PowerPlex? 18E系统的开发验证：一种用于人类身份识别应用的8色STR多重检测技术

《Forensic Science International: Reports》：Developmental Validation of the PowerPlex? 18E System: An 8-Dye STR Multiplex for Human Identification Applications

　　乔妮尔·M·汤普森（Jonelle M Thompson）| 迈克尔·劳克（Michael Lauck）| 伊丽莎白·S·汉密尔顿（Elizabeth S Hamilton）| 海瑟·霍奇斯（Heather Hodges）| 马克西米利安·奈斯（Maximilian Neis）| 科尼利厄斯·考茨（Cornelius Courts）| 艾米·哈克（Aimee Hack）| 艾伦·皮尔斯（Alan Pierce）| 大卫·摩尔（David Moore）| 卡佳·安斯林格（Katja Anslinger）| 比尔吉特·拜尔（Birgit Bayer）| 彼得·M·瓦洛内（Peter M. Vallone）| 卡罗琳·R·斯蒂芬（Carolyn R Steffen）| 雷切尔·克诺纳（Rachel Knoener）| 卡蒂卡·迪瓦卡兰（Karthika Divakaran）| 斯蒂芬·麦克丹尼尔（Stephen McDaniel）| 罗伯特·S·麦克拉伦（Robert S McLaren）
Promega公司，地址：美国威斯康星州麦迪逊市伍兹霍洛路2800号，邮编53711

**摘要**
PowerPlex? 18E系统是一种包含18个位点、使用8种染料的STR多重检测技术，专为Spectrum CE系统和Spectrum Compact CE系统设计。该系统可同时扩增所有12个ENFSI推荐的位点，以及SE33、D2S1338、D16S539、D19S433和两个用于确定生物性别的位点。此外，系统还包含两个质量指标，用于指示样本质量和扩增效果。PowerPlex? 18E系统既适用于纯化提取物的DNA扩增，也适用于直接扩增数据库中的样本。由于使用了8种不同的染料，所有位点的扩增产物长度均小于325 bp，这提高了实验室处理降解或复杂样本的成功率。根据SWGDAM指南，对PowerPlex? 18E系统进行了多实验室开发验证研究，研究结果证明了该系统在人类身份鉴定DNA分型应用中的可靠性和稳定性。

**引言**
PowerPlex? 18E系统是一种包含18个位点、使用8种染料的STR多重检测技术，专为Spectrum CE系统[1]和Spectrum Compact CE系统[2]设计（图1）。该试剂盒支持案件分析和数据库样本处理两种工作流程。染料体系包括蓝色通道（FL-8C）、绿色通道（JOE-8C）、蓝色通道（AQA-8C）、黄色通道（TMR-8C）、红色通道（CXR-8C）、紫色通道（TOM-8C）和橙色通道（WEN-8C）。内部标准片段500（CCO ILS 500）的扩增产物可通过CCO-8C通道检测到。

**图1. PowerPlex? 18E系统各位点的分布情况（按染料通道和碱基对长度分类）**
- **QIS**：小质量指标（Quality Indicator Small）
- **A**：阿梅洛基因（Amelogenin）
- **QIL**：大质量指标（Quality Indicator Large）
- **ILS500**：标准长度峰（nt），用于表示位点的相对位置

PowerPlex? 18E系统可同时扩增12个ENFSI推荐的位点（FGA、TH01、vWA、D1S1656、D2S441、D3S1358、D8S1179、D10S1248、D12S391、D18S51、D21S11和D22S1045），以及用于生物性别分型的D16S539、D19S433、D2S1338和SE33，还有阿梅洛基因（Amelogenin）和DYS391。从6个染料通道扩展到8个染料通道后，所有位点的扩增产物长度均小于325 bp，尤其是高度区分度的SE33位点。这一扩增产物长度范围与PowerPlex? 35GY[3]相似（169 bp至319 bp），但比其他STR系统的实际扩增产物长度更短。相比之下，PowerPlex? Fusion 6C[4]的SE33扩增产物长度范围为270 bp至408 bp，PowerPlex? ESX 17 Fast[5]的扩增产物长度范围为267 bp至417 bp。该系统包含两个质量指标（QIS和QIL），有助于分析和解释STR数据。

**多实验室开发验证研究**
根据SWGDAM指南[6]进行了多实验室开发验证研究，以证明PowerPlex? 18E系统的可靠性和稳定性。研究内容涵盖了灵敏度、混合样本、物种特异性、稳定性、精确度、准确性以及案例类型样本和人群研究等方面。由于SWGDAM指南未强制要求进行降解研究，因此本研究中未包含该部分内容。

