综述：基于超分辨率邻近标记技术的空间蛋白质组学最新进展

《Current Opinion in Chemical Biology》：Recent advances in spatial proteomics by super-resolution proximity labeling

　　

超分辨率邻近标记（SR-PL）将空间蛋白质组学推进至超越传统蛋白质水平富集的范畴，实现了活体细胞中亚细胞结构在残基分辨率的解析。传统的邻近标记（PL）依赖于链霉亲和素（SA）捕获及珠上酶切，产生以蛋白质为中心的读数，结构洞察力有限。相比之下，SR-PL直接回收生物素化肽段，并通过液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）鉴定标记的氨基酸残基。这些位点特异性的标记作为邻近的直接证据，允许精确绘制蛋白质表面、溶剂可及性及相互作用界面。通过将空间邻近性与特定结构特征相关联，SR-PL实现了对空间蛋白质组学数据的机制性解读，并将邻近标记重构为一个结构知情的解析框架。亲和捕获策略的最新进展——包括工程化探针、可逆亲和基质及优化的抗体试剂——改善了选择性富集和温和肽段释放，同时降低了背景污染。这些发展共同确立了SR-PL在膜拓扑结构解析、细胞器接触位点分析及配体依赖性相互作用等广泛应用中的基础地位。

一、 引言

邻近标记（PL）已成为空间蛋白质组学的核心策略，能够在活体细胞中以分子精度共价标记蛋白质，以绘制亚细胞组织及相互作用邻域。现有的PL化学体系涵盖酶促和光化学模式，成熟的酶促系统如APEX2和TurboID，以及光催化系统如μMap，均能在活体细胞中实现纳米尺度的标记。然而，尽管PL工具的发展已趋成熟，下游蛋白质组学工作流程大多仍停留在蛋白质水平分析，导致标记化学固有的残基级分辨率未被充分利用。本综述聚焦于新兴的超分辨率邻近标记（SR-PL）分析方向，即将蛋白质组学工作流程从传统的蛋白质水平富集延伸至直接回收生物素化肽段，并通过LC–MS/MS在单氨基酸分辨率上鉴定标记位点。

传统的PL工作流程依赖链霉亲和素（SA）亲和捕获及珠上胰蛋白酶切，其输出限于蛋白质水平的读数。虽然利用了链霉亲和素-生物素间的超高亲和力（K_d≈ 10^?14M）产生了广泛的蛋白质组图谱，但该方法存在显著的分析局限。由于该亲和力极强，在标准条件下难以高效洗脱，使得珠上酶切成为常规默认流程。此过程会产生大量未标记肽段，而生物素化肽段往往丰度极低或无法被回收。此外，珠上酶切引入了由链霉亲和素衍生肽段主导的大量分析背景，严重干扰低丰度靶标的检测。更重要的是，蛋白质水平的富集本质上会共纯化大量的次级和非特异性结合物，这些污染物会膨胀背景信号，迫使研究者采用比率过滤方法，但这本身可能引入假阳性并降低灵敏度，特别是对于双定位蛋白。这些问题凸显了蛋白质水平鉴定的根本局限性：它仅提供了邻近性的粗略视图，未能精确定位被修饰的特定结构域或结构元件。因此，早期PL研究常需依赖辅助验证（如模拟对照和生化分析），增加了实验负担。这些因素促使了SR-PL的广泛采用，并强调了残基水平分析在揭示邻近事件精细结构背景方面的价值。

二、 实现超分辨率邻近标记的方法学进展

早期的PL研究尝试使用苛刻的洗脱策略（如过量生物素竞争或去污剂辅助热处理）来回收链霉亲和素结合的物种，但这些方法通常回收效率低且与下游LC–MS分析兼容性差。过去十年中，生化设计、亲和工程及替代富集化学的进步已确立SR-PL在酶促和光催化PL平台上的可行性。

1. 用于可逆捕获和释放的工程化生物素探针

在SR-PL中，采用修饰的生物素探针对链霉亲和素-生物素相互作用的亲和力进行微调，可显著改善生物素化肽段的回收。生物素连接酶系统底物特异性严格，限制了兼容探针的范围；而基于过氧化物酶和光化学的PL系统则表现出更大的化学灵活性。Lee等人提出的Spot-ID方法使用脱硫生物素酚（DBP）进行APEX介导的PL，代表了最早的残基解析SR-PL应用之一。DBP对链霉亲和素的亲和力显著降低（K_d≈ 10^?11M），允许使用甲酰胺进行无去污剂洗脱，显著提高了标记肽段的回收率。Huth等人则将μMap平台与脱硫生物素-PEG3-二嗪丙啶探针结合，实现了可逆捕获和竞争性生物素洗脱。

2. 可切割探针设计

一些研究采用可切割探针对残基解析分析进行了探索，利用化学不稳定的连接子独立于超高亲和力的链霉亲和素-生物素相互作用释放标记蛋白。Li等人证明硫醇可切割生物素标签（SS-biotin）可用于富集和回收TurboID生成的生物素化蛋白，相对于传统珠上酶切，该策略大幅减少了非特异性蛋白鉴定和链霉亲和素背景。偶氮基可切割连接子也被整合到光化学PL策略中，通过温和条件下的还原切割实现标记物种的MS分析。

3. 工程化亲和素

工程化的亲和素变体提供了另一种选择性回收生物素化肽段的互补途径。Nishino等人开发的Tamavidin-2-REV是一种工程化的类亲和素蛋白，通过Ser36Ala单点突变大幅削弱了生物素结合亲和力（K_d≈ 2.8–4.4 × 10^?7M）。这允许在温和条件下洗脱捕获的肽段，支持肽段水平的PL工作流程。在表达TurboID融合STING的巨噬细胞中，使用Tamavidin-2-REV相比链霉亲和素基工作流程，使鉴定的生物素化肽段数量增加了近四倍。

