谁包装了这些毒品？改进的DNA提取技术及其对调查结果的影响——基于活动水平的相关假设

《Forensic Science International: Genetics》：Who Packed the Drugs? Improved DNA Recovery and Its Impact on Findings Given Activity-Level Propositions

　　萨拉·法里亚（Sara Faria）|彼得·吉尔（Peter Gill）|安娜·克拉拉·里贝罗（Ana Clara Ribeiro）|弗朗西斯科·皮纳-马丁斯（Francisco Pina-Martins）|阿内·埃利达·丰内洛普（Ane Elida Fonnel?p）
葡萄牙里斯本大学理学院生物学系

**摘要**
对法医DNA证据的解读基于活动水平假设，这取决于控制DNA转移、持久性和回收的过程，以及用于提取DNA的实验室方法。本研究调查了转移类型、基质特性和DNA提取策略对DNA产量、STR分型性能以及基于活动水平假设得出的概率比的影响。实验使用了个人背包（如背包和手提包）和密封袋进行直接和间接转移。比较了三种分析方法：Chelex提取法、结合QIAamp DNA Mini Kit和mirVana? miRNA分离Kit的共提取法，以及直接PCR法。

与已建立的转移原理一致，直接转移在所有方法中产生的DNA量显著高于间接转移。从背包转移到密封袋的DNA比例受到背包类型和内表面特性的轻微影响。提取方法显著影响了DNA产量和分型成功率。共提取法产生的DNA量更多，STR分型也更稳健，优于Chelex提取法和直接PCR法。直接PCR法在减少DNA损失方面有优势，但在抑制作用和整体分型质量方面存在局限性。提取效率的差异改变了直接和间接转移情况下观察到的DNA量分布，从而影响了基于活动水平假设得出的概率比。这些发现与实验室间研究结果一致，表明方法学差异会影响基于活动水平假设的DNA证据评估。总体而言，实验结果表明，实验室方法，特别是DNA提取方法，在DNA回收和分型性能以及评估DNA证据时的证据权重方面起着关键作用。

**1. 引言**
理解DNA转移、持久性、存在和回收的机制（DNA-TPPR）在法医调查中至关重要，因为它为专家根据活动假设评估结果提供了基础。这需要全面了解多个相互关联的因素[1]。

DNA转移是指DNA从一个表面转移到另一个表面。它可以通过多种途径发生[1][2]。直接转移（初级转移）是指DNA通过直接物理接触沉积在物体、表面或另一个人皮肤上；间接转移（次级或后续转移）是指DNA在初次沉积后再次转移，即原始来源与最终发现DNA的位置没有直接接触[1][3]。多种因素影响转移过程[1][4]，如表面类型、表面粗糙度、地形和物理化学性质[4][5]。此外，接触频率、持续时间和压力也是重要因素：大部分DNA在初次接触时转移，而更强烈的处理或摩擦会进一步增加DNA产量[6]。个体脱落情况（受身体部位、皮肤状况、年龄和性别的影响）也会影响转移[7]。

DNA持久性指的是DNA在表面上以可检测的数量和质量（如完整性、降解程度）存在的持续时间。DNA量通常会随时间减少，但降解速率变化很大[4]。环境因素（如温度、紫外线暴露、降雨、风、湿度和微生物活动）以及多人使用也会影响DNA持久性[4]。原始DNA沉积物在他人使用物品后仍可能保留，尽管最近的使用者往往占主导地位，但并非总是如此[1]。洗手可以大大减少皮肤上的DNA，但DNA可能在洗涤后仍残留在衣物上[1][4]。

在案件处理中，目前使用多种DNA收集方法，包括拭取、贴胶带和切割，随后采用不同的分离技术，如有机提取、Chelex提取或基于二氧化硅的方法。方法的选择极大地影响了DNA的产量和质量。ReAct项目[8]比较了23个实验室进行的相同实验，发现在相同条件下DNA产量从皮克克到纳克不等，显示出方法学选择的显著差异。这种变异性突显了方法学选择的影响，以及法医工作流程中需要更大的标准化和透明度。提取程序的一个主要限制是DNA损失：van Oorschot等人[9]报告称，根据方法的不同，DNA损失率在20%到76%之间，影响因素包括试管转移、洗涤步骤和DNA对塑料消耗品或基质的吸附[10]。在本研究中，我们特别测试了Chelex提取法和一种常用的共提取法。

Chelex提取法因其快速的工作流程、最少的处理步骤和避免使用有毒有机溶剂而广泛应用于法医实验室。其简单性和高效性使其得到广泛应用。然而，一个主要缺点是去除PCR抑制剂的能力有限，可能导致扩增失败或不完整的STR分型。在Chelex提取过程中，树脂会结合二价离子（如Mg2?），这些离子是DNase的重要辅因子，从而防止DNA降解。56°C的孵育有助于细胞裂解和DNA释放，而95°C的加热会使蛋白质变性并使核酸酶失活。离心后，DNA留在上清液中，而Chelex珠子和细胞碎片形成沉淀物，得到一种粗略但适合PCR分析的提取物[11][12]。

共提取法常用于同时从一份样本中回收DNA和RNA。在本研究中，我们采用了结合QIAamp DNA Mini Kit和mirVana? miRNA分离Kit的混合协议[13]。在共提取法中，样品使用mirVana?裂解缓冲液进行裂解，该缓冲液含有强变性剂和还原剂2-mercaptoethanol，有效破坏蛋白质交联并释放细胞中的核酸。随后在乙醇存在下，DNA被捕获在QIAamp?柱的二氧化硅膜上，洗涤以去除杂质，最后用缓冲液洗脱，得到适用于下游分析的高纯度DNA。Fantinato等人[3]证明，这种共提取策略产生的DNA量显著更多，分型质量也更高。加入还原剂和延长孵育时间被认为对提高从接触沉积物中回收DNA的效果至关重要。