**材料与方法**
**DNA扩增**
本文中呈现的所有数据均使用Promega公司销售的PowerPlex? 18E系统组件生成。提取的DNA扩增按照PowerPlex? 18E系统技术手册[1][2]中描述的默认循环协议进行。除非另有说明，每个扩增反应的最终体积为25 μL，含有0.5 ng的DNA。反应混合物包括：5 μL的PowerPlex? 18E 5X Master Mix、2.5 μL的PowerPlex? 18E 10X Primer Pair Mix，以及最多17.5 μL的模板DNA（Promega公司生产）。热循环条件为：96°C预热1分钟；随后进行30个循环，每个循环包括98°C 5秒、60°C 1分钟和72°C 15秒；最后在60°C下延伸10分钟，然后置于4°C环境中静置。阳性对照样本含有0.5 ng的2800 M。

**直接扩增**
来自单一来源的参考样本的直接扩增按照PowerPlex? 18E系统技术手册[1][2]中的循环协议进行，最终反应体积为12.5 μL。反应混合物包括：2.5 μL的PowerPlex? 18E 5X Master Mix、1.25 μL的PowerPlex? 18E 10X Primer Pair Mix、1-4 μL的PowerPlex? 18E QI Reagent（Promega公司生产）。默认的热循环条件为：96°C预热1分钟；随后进行24个循环，每个循环包括98°C 5秒、60°C 1分钟和66°C 1分钟；最后在60°C下延伸10分钟，然后置于4°C环境中静置。对于拭子样本，反应混合物中需加入2 μL的SwabSolution?裂解液。

**使用直接扩增协议时需调整QI试剂的用量**
在使用直接扩增协议时，需调整添加的PowerPlex? 18E QI Reagent的量：23个循环添加4 μL，24个循环添加2 μL，25个循环添加1 μL。增加QI试剂的用量可以提高直接扩增反应中质量指标峰的高度，从而补偿循环次数的减少。

**样本类型**
人类血液样本使用SwabSolution?试剂[7]（Promega公司生产）提取，随后使用Maxwell? FSC DNA IQ? Casework Kit[8]（Promega公司生产）进行纯化，并用PowerQuant? System[9]（Promega公司生产）进行定量。这些样本用于除案例类型分析、重复序列分析和一致性分析之外的所有研究。案例类型样本使用Maxwell? DE System[10]（Promega公司生产）、Bone DNA Extraction Kit[11]（Promega公司生产）以及Maxwell? FSC DNA IQ? Casework Kit[8]提取，以模拟法医案件中常见的样本类型。选择人类供体来源的DNA是为了更真实地反映法医样本中的DNA质量和完整性，因为细胞系来源的参考标准无法完全代表实际样本情况。重复序列分析和一致性分析使用的是美国国家标准与技术研究院（NIST）提供的美国人群样本。

**灵敏度研究**
使用两名DNA供体（DNA1和DNA2）进行了灵敏度研究，稀释范围为4 ng至7.8 pg。除非另有说明，所有扩增反应均重复四次进行。

**混合样本研究**
混合样本研究使用了男女比例为19:1、9:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:9和1:19的混合样本。所选样本旨在尽量减少供体之间的等位基因共享。此外，还使用了男女比例为1:1:10和1:1:20的混合样本。混合样本研究在德国科隆大学法医学研究所、英国Eurofins Forensic Services公司和慕尼黑LMU法医学研究所进行了三次重复实验。

**基于PCR的研究**
评估了多种条件对扩增反应的影响，包括反应体积（25 μL vs 12.5 μL）、循环次数（29次、30次和31次）、退火温度（58°C、60°C和62°C）以及PCR反应成分。不同反应体积下的扩增实验分别在25 μL和12.5 μL条件下进行，DNA质量或浓度固定。对于固定DNA质量的情况，每25 μL或12.5 μL反应体积扩增500 pg或100 pg的DNA；对于固定DNA浓度的情况，每25 μL或12.5 μL反应体积扩增20 pg/μL或4 pg/μL的DNA。引物对和Master Mix的浓度分别为0.8X、1.0X和1.2X。

**物种特异性**
虽然PowerPlex? 18E引物是人类特异性的，但高浓度的非人类DNA可能导致非特异性结合，产生低水平的非目标扩增产物。物种研究使用了从ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）和Novagen?（加利福尼亚州圣地亚哥）购买的商业非人类DNA。每种脊椎动物或微生物物种均扩增两次，以模拟可能存在大量非人类DNA的法医案例（见补充图1）。这些细菌物种代表了人类微生物组中常见的微生物，以及可能因污染或分解而出现在法医样本中的环境或机会性病原体。哺乳动物物种包括家养动物或常见食物来源中的非人类DNA。此外，还扩增了四种非人类灵长类动物（黑猩猩、猕猴、猩猩和大猩猩），每种扩增两次，浓度为0.5 ng。

