性导入精英种质资源，为全球范围内抗击主粮作物类似病毒病提供了一个范例。

一、 研究背景、问题与目的

玉米是撒哈拉以南非洲地区重要的主粮作物，但其单产水平低，且易受环境胁迫和病害影响。玉米致死性坏死病 (MLN) 自2011年在肯尼亚首次爆发后迅速蔓延，平均导致籽粒减产四分之一，严重时可造成绝收。该病由玉米褪绿斑驳病毒 (MCMV) 和马铃薯Y病毒科病毒 (如甘蔗花叶病毒, SCMV) 协同侵染引起。尽管存在如泰国热带玉米自交系KS23-6等天然抗源，但其携带的抗性位点 (命名为qMLNS1) 遗传机制不明。通过传统育种将抗性从外源供体导入易感精英品种的过程耗时漫长，且常伴随来自供体亲本的不良基因连锁累赘，导致产量下降。因此，亟需开发一种高效、精准的策略，以快速培育抗MLN的玉米新品种，保障地区粮食安全与农民生计。本研究的目的是解析qMLNS1位点的关键抗性基因，并利用基因编辑技术实现对精英自交系的精准改良。

二、 主要技术方法概述

研究人员综合利用了遗传学、基因组学、分子生物学及田间试验等多种技术。首先，利用源自KS23-6与多个易感CIMMYT (国际玉米小麦改良中心) 自交系杂交构建的分离群体，在肯尼亚奈瓦夏MLN病圃进行人工接种和表型鉴定，通过高通量基因分型 (如KASP^TM) 对qMLNS1位点进行了连续多轮的精细定位，最终将区间缩小至105 kb。其次，对包括抗病供体KS23-6和多个易感非洲精英自交系 (如CML536, CML543等) 进行了全基因组测序 (包括光学图谱和PacBio长读长测序)，以解析目标区间的结构变异并为后续实验设计提供精确序列信息。第三，基于获得的基因组序列，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在易感自交系CML536中，针对精细定位区间内的所有候选基因 (包括肽酶、eIF1A等) 设计了多组单向导RNA (sgRNA)，通过农杆菌介导的遗传转化，系统性地创建了系列编辑等位基因 (包括移码突变、大片断缺失等)。最后，在受控环境 (温室/生长室) 和开放田间 (肯尼亚奈瓦夏和基博科) 对编辑植株及其对照进行了MLN抗性 (采用1-9级评分标准) 和关键农艺性状的全面评价。此外，还利用定量PCR (qPCR) 测定了病毒载量，通过亚细胞定位 (荧光蛋白融合与激光共聚焦显微镜) 确定了目标蛋白的细胞器定位。

三、 研究结果

1. 遗传精细定位MLN抗性的qMLNS1位点

通过利用多个分离群体进行多轮表型鉴定和基因分型，研究人员成功将位于第6号染色体的qMLNS1位点从约33 Mb的初定位区间，逐步精细定位至105 kb的狭窄区域。该区间包含肽酶 (peptidase)、核糖体L1 (ribosomal L1)、解旋酶 (helicase)、DNA修复 (DNA repair) 和真核翻译起始因子1A (eukaryotic translation initiation factor 1A, eIF1A) 等五个开放阅读框 (ORFs) 以及一个微型反向重复转座元件 (miniature inverted-repeat transposable element, MiTE)。

2. 选择用于候选基因验证的自交系和全基因组测序

研究选择了对MLN高度易感的非洲精英自交系CML536作为基因编辑的受体。为精确设计基因编辑工具，研究人员对抗病供体KS23-6、CML536以及其他三个易感自交系 (CML543, CKL05004, CKL05022) 进行了全基因组测序。分析发现，目标区间在不同自交系间存在结构变异，但KS23-6和CML536在该区间的结构高度相似，这为后续在CML536中进行编辑模拟KS23-6的抗性等位基因提供了依据。