直接PCR法也被推荐用于改善低量样本的结果[10][14]。它可以直接从样本中扩增遗传物质，无需DNA提取和纯化步骤。这种方法既有优势也有局限性[1]。文献表明，除了由于省去了DNA提取步骤而速度更快外，该方法还能提高从各种基质中回收DNA的效率，减少DNA损失。它适用于低模板量样本，并降低样本处理错误的风险[1][7][14]。然而，该方法也有局限性，例如容易受到模板携带的抑制物的影响，或者细胞裂解效果不佳[10][14]。

在法医评估中，子来源概率比用于确定DNA的来源，而活动水平概率比用于解释DNA是如何到达该位置的。法院越来越认识到，仅凭DNA的存在不足以做出决定；更重要的是DNA沉积的情境。活动水平评估用于根据辩护方和检方提出的不同假设来评估证据[7]。ReAct项目观察到不同实验室间DNA回收的显著差异[8]，并进一步表明这种差异直接影响基于活动水平假设计算出的概率比。因此，方法学选择（如提取程序）不仅对于生成可解释的分型结果至关重要，也对支持司法环境中的可靠活动水平报告至关重要。

在本研究中，我们使用新方法重新调查了一个旧案例，期望获得更高的DNA产量。首先，我们通过DNA量和子来源概率比来评估DNA结果的质量。其次，研究了不同方法对基于DNA转移和持久性概率模型的活动水平概率比的影响。我们比较了来自（i）本研究和（ii）先前实验[7]得出的活动水平概率比。对于后者，开发了一个基于先前描述的贝叶斯网络的概率框架，并进行了特定于案例的修改。最后，进行了RNA分析，以确定细胞物质的潜在来源及其对检测结果的影响。

**2. 材料与方法**
本研究获得了奥斯陆大学医院数据保护官（DPO）的伦理批准（参考编号：24/19717）。所有参与者均签署了书面知情同意书。

**2.1. 模拟药物包装**
20名参与者被要求提供他们日常使用的背包或手提包。研究人员戴上手套，将装有15毫升糖（作为药物包装模拟物）的密封袋放入每个物品内。这些密封袋放置24小时。在此期间，手动摇晃袋子五次，以模拟运输过程中的典型移动和接触情况，从而代表间接转移场景。

此外，为了模拟直接转移场景，13名参与者获得了一个新的空密封袋，并被要求打开和关闭三次，然后将其放入干净的信封中归还。所有操作均在洗手至少一小时之后进行。

**2.2. 样本收集**
**2.2.1. 转移研究**
从每个密封袋（密封袋1（S1）和密封袋2（S2）的外表面和锁扣处，以及直接接触的物品（S3）采集了样本。此外，还从个人背包的内表面（S4，约20平方厘米区域）采集了样本。

使用无菌湿润棉签进行拭取。S1使用湿润的Taper tip swab（MWSCS/F Taper tip Swab, Dryswab, MWE - Medical Wire）。对于S2、S3和内表面（S4），使用湿润的swab（MW1048/F Tubed Sterile Dryswab-Forensic, MWE-Medical Wire）。拭子干燥后存放在通风的证据袋中，等待进一步处理。从密封袋S1采集的拭子尖端直接剪下放入PCR管中进行分析。干燥后，从密封袋S2和内表面（S4）采集的拭子通过剪掉拭子尖端进行处理，然后转移到1.5毫升Eppendorf管中进一步分析（图1）。

**2.2.2. 提取研究**
本研究的目的是直接比较两种提取方法（Chelex提取法和共提取法）的效率。从4名参与者的皮肤（前臂和颈部）采集了20个样本，使用swab（MW1048/F Tubed Sterile Dryswab-Forensic, MWE-Medical Wire）。每个区域同时采集两个拭子，以保持相同的擦拭力度。拭子对分别采用Chelex提取法和共提取法处理。

**2.3. 样本处理**
**2.3.1. 直接PCR分析**
从S1采集的拭子直接进行分析，无需预先提取DNA。PCR反应混合物直接加入含有拭子尖端的试管中。使用PowerPlex Fusion 6 C System试剂盒（Promega，美国威斯康星州麦迪逊市）进行扩增，操作在Veriti 96孔热循环仪（ThermoFisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）上进行，遵循制造商的建议。

**2.3.2. DNA和RNA的共提取**
S2-S4的拭子采用QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN）和mirVana? miRNA分离Kit（Invitrogen，ThermoFisher）进行共提取。所用方法来自Lindenbergh等人的论文[15]，Wang等人[16]对其进行了部分修改。最终洗脱体积分别为RNA 60微升和DNA 100微升。

**2.3.2.1. Chelex样本分析**
一半的样本（2.2.2节）采用5% Chelex提取法[17]（无需预先用水孵育），向含有拭子的Eppendorf管中加入200微升5% Chelex（Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市）。样本在56°C下孵育30分钟（最后一分钟转速为1400转/分钟），然后在95°C下孵育8分钟。样本离心后，上清液转移到新的试管中，存放在-20°C。该协议按照Fonnel?p等人的方法进行[7]。