**稳定性研究**
稳定性研究评估了男性DNA样本在四种常见法医抑制剂（Sigma–Aldrich公司生产）存在下的扩增情况。通过测试不同浓度的血红蛋白（0 μM、500 μM、750 μM和1000 μM）、腐殖酸（0 ng/μL、100 ng/μL、200 ng/μL和300 ng/μL）、单宁酸（0 ng/μL、500 ng/μL、750 ng/μL和1000 ng/μL）和EDTA（0 μM、750 μM、1000 μM）对扩增的影响。

**一致性分析**
一致性分析在NIST使用NIST 1036个美国人群样本[14][15]的一个子集（n = 657个样本）以及标准参考物质2391d（Components A-C和E）[16]中的四种单一来源成分进行，共661个样本。该人群数据集已用于多种商业STR系统的验证研究，便于跨平台进行一致性比较。同样使用这661个样本研究了重复序列比例。NIST人群样本经过单次扩增处理。

**重复序列分析**
计算了N-1和N+1重复位点的重复序列百分比。对于D1S1656、FGA和SE33等位基因，还评估了比主等位基因短两个核苷酸的重复位点的重复序列情况。未包括位于杂合等位基因之间、相差两个重复单位的重复位点，以避免正负重复序列的叠加效应。只有当真实等位基因峰的高度至少为5,000 RFU且不超过20,000 RFU时才计算重复序列比例。选择5,000 RFU的下限是为了确保重复序列比例的计算结果反映真实的重复序列产物，而非仪器噪声引起的信号干扰。

**案例类型样本**
测试了多种案例类型样本，包括骨骼、牙齿和生物液体（血液、唾液、精液），样本采集方式符合Promega公司的知情同意政策。

**直接扩增研究**
使用来自不同来源的样本进行了直接扩增实验：一名供体的血液和颊拭子样本在FTA?卡片（Whatman公司生产）上进行扩增；另一名供体的颊细胞在Bode Buccal? DNA Collectors（Bode Technology公司生产）上进行扩增；两名供体的颊细胞在棉拭子上进行扩增；一名供体的血液在S&S 903纸（Whatman公司生产）上进行扩增。直接扩增反应使用卡片上的1.2 mm打孔器进行。Bode Buccal? DNA Collector和S&S 903纸在使用前需用PunchSolution?试剂[17]（Promega公司生产）预处理。将打孔器在PunchSolution?试剂中30°C孵育后，细胞直接裂解，无需额外提取步骤。棉拭子使用SwabSolution?试剂预处理。

**结果分析**
所有直接扩增反应均在23、24或25个循环条件下进行。对于裂解卡片基底，评估了不同反应体积（12.5 μL vs 25 μL）的影响。除非另有说明，所有扩增反应均重复四次进行。所有直接扩增样本的采集均符合Promega公司的知情同意政策。

**实验室参与情况**
除NIST外，所有实验室均参与了灵敏度、混合样本、精确度和准确性研究。NIST负责进行了重复序列分析和一致性分析。其他研究均由Promega公司在Spectrum CE系统上进行。直接扩增测试由Promega Corporation执行。尽管PowerPlex? 18E是在ProFlex? PCR系统[1]、[2]（Applied Biosystems，Foster City，CA）和Eppendorf Mastercycler? X50s PCR系统[1]、[2]（Eppendorf，汉堡，德国）上开发和优化的，但在开发验证中也包括了其他类型的PCR仪。PCR仪的列表见表1。

表1. 与PowerPlex? 18E系统一起使用的热循环仪系统。

制造商 品牌 热循环仪型号 升温速率 测试地点
Applied Biosystems? ProFlex? PCR System 6°C/s Promega和NIST
Applied Biosystems? SimpliAmp? Cycler 4°C/s 科隆
Applied Biosystems? Veriti? Pro Thermal Cycler 6°C/s 慕尼黑
Applied Biosystems? Veriti? Thermal Cycler 6°C/s 欧洲芬斯

DNA片段和数据分析
DNA片段检测是在Spectrum CE System 8-Capillary [18]（Promega Corp）或Spectrum Compact CE System [19]（Promega Corp）上进行的。校准遵循了这两种仪器各自的说明书，使用的是PowerPlex? 8 C Matrix Standard [20]、[21]（Promega Corp）。每个注入Spectrum CE系统的样本包含1 μL的扩增样本或PowerPlex? 18E等位基因梯子、9.5 μL的Hi-Di?甲酰胺（Applied Biosystems）和0.5 μL的CCO内部泳道标准品（ILS）500。样本在95°C下热变性3分钟，然后迅速冷却3分钟。所有样本都按照相应毛细管电泳仪的默认注入条件进行注入。