3. CRISPR-Cas9编辑精细定位区间内的候选基因

研究人员在CML536中，利用CRISPR-Cas9技术同时敲除了105 kb区间内的所有候选ORFs或亚区域，共创建了六种编辑等位基因，包括：针对肽酶基因设计的、导致移码突变或框内缺失的三种变异体；删除包含三个ORFs和MiTE的40 kb中间区域的变异体；以及针对eIF1A基因设计的、导致移码突变或整个基因缺失的变异体。

4. 通过筛选编辑变异体进行MLN抗性鉴定以确定致病变因基因

对编辑植株的T₂代纯合植株进行MLN接种鉴定发现，只有三种肽酶基因编辑变异体表现出与抗病供体KS23-6相当的强抗性。而携带40 kb缺失或eIF1A编辑等位基因的植株，其感病性与未编辑的亲本CML536相同。这一结果明确地将导致MLN易感性的致病变因锁定为肽酶基因。

5. 肽酶蛋白定位于过氧化物酶体

生物信息学预测肽酶蛋白C端具有丝氨酸-赖氨酸-异亮氨酸 (Ser-Lys-Ile, SKI) 三肽信号，这是一种非典型的过氧化物酶体靶向信号。研究人员通过构建含有绿色/红色荧光蛋白与肽酶融合 (分别携带SKI或经典信号SKL) 的表达载体，并在玉米细胞中进行瞬时表达与激光共聚焦显微镜观察，证实了无论携带SKI还是SKL信号，肽酶蛋白均特异性地定位于过氧化物酶体中，且可能位于过氧化物酶体腔内的特定亚区。

6. 在肯尼亚田间试验中评估非转基因肽酶编辑材料

在获得肯尼亚国家生物安全局 (National Biosafety Authority, NBA) 批准，确认编辑材料为非转基因 (非GMO) 后，研究人员在奈瓦夏进行了开放田间试验。在人工MLN接种条件下，肽酶编辑变异体表现出高度抗性，而缺乏编辑的无效分离株则与亲本CML536一样感病。在无MLN病害的基博科试验点，编辑系的籽粒产量及关键农艺性状 (如散粉吐丝期、株高、穗位高、千粒重) 与未编辑亲本CML536无显著差异，证明敲除肽酶基因可在不影响农艺性状的前提下赋予MLN抗性。研究人员也在其他三个易感精英自交系 (CML543, CKL05022, CKL05004) 中成功创制了肽酶编辑变异体，初步田间试验显示其同样具有MLN抗性。

四、 讨论与结论总结

研究人员在讨论部分指出，病毒通过在被侵染细胞的质膜或细胞器膜上形成称为“球状体” (spherules) 的病毒复制区室来逃避宿主防御。其中，SCMV在内质网形成球状体，而属于番茄丛矮病毒科 (Tombusviridae) 的MCMV则在过氧化物酶体膜上诱导球状体形成。本研究发现，特异定位于过氧化物酶体的肽酶能选择性促进MCMV的复制，而对SCMV无影响。这证实了MCMV的复制依赖于过氧化物酶体球状体。研究人员推测，该肽酶可能通过加工过氧化物酶体跨膜蛋白的腔内结构域，从而激活其胞质域，使其能够与MCMV的RNA-蛋白复合物互作，进而启动球状体形成。该机制有别于此前报道的、多数通过突变真核翻译起始因子 (eIF) 来获得病毒抗性的途径。

研究结论可翻译为：利用CRISPR-Cas9技术在非洲精英玉米自交系中，敲除一个作为宿主易感因子的独特过氧化物酶体肽酶，在肯尼亚的田间试验中赋予了强大的MLN抗性，且未损害其农艺表现。这一发现揭示了过氧化物酶体酶与病毒易感性之间的机制联系。针对单个基因的敲除以获得MLN抗性，提供了一种快速编辑易感精英系并在2-3年内将其回种田间的方法。该策略也消除了传统回交转育中由残余供体亲本基因导致产量下降的风险。这项工作不仅代表了植物病毒学的重要进展，也为保护受MLN持续威胁的小农玉米生产提供了一种创新方案。