**2.3.2.2. DNA定量、扩增和分析**
使用PowerQuant系统（Promega，美国威斯康星州麦迪逊市）对S2-S4的样本进行定量分析。反应的制备遵循了制造商的建议，并通过qPCR在7500 Real-Time PCR系统（ThermoFisher，Waltham，MA，美国）上进行了分析。PCR扩增使用了PowerPlex Fusion 6 C系统（Promega，Madison，WI，美国）。PCR在Veriti 96孔热循环仪（ThermoFisher，Waltham，MA，美国）中进行，具体操作按照制造商的推荐进行（模板量为1 ng或如果无法达到1 ng则使用15 μL，反应体积为25 μL，扩增循环次数为29次）。毛细管电泳是在Applied Biosystems 3500xL遗传分析仪上进行的。样品以1.2 kV的电压注入，持续24秒。结果使用GeneMapper ID-X软件版本1.6（ThermoFisher，Waltham，MA，美国）进行分析。等位基因的分析阈值（AT）设定为100 RFU。

2.4 统计分析
考虑了两个分析水平。计算了子来源的似然比（Sub-source likelihood ratios），以评估DNA证据与来源归属之间的强度。另外，还计算了活动水平似然比（activity-level likelihood ratios），以评估关于DNA如何沉积的替代假设。当一个位点观察到三个或更多等位基因时，定义了一个潜在的DNA混合物。结果使用R版本4.3.0进行分析。

2.4.1 定量数据处理和根据子来源假设评估结果
子来源似然比（LRs）使用EuroForMix v.4.1.0在两个替代假设下计算：
Hp：DNA来源于感兴趣的人（POI）。
Hd：DNA来源于一个未知的、无关的个体。
当在一个标记物中观察到两个以上的等位基因时，在分子和分母中都包括了额外的未知贡献者。
贡献者的平均RFU计算为总RFU（RFU???）除以位点数量（n，不包括amelogenin），再乘以贡献者的混合比例，如公式1所示。
(1) RFUˉPOI = Mx × RFUtot
使用Wilcoxon秩和（Mann–Whitney U）非参数检验来评估两个独立组分布之间的差异。
归属于POI（QuantPOI）或未知贡献者的平均DNA浓度计算为总DNA量乘以相应的混合比例。
计算了每个袋子从个人包转移到密封袋中的百分比。转移比例（Tx）通过将密封袋上检测到的DNA量（S2）除以密封袋和钱包中检测到的总DNA量（S2+S4）来计算，如公式2所示。从密封袋1（S1）收集的样品未进行量化，因此不包括在转移百分比的计算中。
(2) Tx = QS2 / (QS2 + QS4)

2.4.2 根据活动水平假设评估生物学发现
2.4.2.1 案例示例
为了评估提高DNA提取效率对活动水平生物学发现解释的潜在影响，我们重新研究了Fonnel?p等人[7]中描述的案例示例。在这个场景中，在一个藏身处发现了一个大型的毒品仓库。毒品被储存在放在运动包内的密封袋中。嫌疑人（Person A）否认知道这些毒品的存在，但认出这个运动包以前是他的，并声称它是在两周前丢失或被盗的。
竞争的活动水平假设定义为：
Hp：嫌疑人包装了这些毒品。
Hd：嫌疑人与毒品无关，但他是这个运动包的前所有者，该运动包在两周前被盗。
当在一个标记物中观察到两个以上的等位基因时，在分子和分母中都包括了额外的未知贡献者。
贡献者的平均RFU计算为总RFU（RFU???）除以位点数量（n，23个，不包括amelogenin），再乘以贡献者的混合比例，如公式1所示。
(1) RFUˉPOI = Mx × RFUtot

2.4.2.2 根据活动水平假设评估生物学发现
2.4.2.1 案例示例
为了评估提高DNA提取效率对活动水平生物学发现解释的潜在影响，我们重新研究了Fonnel?p等人[7]中描述的案例示例。在这个场景中，在一个藏身处发现了一个大型的毒品仓库。毒品被储存在放在运动包内的密封袋中。嫌疑人（Person A）否认知道这些毒品的存在，但认出这个运动包以前是他的，并声称它是在两周前丢失或被盗的。
竞争的活动水平假设定义为：
Hp：嫌疑人包装了这些毒品。
Hd：嫌疑人与毒品无关，但他是这个运动包的前所有者，该运动包在两周前被盗。
当在一个标记物中观察到两个以上的等位基因时，在分子和分母中都包括了额外的未知贡献者。
贡献者的平均RFU计算为总RFU（RFU???）除以位点数量（n，23个，不包括amelogenin），再乘以贡献者的混合比例，如公式1所示。
(1) RFUˉPOI = Mx × RFUtot

2.4.2.3 分布拟合
对于每个组，使用fitdistrplus R包中的fitdist函数对正的POIconc值拟合了对数正态分布。这得到了直接和间接转移的组特定参数（μ，σ）。

2.4.2.4 零值膨胀（未检测到）
为了纳入观察到没有可测量数量的样本比例（未检测到），将参数化的尾部概率乘以（1?p0），其中p0代表每个组内的未检测率。为了稳定估计并避免边界伪影，应用了Jeffreys先验平滑：
(3) p0 = k + 0.5n + 1
其中k是n个样本中零值的数量。