GeneMarker?
使用GeneMarker?HID软件（版本3.2.0）对Spectrum CE系统的数据进行分析，该软件配备了Promega开发的适当面板、分组和抖动值。平均峰高是通过将所有重复实验中所有位点的所有检测到的峰高相加，然后除以预期的峰总数（即每个常染色体位点有两个峰）来计算的。等位基因缺失被视为总和中的0 RFU峰。质量指示峰（QIS和QIL）被排除在峰高计算之外。

两个人混合分析
包括计算仅来自次要供体的所有等位基因，以及抖动位置，这些结果以预期独特等位基因总数的百分比表示。

基线噪声和阈值分析
分析了Promega数据集中的0.5 ng灵敏度样本，以确定Spectrum CE系统和Spectrum Compact CE系统中提取DNA的分析阈值。在Spectrum CE系统上分析了8个直接扩增样本，以确定直接扩增的阈值。分析阈值的确定是通过在GeneMarker?HID软件中将读取阈值设置为1 RFU来完成的。对于每个染料通道，确定了噪声峰的平均高度和标准差，然后将标准差的十倍加到每个平均噪声值上，然后向上取整到最接近的5 RFU，以确定每个染料的分析阈值。对于提取的DNA，应用了特定于染料的分析阈值，以考虑模板输入量的广泛范围、染料通道之间的变异性以及此工作流程中可能遇到的混合来源样本。

基线噪声和阈值分析

结果和讨论
物种特异性
PowerPlex? 18E系统中的引物是专门设计用于靶向人类DNA的。然而，大量非人类DNA的存在可能导致非特异性引物退火，从而可能产生可检测的扩增产物。为了测试交叉反应性，扩增了12种微生物物种、10种脊椎动物物种（非灵长类）和4种非人类灵长类物种（补充图1）。在测试的任何微生物物种中，都没有在60到500个核苷酸大小范围内检测到扩增产物（数据未显示）。在测试的哺乳动物中，只有猪的基因组DNA产生了高于分析阈值的峰（表3）。由于人类和非人类灵长类之间的遗传相似性，测试的4种非人类灵长类物种产生了特征性峰型。然而，这些峰型可以通过超出分组范围的峰、偏离梯子的峰和变异等位基因与人类DNA区分开来（补充图2）。例如，在提供的图中，有六个超出分组范围的等位基因、两个微变异、三个具有多个等位基因的位点，以及四个没有等位基因的位点。由于这些物种之间的密切进化关系，非人类灵长类DNA中存在微变异、超出分组范围的峰和意外的等位基因计数是预期中的。[23]

表3. 使用PowerPlex? 18E系统测试的非灵长类脊椎动物（n=2）。

非灵长类脊椎动物 DNA
测试量 超过分析阈值的峰 大约的伪影大小
猫 5 ng 否
鸡 5 ng 否
牛 5 ng 否
鹿 5 ng 否
狗 5 ng 否
马 5 ng 否
小鼠 5 ng 否
猪 5 ng 是
371 nt至373 nt / 433 RFU至1668 RFU (JOE-8C)，370 nt至371 nt / 633 RFU至1092 RFU (TMR-8C)
兔子 5 ng 否
大鼠 5 ng 否

灵敏度研究
PowerPlex? 18E系统在三种不同的Spectrum CE系统和两种Spectrum Compact CE系统上进行了评估，检测范围从4 ng到7.8 pg。所有测试系统在DNA输入浓度低至62.5 pg时都能检测到100%的等位基因。从31.25 pg到7.8 pg的DNA，检测到的等位基因百分比有所下降（表4）。这种灵敏度水平适合处理具有挑战性的法医样本类型。不同系统的平均峰高结果如图2所示。峰高的差异可能受到所使用的热循环仪和毛细管电泳仪的影响，这强调了在内部验证期间进行实验室特定灵敏度研究的重要性。

表4. PowerPlex? 18E系统在不同热循环仪和毛细管电泳系统上的平均峰高百分比（4 ng至7.8 pg）与DNA模板质量的关系。热图表示最低（红色）到最高（绿色）的百分比峰型（n=8）。

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图2. PowerPlex? 18E系统的灵敏度系列平均峰高。误差条表示±1标准差（n = 8）。

这里报告的分析阈值是基于经验得出的，反映了Spectrum CE系统、GeneMarker?HID软件和PowerPlex? 18E系统化学特性的噪声特性。由于RFU是一个特定于仪器的相对单位，而不是标准化的SI单位，因此AT值不能在不同CE平台、软件或化学方法之间直接比较。这些值与之前在Spectrum CE系统上的开发验证结果一致。[13]