4. 基于抗体的生物素化肽段富集

基于抗体的富集提供了一种平衡的亲和力，支持生物素化肽段的高效捕获和受控释放。Udeshi等人和Kim等人证明肽水平的免疫亲和富集能够稳健且直接地检测位点特异性生物素化。特别是BioSITe方法展示了与多种PL模式的广泛兼容性。这些研究建立了修饰肽段特异的MS/MS特征离子，为更严格的鉴定和过滤提供了基础。Zhu等人进一步优化了单抗试剂，相比多抗制剂提高了信噪比并减少了背景污染物。

5. 改进的洗脱化学

Shin等人的研究表明，通过优化的洗脱化学，即使使用标准试剂也能实现SR-PL。他们引入了一种酸性有机水变性缓冲液（80%乙腈ACN，0.2%三氟乙酸TFA，0.1%甲酸FA）作为洗脱策略。通过在这些条件下破坏蛋白质结构，生物素化肽段可从链霉亲和素复合物中有效释放。该策略在使用常规生物素基团时也能达到超分辨率分析，表明其广泛适用性。

三、 超分辨率邻近标记实现的空间蛋白质组学

SR-PL扩展了邻近蛋白质组学可解决的生物学问题，通过精确定位原位修饰的特定氨基酸残基，提供了对膜拓扑结构、溶剂可及性及底物结合位点邻近性的直接洞察。

1. 细胞器与膜拓扑结构解析

由于PL依赖于短寿命、扩散受限且不易穿过脂质双层的活性物种，标记选择性发生在靠近标记源的膜侧面。Lee等人利用SR-PL绘制了线粒体内膜（IMM）的残基水平生物素化图谱，区分了基质侧和膜间隙（IMS）侧的蛋白区域，解析了包括LETM1和OXA1L在内的跨膜蛋白拓扑结构。这一方法已被扩展至系统绘制整个线粒体蛋白质组，生成了残基解析的蛋白质定位和膜拓扑数据库。

2. 亚细胞器分辨率的空间映射

SR-PL能够剖析空间连续但功能不同的亚细胞器区室。Kang等人开发的ICAX方法，通过向嵴膜两侧引入两种同位素编码的苯氧自由基探针，利用每个生物素化位点的重轻同位素强度比定量报告该残基对各亚区室的相对可及性，从而界定了线粒体嵴内的独立生化环境（如膜间腔ICS），并发现了ICS特异性蛋白TMEM177。

3. 细胞器间接触位点映射

细胞器接触位点是动态纳米尺度的膜界面，SR-PL通过提供位点级证据更好地约束标记发生的位置。Kwak等人开发的Contact-ID利用在ER-线粒体接触位点重构的split-BioID策略，通过位点特异性赖氨酸生物素化模式推断膜取向。Lee等人报道的OrthoID则利用正交标记的蛋白交集，结合链霉亲和素-生物素和葫芦[7]脲-金刚烷结合对的选择性富集，提高了ER-线粒体接触位点蛋白质组的特异性。

4. 无膜细胞器映射

对于由相分离定义的无膜区室（如P小体），SR-PL提供了独特优势。因为即使蛋白随后扩散，标记位点提供了蛋白在标记时刻确实存在于该凝聚体的直接分子证据。Shin等人应用SR-PL区分了P小体的核心组分与外周蛋白，并识别了动态定位因子UBAP2L。

5. 蛋白质复合物与配体结合位点映射

SR-PL还能在分子组装水平上解析局部蛋白组织。Kim等人将BioSITe应用于BCR-ABL融合蛋白，绘制了与局部复合物组织相关的位点特异性生物素化模式。在药物靶点研究中，Kwak等人开发的Target-ID将小分子配体与HaloTag–TurboID偶联，实现了活细胞中药物结合蛋白的邻近依赖性生物素化，以单氨基酸分辨率报告靶标结合情况。Huth等人则利用μMap实现了激酶、E3连接酶及STAT3等蛋白的药物结合位点残基水平映射。

6. 迈向体内空间蛋白质组学

SR-PL在体内应用中规避了传统蛋白质水平富集导致的假阳性和假阴性问题。Kim等人报道的首个体内SR-PL研究iSLET，利用锚定在内质网腔的TurboID选择性标记组织特异性分泌蛋白，并在活体小鼠中追踪其释放。MAX-Tg转基因APEX2模型则实现了体内器官依赖性线粒体基质蛋白质组的残基水平解析。

四、 挑战与未来展望

尽管取得了实质性进展，SR-PL仍面临若干限制。首先，SR-PL仅依赖于丰度显著较低的标记肽段，对检测灵敏度提出了严格要求，导致总体鉴定数往往少于蛋白质水平富集，尤其在低丰度系统或样本量有限时。其次，定量重现性和数据解释仍是挑战，标记肽段的低相对丰度使其对消化效率、肽段回收、富集性能和电离效率的变化更为敏感。此外，标记肽段可能因长度不适于LC-MS检测而被遗漏。

未来的发展路径包括整合高质量的AI结构预测框架，将残基水平标记模式置于预测的3D结构中解读。同时，标准化的需求日益迫切，从专用的可切割连接子和工程化亲和素，到优化的富集化学和高灵敏度LC–MS，建立稳健、通用的协议对于最大化肽段回收、定量准确性和生物学解释至关重要。总体而言，SR-PL通过将可逆富集化学与位点解析的MS读数相结合，正在将空间蛋白质组学从蛋白质鉴定范式转向生化环境的残基水平映射，成为空间系统生物学中一个可靠且广泛应用的支柱。