2.4.2.2 数据
简而言之，感兴趣的人（POI）的DNA量用POIconc（ng/μL）表示作为定量质量指标。这反映了Fonnel?p等人[7]中§3.5.1的方法，其中使用了RFU值，但用POIconc替换了RFU。POIconc值也是从之前的实验[7]中提取的。此外，样本被分为直接组（用于确定t和t′函数）和间接组（用于确定s和b函数），遵循Fonnel?p等人[7]表2中的框架。
在实验设置中，袋子是由戴手套的调查人员包装的。因此，研究设计没有产生来自未知贡献者的直接转移观察结果，无法从实验数据中估计来自未知个体的直接转移概率（t′）。
因此，我们采用了Gill等人[18]描述的方法，采用代理t′=t，这反映了未知个体可能直接处理物品的案例场景。这个假设仅用于比较不同提取方法之间的似然比。如果在案例场景中假设使用了手套，t′将接近零，从而得到的活动水平似然比会显著降低。

2.4.2.3 分布拟合
对于每个组，使用fitdistrplus R包中的fitdist函数对正的POIconc值拟合了对数正态分布。这得到了直接和间接转移的组特定参数（μ，σ）。

2.4.2.4 零值膨胀（未检测到）
为了纳入观察到没有可测量数量的样本比例（未检测到），将参数化的尾部概率乘以（1?p0），其中p0代表每个组内的未检测率。为了稳定估计并避免边界伪影，应用了Jeffreys先验平滑：
(3) p0 = k + 0.5n + 1
其中k是n个样本中零值的数量。

2.4.2.2 数据
简而言之，感兴趣的人（POI）的DNA量用POIconc（ng/μL）表示作为定量质量指标。这反映了Fonnel?p等人[7]中§3.5.1的方法，其中使用了RFU值，但用POIconc替换了RFU。POIconc值也是从之前的实验[7]中提取的。此外，样本被分为直接组（用于确定t和t′函数）和间接组（用于确定s和b函数），遵循Fonnel?p等人[7]表2中的框架。
在实验设置中，袋子是由戴手套的调查人员包装的。因此，研究设计没有产生来自未知贡献者的直接转移观察结果，无法从实验数据中估计来自未知个体的直接转移概率（t′）。
因此，我们采用了Gill等人[18]描述的方法，采用代理t′=t，这反映了未知个体可能直接处理物品的案例场景。这个假设仅用于比较不同提取方法之间的似然比。如果假设在案例场景中使用了手套，t′将接近零，从而得到的活动水平似然比会显著降低。

2.4.2.3 分布拟合
对于每个组，使用fitdistrplus R包中的fitdist函数对正的POIconc值拟合了对数正态分布。这得到了直接和间接转移的组特定参数（μ，σ）。

2.4.2.4 零值膨胀（未检测到）
为了纳入观察到没有可测量数量的样本比例（未检测到），将参数化的尾部概率乘以（1?p0），其中p0代表每个组内的未检测率。为了稳定估计并避免边界伪影，应用了Jeffreys先验平滑：
(3) p0 = k + 0.5n + 1
其中k是n个样本中零值的数量。

2.4.2.2 数据
简而言之，感兴趣的人（POI）的DNA量用POIconc（ng/μL）表示作为定量质量指标。这反映了Fonnel?p等人[7]中§3.5.1的方法，其中使用了RFU值，但用POIconc替换了RFU。POIconc值也是从之前的实验[7]中提取的。此外，样本被分为直接组（用于确定t和t′函数）和间接组（用于确定s和b函数），遵循Fonnel?p等人[7]表2中的框架。
在实验设置中，袋子是由戴手套的调查人员包装的。因此，研究设计没有产生来自未知贡献者的直接转移观察结果，无法从实验数据中估计来自未知个体的直接转移概率（t′）。
因此，我们采用了Gill等人[18]描述的方法，采用代理t′=t，这反映了未知个体可能直接处理物品的案例场景。这个假设仅用于比较不同提取方法之间的似然比。如果假设在案例场景中使用了手套，t′将接近零，从而得到的活动水平似然比会显著降低。

2.4.2.3 分布拟合
对于每个组，使用fitdistrplus R包中的fitdist函数对正的POIconc值拟合了对数正态分布。这得到了直接和间接转移的组特定参数（μ，σ）。

2.4.2.4 零值膨胀（未检测到）
为了纳入观察到没有可测量数量的样本比例（未检测到），将参数化的尾部概率乘以（1?p0），其中p0代表每个组内的未检测率。为了稳定估计并避免边界伪影，应用了Jeffreys先验平滑：
(3) p0 = k + 0.5n + 1
其中k是n个样本中零值的数量。

2.4.2.2 数据
简而言之，感兴趣的人（POI）的DNA量用POIconc（ng/μL）表示作为定量质量指标。这反映了Fonnel?p等人[7]中§3.5.1的方法，其中使用了RFU值，但用POIconc替换了RFU。POIconc值也是从之前的实验[7]中提取的。此外，样本被分为直接组（用于确定t和t′函数）和间接组（用于确定s和b函数），遵循Fonnel?p等人[7]表2中的框架。
在实验设置中，袋子是由戴手套的调查人员包装的。因此，研究设计没有产生来自未知贡献者的直接转移观察结果，无法从实验数据中估计来自未知个体的直接转移概率（t′）。
因此，我们采用了Gill等人[18]描述的方法，采用代理t′=t，这反映了未知个体可能直接处理物品的案例场景。这个假设仅用于比较不同提取方法之间的似然比。如果假设在案例场景中使用了手套，t′将接近零，从而得到的活动水平似然比会显著降低。

2.4.2.3 分布拟合
对于每个组，使用fitdistrplus R包中的fitdist函数对正的POIconc值拟合了对数正态分布。这得到了直接和间接转移的组特定参数（μ，σ）。