结果和讨论
物种特异性
PowerPlex? 18E系统中的引物是专门设计用于靶向人类DNA的。然而，大量非人类DNA的存在可能导致非特异性引物退火，从而可能产生可检测的扩增产物。为了测试交叉反应性，扩增了12种微生物物种、10种脊椎动物物种（非灵长类）和4种非人类灵长类物种（补充图1）。在测试的任何微生物物种中，都没有在60到500个核苷酸大小范围内检测到扩增产物（数据未显示）。在测试的哺乳动物中，只有猪的基因组DNA产生了高于分析阈值的峰（表3）。由于人类和非人类灵长类之间的遗传相似性，测试的4种非人类灵长类物种产生了特征性峰型。然而，由于超出分组范围的峰、偏离梯子的峰和变异等位基因的存在，这些峰型可以与人类DNA区分开来（补充图2）。例如，在提供的图中，有六个超出分组范围的等位基因、两个微变异、三个具有多个等位基因的位点，以及四个没有等位基因的位点。由于这些物种之间的密切进化关系，非人类灵长类DNA中预期会出现微变异、超出分组范围和意外的等位基因计数。[23]

表3. 使用PowerPlex? 18E系统测试的非灵长类脊椎动物（n=2）。

非灵长类脊椎动物 DNA
测试量 超过分析阈值的峰 大约的伪影大小
猫 5 ng 否
鸡 5 ng 否
牛 5 ng 否
鹿 5 ng 否
狗 5 ng 否
马 5 ng 否
小鼠 5 ng 否
猪 5 ng 是
371 nt至373 nt / 433 RFU至1668 RFU (JOE-8C)，370 nt至371 nt / 633 RFU至1092 RFU (TMR-8C)
兔子 5 ng 否
大鼠 5 ng 否

灵敏度研究
PowerPlex? 18E系统在三种不同的Spectrum CE系统和两种Spectrum Compact CE系统上进行了评估，检测范围从4 ng到7.8 pg。所有测试系统在DNA输入浓度低至62.5 pg时都能检测到100%的等位基因。从31.25 pg到7.8 pg的DNA，检测到的等位基因百分比有所下降（表4）。这种灵敏度水平适用于处理具有挑战性的法医样本类型。不同系统的平均峰高结果如图2所示。峰高的差异可能受到所使用的热循环仪和毛细管电泳仪的影响，这强调了在内部验证期间进行实验室特定灵敏度研究的重要性。

表4. PowerPlex? 18E系统在不同热循环仪和毛细管电泳系统上的平均峰高百分比（4 ng至7.8 pg）与DNA模板质量的关系。热图表示最低（红色）到最高（绿色）的百分比峰型（n=8）。

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图2. PowerPlex? 18E系统的灵敏度系列平均峰高。误差条表示±1标准差（n = 8）。

随着DNA模板量的增加，峰高呈线性增加。对于最多1 ng的DNA模板，回归线的R2值达到0.99或更高（数据未显示）。在扩增500 pg的DNA时，所有系统的平均姐妹等位基因峰高比率均大于74%（数据未显示）。随着模板量的增加，峰高比率下降，从31.25 pg开始明显下降（补充图3）。

稳定性研究
环境抑制剂会影响从法医样本中获取谱型的扩增性能。测试了血红蛋白（500 μM、750 μM和1000 μM）、腐殖酸（100 ng/μL、200 ng/μL和300 ng/μL）、单宁酸（500 ng/μL、750 ng/μL和1000 ng/μL）和EDTA（750 μM、1000 μM和1250 μM），以评估PowerPlex? 18E系统在常见抑制剂存在下的性能。PowerPlex? 18E系统对广泛的抑制剂浓度和类型具有耐受性。在750 μM EDTA、100 ng/μL腐殖酸、500 μM血红蛋白和所有浓度的单宁酸存在下，仍能生成完整的谱型（图3）。其余浓度导致部分DNA谱型。EDTA对百分比谱型的影响最大，而单宁酸的影响最小。

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图3. 使用PowerPlex? 18E系统时受抑制样本的平均百分比谱型。误差条表示±1标准差（n = 4）。

PowerPlex? 18E系统的质量指示剂作为内部模板而不是样本DNA扩增的产物，可以区分降解和受抑制的样本。在降解的DNA中，位点扩增产物显示出随着扩增产物大小增加而降低的典型滑雪坡模式。然而，QIS和QIL峰无论样本是否降解都能稳健地扩增，因为它们是由不受样本DNA降解影响的内部模板生成的。在PCR抑制情况下，来自较大内部模板的QIL峰同样容易受到抑制，因为抑制剂会降低扩增效率，无论模板来源如何。这导致QIL/QIS比率降低，反映了受抑制反应中位点扩增产物观察到的滑雪坡模式。这与降解样本形成对比，在降解样本中，QIS和QIL峰保持稳健，而位点扩增产物显示出滑雪坡模式。这种内部模板设计使实验室能够区分降解和抑制，并直接指导下游解释决策。QIL对抑制剂浓度的敏感性还提供了实用的信号，以指导稀释或重新提取等补救策略。