2.4.2.4 零值膨胀（未检测到）
为了纳入观察到没有可测量数量的样本比例（未检测到），将参数化的尾部概率乘以（1?p0），其中p0代表每个组内的未检测率。为了稳定估计并避免边界伪影，应用了Jeffreys先验平滑：
(3) p0 = k + 0.5n + 1
其中k是n个样本中零值的数量。

2.4.2.2 数据
简而言之，感兴趣的人（POI）的DNA量用POIconc（ng/μL）表示作为定量质量指标。这反映了Fonnel?p等人[7]中§3.5.1的方法，其中使用了RFU值，但用POIconc替换了RFU。POIconc值也是从之前的实验[7]中提取的。此外，样本被分为直接组（用于确定t和t′函数）和间接组（用于确定s和b函数），遵循Fonnel?p等人[7]表2中的框架。
在实验设置中，袋子是由戴手套的调查人员包装的。因此，研究设计没有产生来自未知贡献者的直接转移观察结果，无法从实验数据中估计来自未知个体的直接转移概率（t′）。
因此，我们采用了Gill等人[18]描述的方法，采用代理t′=t，这反映了未知个体可能直接处理物品的案例场景。这个假设仅用于比较不同提取方法之间的似然比。如果假设在案例场景中使用了手套，t′将接近零，从而得到的活动水平似然比会显著降低。

2.4.2.3 分布拟合
对于每个组，使用fitdistrplus R包中的fitdist函数对正的POIconc值拟合了对数正态分布。这得到了直接和间接转移的组特定参数（μ，σ）。

2.4.2.4 零值膨胀（未检测到）
为了纳入观察到没有可测量数量的样本比例（未检测到），将参数化的尾部概率乘以（1?p0），其中p0代表每个组内的未检测率。为了稳定估计并避免边界伪影，应用了Jeffreys先验平滑：
(3) p0 = k + 0.5n + 1
其中k是n个样本中零值的数量。

2.4.2.2 数据
简而言之，感兴趣的人（POI）的DNA量用POIconc（ng/μL）表示作为定量质量指标。这反映了Fonnel?p等人[7]中§3.5.1的方法，其中使用了RFU值，但用POIconc替换了RFU。POIconc值也是从之前的实验[7]中提取的。此外，样本被分为直接组（用于确定t和t′函数）和间接组（用于确定s和b函数），遵循Fonnel?p等人[7]表2中的框架。
在实验设置中，袋子是由戴手套的调查人员包装的。因此，研究设计没有产生来自未知贡献者的直接转移观察结果，无法从实验数据中估计来自未知个体的直接转移概率（t′）。
因此，我们采用了Gill等人[18]描述的方法，采用代理t′=t，这反映了未知个体可能直接处理物品的案例场景。这个假设仅用于比较不同提取方法之间的似然比。如果假设在案例场景中使用了手套，t′将接近零，从而得到的活动水平似然比会显著降低。

2.4.2.3 分布拟合
对于每个组，使用fitdistrplus R包中的fitdist函数对正的POIconc值拟合了对数正态分布。这得到了直接和间接转移的组特定参数（μ，σ）。

2.4.2.4 零值膨胀（未检测到）
为了纳入观察到没有可测量数量的样本比例（未检测到），将参数化的尾部概率乘以（1?p0），其中p0代表每个组内的未检测率。为了稳定估计并避免边界伪影，应用了Jeffreys先验平滑：
(3) p0 = k + 0.5n + 1
其中k是n个样本中零值的数量。

2.4.2.2 数据
简而言之，感兴趣的人（POI）的DNA量用POIconc（ng/μL）表示作为定量质量指标。这反映了Fonnel?p等人[7]中§3.5.1的方法，其中使用了RFU值，但用POIconc替换了RFU。POIconc值也是从之前的实验[7]中提取的。此外，样本被分为直接组（用于确定t和t′函数）和间接组（用于确定s和b函数），遵循Fonnel?p等人[7]表2中的框架。
在实验设置中，袋子是由戴手套的调查人员包装的。因此，研究设计没有产生来自未知贡献者的直接转移观察结果，无法从实验数据中估计来自未知个体的直接转移概率（t′）。
因此，我们采用了Gill等人[18]描述的方法，采用代理t′=t，这反映了未知个体可能直接处理物品的案例场景。这个假设仅用于比较不同提取方法之间的似然比。如果假设在案例场景中使用了手套，t′将接近零，从而得到的活动水平似然比会显著降低。

2.4.2.3 分布拟合
对于每个组，使用fitdistrplus R包中的fitdist函数对正的POIconc值拟合了对数正态分布。这得到了直接和间接转移的组特定参数（μ，σ）。

2.4.2.4 零值膨胀（未检测到）
为了纳入观察到没有可测量数量的样本比例（未检测到），将参数化的尾部概率乘以（1?p0），其中p0代表每个组内的未检测率。为了稳定估计并避免边界伪影，应用了Jeffreys先验结果表明，使用共提取法提取的样本获得了更高的DNA浓度和更优质的亚源谱型（Log10LR）（平均DNA浓度=0.038 ng/μL；平均Log10LR=31.76）（图6，补充表S8），相比之下，使用Chelex 5%提取法的样本（平均DNA浓度=0.0065 ng/μL；平均Log10LR=21.97）（图6）。Wilcoxon秩和检验（双侧）显示DNA浓度的差异具有显著性（W=17，p=0.01）。下载：下载高分辨率图像（66KB）下载：下载全尺寸图像。图6. 盒状图显示了Chelex 5%提取（200 μL中的ng/μL）和共提取（100 μL中的ng/μL）的DNA浓度，以及使用EFM计算的亚源Log??LR值，Chelex 5%提取为蓝色，共提取为珊瑚色。

3.2.2. 直接PCR（S1）
对于使用直接PCR（S1）分析的从密封袋中收集的样本，我们在20个样本中有17个样本获得了与目标个体（POI）一致的DNA谱型（LR>100）。

与共提取谱型（S2）相比，S1的结果质量较低，背景噪声更多，峰值不那么明显（图7，补充表S1）。下载：下载高分辨率图像（75KB）下载：下载全尺寸图像。图7. 盒状图展示了（a）Log??RFU和（b）使用EFM计算的与目标个体（POI）相关的亚源Log??LR值，数据涵盖了三种样本制备方法：Chelex 5%提取 - 2020年数据（实验1，珊瑚色），直接PCR - S1（实验2，蓝色），以及共提取 - S2（实验2，绿色）。

3.2.3. 间接转移实验（所有方法）
在间接转移后收集的样本中，比较了三种（提取）方法的DNA谱型质量（RFU和亚源LR）：先前研究中的Chelex提取（2020年数据）[7]、直接PCR（S1）和共提取协议（S2）。观察到与目标个体（POI）匹配的Log?? RFU和亚源Log?? LR值在不同方法之间存在差异。直接PCR和共提取在DNA回收和谱型质量方面均优于Chelex（图7，补充表S7）。Chelex的平均Log?? RFU值为0.94（2020年数据），直接PCR为2.08，共提取为2.17。尽管S1和S2的RFU水平相似，但两种方法的谱型质量有所不同。S1的谱型表现出更大的变异性和噪声，而S2的谱型更为一致。这种差异反映在亚源Log?? LR值上，支持目标个体存在的假设：平均值分别为Chelex为5.53（2020年数据），直接PCR为17.2（S1），共提取为18.8（S2）。尽管S1和S2的峰值高度相当，但S2产生的LR值更高且更稳定。

Chelex和共提取方法之间的DNA浓度存在显著差异（Wilcoxon秩和检验，p < 0.001），表明提取方法影响DNA产量。考虑到Chelex协议中较高的洗脱体积，总DNA量也有显著差异（Wilcoxon秩和检验，p = 0.014），这证实了提取策略对DNA回收和后续解释的影响。

3.3. 根据活动水平假设评估生物学发现
对于Chelex和共提取方法，当DNA量超过给定阈值x时的超越概率（即超过阈值x的概率）随着阈值x的增加而降低（图8）。直接转移的概率始终高于间接转移的概率，反映了直接样本的信号更强。在所有阈值下，背景贡献保持较低，b(x)在最低阈值时接近0.05，并随着x的增加而进一步降低。下载：下载高分辨率图像（111KB）下载：下载全尺寸图像。图8. 作为DNA浓度阈值x（ng/μL）函数的直接转移（tA）、间接转移（s）和背景（b）的估计超越概率P(POIconc>x)，分别针对Chelex和共提取方法进行了展示。

方法比较显示，在低DNA量情况下，共提取方法通常为直接和间接转移提供更高的概率，直接转移的曲线在更宽的POIconc值范围内接近1，这反映了共提取方法改进的回收效率。

3.3.1. 根据活动水平假设计算似然比
在评估活动水平似然比时，考虑了两种DNA结果情景：(i) 样本中仅检测到目标个体（POI）的DNA；(ii) 检测到POI和另一个未知来源的DNA。
这些情景代表了不同的证据观察结果，而不是替代假设。
假设如下：
Hp：嫌疑人包装了毒品（预期为直接转移）
Hd：嫌疑人没有包装毒品；未知的人包装了毒品（预期为间接转移）。
似然比（LRs）是根据第2.5节描述的概率框架计算的。给定活动水平假设的LR比较了两种假设下的结果概率：Hp（嫌疑人包装了毒品）和Hd（嫌疑人没有参与，未知个体包装了毒品）。

3.3.1.1. Chelex
当仅观察到POI时，LR在8–12之间，表明对Hp的支持较弱。当同时观察到POI和未知个体时，LR小于1，大约在0.11–0.16之间，这表明对未知个体包装物品的假设支持较弱。

3.3.1.2. 共提取
仅观察POI的情景下的LR显著更高，介于32–95之间，反映了这种方法下直接和间接概率之间的较大差异。对于包含未知个体的混合物，LR保持在1以下（约0.06–0.16），同样对未知个体包装物品的假设支持较弱。

表1. 根据活动水平假设的似然比（LR），对于两种DNA结果情景（单一谱型匹配；观察到POI和未知个体），按提取方法（Chelex和共提取）分层。
样本中检测到的POI DNA（ng/μL）
Chelex LR
POI检测到
Chelex LR
POI和未知个体都检测到
共提取 LR
POI检测到
共提取 LR
POI和未知个体都检测到
08.30.13
1.60.10.00
1211.60.24
4.40.10.00
1512.00.24
7.80.10.00
811.70.28
4.10.20.01
1210.90.19
0.70.20.03
537.60.19
5.20.20.04
127.20.19