在以下抑制剂浓度下观察到QIL峰的完全丢失：EDTA 1250 μM、腐殖酸200 ng/μL和300 ng/μL以及血红蛋白1000 μM。增加抑制剂浓度会导致QIL/QIS比率降低（补充图4）。补充图5显示了使用PowerPlex? 18E扩增的血红蛋白抑制样本的FL-8C染料通道的代表性电泳图。

精确度和准确性
等位基因梯子的精确度
尺寸精确度对于准确的基因分型至关重要。评估了在三种不同的Spectrum CE系统和一个Spectrum Compact CE系统中注入的24个PowerPlex? 18E系统等位基因梯子的数据。所有结果的标准差均≤0.11 nt，尺寸范围≤0.50 nt（表5）。观察到的最大标准差小于0.16 nt，这是0.5 nt分组窗口内的三个标准差的最大值。

表5. 每个Spectrum CE系统的PowerPlex? 18E等位基因梯子峰的标准差和等位基因大小范围（n=24）。

实验室 仪器 最大标准差（nt） 最大等位基因大小范围（nt）
Promega Spectrum CE 0.07 0.3
科隆 Spectrum CE 0.06 0.2
欧洲芬斯 Spectrum CE 0.06 0.2
慕尼黑 Spectrum Compact 0.11 0.5

PowerPlex? 18E系统的等位基因梯子包含四个位点，其峰之间的距离为一个核苷酸：TH01、D2S441、D12S391和D1S1656。对于这些等位基因，每次都能实现100%的单核苷酸分辨率。展示PowerPlex? 18E系统单核苷酸分辨率的代表性位点见补充图6和7。

重现性和重复性
在多种仪器和不同操作者之间评估了51个2800 M样本的基因型一致性。所有2800 M样本在仪器之间显示出100%的一致性，并且与PowerPlex? 18E系统等位基因梯子中相应的等位基因相差±0.5 nt以内。所有2800 M样本获得的谱型也与PowerPlex? 18E系统技术手册中的谱型相匹配。[1]

遗传标记特征和一致性
PowerPlex? 18E系统包含的位点的等位基因频率[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、Y-单倍型以及物理图谱[30]、[31]、[32]、[33]已经得到了很好的表征。从NIST美国人群集和SRM 2391d的单一来源组分A – C和E获得的PowerPlex? 18E基因型与其他STR系统先前生成的基因型进行了大规模一致性研究。在比较的23,450个等位基因中，观察到7个不一致的调用，PowerPlex? 18E系统与NIST数据集之间的一致性为99.97%。所有七个不一致的等位基因调用都出现在SE33中，是由于AAA四碱基对缺失（6次）或三碱基对缺失（1次）在用于生成PowerPlex? 18E系统扩增产物的引物结合位点之外的DNA区域，但在其他几个STR系统扩增的区域内。应该注意的是，在这两种缺失的情况下，PowerPlex? 18E系统与实际等位基因在序列上是一致的，而引物结合位点包含这些缺失的STR系统在序列上与等位基因不一致。这通过SRM2391d的分析证书中组分B的认证基因型得到了体现。在SE33中，组分B报告了17个等位基因，而所有商业CE试剂盒都报告了18个重复序列，但在重复序列上游85 bp处有一个AAA缺失。与其他商业CE试剂盒不同，PowerPlex? 18E系统和PowerPlex? 35GY系统[13]提供了正确的18个等位基因调用。NIST SRM 2391D样本的基因型在PowerPlex? 18E系统和SRM 2391d的分析证书中报告的认证基因型之间显示出100%的一致性。

抖动
抖动峰是在PCR扩增过程中常见的伪影。GeneMarker?HID for Spectrum CE Systems软件中每个位点的“ stutter”过滤器的计算方法是使用平均“stutter”比率加上三个标准差。Stutter分析的结果可以在表6中找到。该表总结了PowerPlex? 18E多重检测中每个位点的“minus”和“plus”stutter情况。表格显示了计数的stutter峰值数量（n）、平均stutter百分比、标准差（SD）以及观察到的最大stutter值。此外，SE33、D1S1656和FGA表现出N – 2 nt的stutter。表6. PowerPlex? 18E系统stutter总结。

**位点** **N - 1重复序列的stutter** **平均Stutter** **SD** **最大Stutter** **平均 + 3 SD**
D3S1 35 8 4 2 10.6 1.7 16.8 15.6
D21S 11 60 9 9.6 1.7 16.3 14.6
D16S 53 9 4 14 7.2 2.2 12.3 13.6
D18S 51 6 8 4 9.9 2.6 18.5 17.6
TH01 47 6 2.7 1.0 6.0 5.7
vWA 45 6 8.7 3.0 15.5 17.8
D19S 43 3 5 19 1 5.0 15.1
D2S 44 16 15 6.0 1.9 11.1 11.6
D12S 39 17 20 11.5 3.3 21.4 21.3
D8S 11 79 4 5 7 8.0 1.7 14.8 13.3
D2S 13 38 8 17 11.5 2.1 16.8 17.7
SE33 9 27 12.2 2.2 17.8 18.8
D10S 12 48 36 6 11.1 2.5 18.2 18.6
D1S 16 56 76 31 10.7 2.6 19.9 18.3
D22S 10 45 52 7 3.2 15.6 17.4
DYS3 9 15 62 7.8 0.9 11.4 10.6

**N + 1重复序列的stutter**
**平均Stutter** **SD** **最大Stutter** **平均 + 3 SD**
12 11 4 0.3 2.7 2.4
65 41 1.5 0.3 3.2 2.5
36 71 1.3 0.3 2.9 2.1 29 1.4 0.3 2.6 2.3
47 1.4 0.4 2.8 2.6 66 1.4 0.4 2.7 2.5
78 1.5 0.4 3.2 2.7 52 1.8 0.4 3.6 3.1
78 1.5 0.5 3.6 3.0 31 1.5 0.4 3.6 2.8
11 21 1.4 0.4 3.1 2.7 43 1.5 0.4 3.5 2.8
36 1.5 0.5 2.8 2.9 61 1.5 0.4 3.4 2.6
59 33 1.2 6.8 7.4 29 1.6 0.5 2.7 3.0
24 1.4 0.4 3.2 26

**N - 2 nt的stutter**
**平均Stutter** **SD** **最大Stutter** **平均 + 3 SD**
SE33 9 85 5.4 0.4 7.6
D1S 16 56 86 2.1 0.5 3.4
FGA 20 1.4 0.5 2.7 2.9

**案例类型样本**
法医案例样本包含多种不同的DNA量、DNA质量、底物类型和生物样本类别。代表各种样本类型的样本（表7）成功地使用PowerPlex? 18E系统进行了扩增。生成的谱型与预期的DNA来源和DNA量一致。单源骨骼和牙齿样本的代表性电泳图显示在补充图8-9中。这两种样本在PowerQuant?系统中均未显示出显著的IPC Cq偏移（>0.3），并且在PowerPlex? 18E系统中显示出相对于QIS的稳健扩增，表明没有PCR抑制剂的存在。倾斜的谱型与DNA降解一致，这得到了PowerQuant?系统[Auto]/[Deg]比率分别为4.40和5.62的支持（表7）。

表7. 案例类型样本的定量和PowerPlex? 18E扩增结果总结。高亮显示的单元格代表PowerQuant?系统在技术手册中描述的阈值下标记的质量指标（n=1）。

表7中反映的底物类型和生物样本类别的多样性体现了在实际案例工作中遇到的样本类型的广泛性，并支持了该系统在各种法医学科中的适用性。PowerQuant?系统指标与PowerPlex? 18E扩增结果的整合展示了协调的定量到扩增工作流程的价值，定量指标能够一致地预测不同样本类型的扩增结果。[Auto]/[Deg]比率升高和QIL/QIS比率降低的样本产生了预期的部分谱型，而DNA输入量低或无法检测到的样本则产生了相应有限的或缺失的谱型，这与敏感性研究的结果一致。

对于性侵犯样本，非精子（NS）和精子（S）组分之间的扩增结果差异与预期的差异提取结果一致，每个组分中的贡献者组成反映了预期的样本组成。总体而言，案例类型样本的结果表明PowerPlex? 18E系统在各种法医样本类型和条件下都能可靠地运行，支持其在实际案例工作流程中的使用。

**混合样本研究**
法医样本通常包含来自多个来源的DNA。为了检验PowerPlex? 18E系统分辨次要贡献者的能力，评估了两个人和三个人的混合样本。在两个人的混合样本中，观察到19:1、1:19、9:1和5:1的比例下次要等位基因的丢失（图4）。在9:1的比例中，平均有93%的独特次要等位基因被检测到；在1:9的比例中，当次要供体的贡献量为50 pg时，平均有98%的次要等位基因被检测到。在三个人的混合样本中，在1:1:10的比例中平均检测到94%的总等位基因，在1:1:20的比例中检测到82%的等位基因。这些结果表明PowerPlex? 18E系统可以在不同的混合比例下检测到不同的贡献者。在高混合比例下观察到的次要等位基因丢失与敏感性研究中建立的敏感性限制一致。