4. 讨论
4.1. DNA转移
无论提取方法如何，直接转移实验中的DNA量始终高于间接转移情景（图2）。这一观察结果与已建立的法医原理和ReAct项目的发现一致，这些发现表明直接物理接触通常会导致比间接转移更多的DNA沉积[1]、[6]、[7]、[8]、[19]。
尽管从背包和手提包中检测到的初始DNA量相当，但我们的研究发现，在间接转移情景中，手提包的DNA转移百分比更高。背包通常具有更大的内表面面积。尽管在储存过程中进行了摇晃以促进摩擦和密封袋的移动，但密封袋可能并未与整个内表面接触，从而减少了从背包内部到外部? DNA转移。
支持这一观察结果的是，Fonnel?p等人[7]的研究表明，袋子的内表面特性影响DNA的保留和随后的转移。假设手提包中经常存放经常被处理的个人物品，因此会积累更多的DNA，从而促进向内部存储物品的DNA转移。我们的发现进一步证实了这一点，即手提包中的DNA转移百分比更高。尽管从手提包内部收集的样本产生的DNA量较低，但它们向密封袋转移的DNA量更多。这强调了在法医背景下评估DNA转移时需要考虑特定材料和使用特性的重要性[7]。
观察到从非多孔表面到密封袋的DNA转移百分比更高（图5）。这与H. Arsenault等人[4]描述的DNA转移原理一致，其中基底特性强烈影响DNA的保存和转移效率：多孔材料（如纸板、棉花、纸张）吸收和保留DNA，阻碍了DNA的回收，而非多孔表面（如玻璃、塑料、金属）则允许更轻松的DNA转移。通过擦拭从多孔基底回收DNA可能会受到限制，尽管DNA保留量较高[1]、[4]。这些发现共同表明，基底特性影响亚源检测概率和间接转移分布的形状，进而影响活动水平评估。

4.2. 提取策略和谱型性能
4.2.1. Chelex
在法医工作中，选择DNA提取方法至关重要，因为法医样本的数量通常有限且已经降解。在这项研究中，我们将基于树脂的提取方法Chelex 5%与结合两种不同试剂盒的共提取方法进行了比较：QIAamp DNA mini试剂盒和mirVana? miRNA分离试剂盒。共提取方法在DNA产量和质量方面都表现出更高的效率，在直接和间接转移实验中均优于Chelex。虽然Chelex已被证明是一种可行的法医样本提取方法，但在存在抑制剂的情况下，其性能可能会受到限制[3]、[11]、[12]。
为了支持这一解释，我们还在本研究中使用从相同皮肤区域收集的配对拭子进行了对照提取实验。在这些条件下，共提取协议始终产生了比Chelex更高的DNA浓度和更高的亚源LR值，证实观察到的差异归因于提取效率而非实验之间的差异。
这种差异可能反映了潜在的裂解化学过程。Chelex依赖于热处理和离子螯合来释放DNA，而共提取协议中使用的mirVana?裂解缓冲液含有强变性剂和还原剂2-巯基乙醇，这些成分能更有效地破坏细胞结构，包括在接触DNA中常见的角质化细胞。延长的孵育时间进一步增强了细胞破坏和DNA释放。此外，QIAamp?试剂盒中的DNA在硅胶柱上捕获后经过严格清洗，产生更干净的提取物，含有更少的抑制剂，并在稳定的低盐缓冲液中回收。相比之下，Chelex产生的提取物较为粗糙且不稳定，可能会影响后续分析和储存。
Fantonato等人[3]也报告了类似的结果，他们发现将QIAamp DNA mini试剂盒与mirVana? miRNA分离试剂盒结合使用，可以持续产生比稍微修改的QIAamp DNA mini试剂盒方法更高的DNA产量。使用定制的提取协议，特别是裂解缓冲液的组成和孵育条件（温度和持续时间），对于从接触样本中回收DNA具有显著潜力，特别是对于需要强烈裂解条件的角质形成细胞[3]。
vanOorschot等人[1]确认，DNA回收效率因收集和提取方法的不同而显著变化，这直接影响观察到的转移率。包括ReAct项目在内的实验室间研究也强调了由于采样技术、提取方法和PCR策略的差异，不同实验室之间的DNA产量中位数存在显著差异[1]、[4]。

4.2.2. 直接PCR
直接PCR在法医遗传学中被认为是有优势的，特别是对于低模板量或微量样本。通过省略提取步骤，该方法减少了DNA损失，缩短了处理时间，并降低了样本处理错误的风险。据报道，它还提高了某些基底和参考样本的成功率，使其成为特定法医工作流程中的实用替代方案[10]、[14]。为了进一步提高从密封袋中回收DNA的效率，直接PCR被应用于从第二个密封袋中收集的样本。将直接PCR（S1）的基因分型结果与Chelex（2020年数据）的结果进行比较时，直接PCR产生了更强的谱型，更多的等位基因与供体匹配，峰值也更高。这可能反映了Chelex的局限性，即它经常无法有效裂解某些细胞类型，并且在大量提取体积下会导致DNA稀释，从而降低DNA回收率和扩增效果[10]、[19]。PCR抑制也可能是一个因素，因为Chelex去除抑制剂的能力有限。这些发现与第4.3节中的观察结果一致。
相比之下，QIAamp DNA mini试剂盒与mirVana? miRNA分离试剂盒的组合（S2, S4）的表现优于直接PCR（S1）。尽管直接PCR旨在通过省略提取步骤来减少DNA损失，但该方法产生的峰值略高，噪声更少，整体结果质量更好。这可能反映了DNA产量和纯度之间的平衡：虽然直接PCR将所有可用模板引入反应，但它也携带抑制剂和细胞碎片，可能会影响扩增效率和谱型质量。相比之下，提取协议结合了有效的细胞裂解和有效的抑制剂去除，产生了更干净的提取物，从而支持了更强的扩增效果。因此，性能的提升最好解释为裂解效果的改善和抑制作用的减少，这超过了与硅胶纯化相关的适度DNA损失。

商业STR扩增试剂盒现在采用了先进的缓冲剂-聚合酶配方，旨在减轻常见PCR抑制剂的影响[10]。虽然这些试剂盒能够耐受多种抑制物质（例如血红素、金属离子、锈蚀、土壤），但它们并不能物理上去除这些抑制物，这仍然可能导致扩增效率降低以及基因分型结果不完整或无法获得[10]，[14]。直接PCR通常在第一个PCR循环的变性步骤开始细胞裂解，但这可能并不适用于所有类型的细胞[14]。此外，一个关键的限制是整个样本在扩增过程中被消耗掉，没有剩余的样本用于重新分析[10]，[14]。在直接PCR中，拭子切割大小是一个重要的考虑因素。Templeton等人[20]证明，较小的片段（约2平方毫米）可以减少抑制作用并增强DNA的释放。我们进行了一项初步的试点研究（数据未显示）来找到最佳的切割大小。在我们的研究中，我们测试了三种片段大小：小、中、大，分别约为1平方毫米、2平方毫米和3平方毫米，以评估它们的性能，结果发现小尺寸的片段始终提供了最佳的结果。需要注意的是，所谓的“小”拭子切割可能实际上过大，导致额外的物质被释放，减少了试剂的可用性并引入了抑制物，从而影响了PCR的效率。这突显了在直接扩增策略中控制拭子大小的重要性。

尽管一些研究认为直接PCR由于DNA损失较少而适用于具有挑战性的样本，但在选择适当的方法时必须考虑到其局限性，如残留的抑制物和较低的细胞裂解效率[21]，[22]。我们的研究表明，使用高效的提取方案（如QIAamp DNA mini试剂盒与mirVana? miRNA分离试剂盒的组合）可以获得更好的结果。

4.3. 根据活动水平命题评估生物学发现
改变提取方法改变了直接转移和间接转移的目标化合物（POI）的浓度分布。通过共提取方法，观察到了更高的POI浓度和更少的未检测结果，从而使得直接转移曲线比使用Chelex方法时更为陡峭。由于活动水平的比值比主要取决于直接转移和间接转移分布之间的分离程度，这种变化在仅观察到POI时表现为更高的比值比。相反，当同时观察到POI和未知物质时，采用保守的规则处理未知物质使得两种方法的比值比都低于1，这支持了“未知个体负责包装物品”的命题。

这些发现与ReAct项目的结果一致[8]，该项目表明实验室协议的变化（包括提取效率）对DNA回收率以及直接转移和间接转移的分布有显著影响。ReAct强调，评估活动水平的关键因素不是绝对的DNA产量，而是分布之间的相对分离程度。我们的数据提供了一个具体的例子：方法的变化扩大了这种分离程度，并在仅检测到POI的情况下提高了比值比。

这些发现具有双重意义。首先，在评估活动水平时必须明确报告实验室方法，因为提取协议的变化会影响证据的有效性。其次，只有当不同研究或实验室之间的阈值、未检测结果的处理方式以及背景校正方法一致时，才能进行比值比的比较。这些建议与ReAct的结论相符，后者呼吁提高透明度并实现标准化，以确保不同实验室之间活动水平评估的可比性。

本研究的局限性包括阳性计数相对较少、依赖于对数正态分布的假设以及对未检测比例估计的敏感性。ReAct项目进一步强调了实验室间存在的显著差异，这表明需要更大的多实验室数据集来加强关于方法对活动水平比值比影响的普遍性结论。

在实验设置中，袋子是由戴手套的调查人员包装的，这意味着在生成的数据中不存在来自未知来源的直接转移。在这种情况下，来自未知来源的直接转移的概率（t′）预计会非常低，几乎与间接转移（s）相当，从而导致活动水平的比值比显著降低。然而，在实际案例中，物品的处理历史通常是未知的，无法假设使用了手套。为了保持普遍适用性，活动水平模型采用了标准假设t′(x)=t(x)，代表未知个体可能直接处理了物品的情况。

本研究中的案例示例旨在说明不同的提取方法如何影响活动水平的比值比。使用假设t′=t允许我们专注于提取效率的影响，而不是实验中使用了手套这一限制因素。如果在真实案例中假设使用了手套，那么得到的活动水平比值比预计会显著降低。

5. 结论
我们的结果表明，DNA的转移和回收受到接触类型、基底和物品特性的影响，其中直接转移和未被渗透处理的物品产生了最高的产量。提取方法也起着关键作用：使用QIAamp和mirVana?试剂盒的共提取方案优于Chelex方法，而直接PCR虽然快速但效率较低。这些发现强调了仔细考虑提取方法、基底和物品类型的重要性，以确保对法医DNA和活动水平证据的可靠解释。

至关重要的是，方法上的变化会影响到活动水平的评估。透明的报告和跨实验室的标准化对于确保在法医证据评估中正确考虑这些方法效应至关重要。因此，我们建议实验室明确验证并记录他们所选提取方法对活动水平评估中使用的转移/持久性函数的影响，特别是在重新审查历史案例时。

**作者贡献声明**
Sara Faria：撰写——原始草稿、方法学、调查、正式分析、概念化。
Ane Elida Fonnel?p：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、调查、正式分析、概念化。
Francisco Pina-Martins：监督、方法学、概念化。
Ana Clara Ribeiro：监督、方法学。
Peter Gill：撰写——审阅与编辑、方法学、概念化。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。