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图4. 使用PowerPlex? 18E系统对两个人混合样本的平均等位基因检测百分比。从两个人混合样本中获得的独特次要贡献者等位基因的百分比。误差条表示±1标准差（n = 13）。

**基于PCR的研究 – 提取的DNA**
在所有测试系统和循环数（29、30和31循环）中，成功地对含有500 pg和100 pg模板DNA的样本进行了全基因型分析（数据未显示）。循环数的增加导致两种目标数量的平均峰高增加。随着循环数的每次增加，峰高大约增加了一倍（图5）。当循环数从30循环增加到31循环时，位点之间的平衡受到了影响。

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图5. 使用PowerPlex? 18E系统在不同循环数下扩增的含有500 pg模板DNA的样本的平均峰高。样本分别在29（橙色）、30（蓝色）和31（绿色）循环下扩增。误差条表示±1标准差（n = 4）。

**退火温度**
在所有退火温度（58 °C、60 °C和62 °C）下，成功地对含有500 pg模板DNA的样本进行了全基因型分析（数据未显示）。总体而言，所有测试温度下的平均峰高是一致的，p值大于0.0028（Welch’s t检验，采用Bonferroni校正；α = 0.0028，n = 18次比较）。例外的是TH01（p<0.0028），在58 °C时峰高降低，在62 °C时峰高增加（图6）。TH01峰高对退火温度变化的响应性表明TH01可能是一个有用的指标位点，用于检测热循环仪温度的变化。

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图6. 使用PowerPlex? 18E系统在不同退火温度下扩增的含有500 pg模板DNA的样本的平均峰高。样本分别在58 °C（蓝色）、60 °C（橙色）和62 °C（绿色）的退火温度下扩增。误差条表示±1标准差（n = 4）。

**反应体积**
扩增反应使用25 μL和12.5 μL的体积进行，要么保持DNA质量不变，要么保持DNA浓度不变。当DNA质量固定时，12.5 μL体积下的峰高是25 μL体积下的两倍（图7）。这种增加是预期的，因为在保持总DNA质量不变的情况下，反应体积减半时DNA浓度实际上翻倍。

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图7. 使用PowerPlex? 18E系统在不同反应体积下扩增的含有500 pg模板DNA的样本的平均峰高。样本分别在12.5 μL（绿色）和25 μL（橙色）的反应体积下扩增。误差条表示±1标准差（n = 4）。

相反，当DNA浓度保持不变时，两种反应体积之间的峰高没有显著差异，p值大于0.0028（配对t检验，采用Bonferroni校正；α = 0.0028，n = 18次比较）（图8）。此外，在这些条件下，不同位点之间的平衡保持稳定。所有预期的等位基因在所有测试系统和反应体积下都成功进行了基因分型（数据未显示）。这些结果证实了PowerPlex? 18E系统在反应体积方面的灵活性。

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图8. 使用PowerPlex? 18E系统扩增的含有20 pg/μL模板DNA的样本的平均峰高。样本分别在12.5 μL（绿色）和25 μL（橙色）的反应体积下扩增。误差条表示±1标准差（n = 4）。

**反应组分**
在改变主混合液和引物对浓度的情况下，所有样本都获得了全基因型（数据未显示）。使用0.8X主混合液时，整体平均峰高略有增加；对于TH01和D12S391，观察到显著的峰高增加（p<0.0028）（Welch’s t检验，采用Bonferroni校正；α = 0.0028，n = 18次比较）。使用1.2X主混合液时，峰高略有下降，七个位点（D21S11、D16S539、D18S51、TH01、D8S1179、SE33、D22S1045）显示出显著下降（p<0.0028）（图9）。

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图9. 使用PowerPlex? 18E系统在不同主混合液浓度下扩增的含有500 pg模板DNA的样本的平均峰高。样本分别在0.8X（蓝色）、1.0X（绿色）和1.2X（橙色）的主混合液浓度下扩增。误差条表示±1标准差（n = 4）。

平均峰高在所有测试的引物对浓度下都是一致的，p值大于0.0028（Welch’s t检验，采用Bonferroni校正；α = 0.0028，n = 18次比较）。例外的是D18S51，在0.8X引物对混合浓度下峰高显著降低（p<0.0028）（图10）。

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图10. 使用PowerPlex? 18E系统在不同引物对混合浓度下扩增的含有500 pg模板DNA的样本的平均峰高。样本分别在0.8X（蓝色）、1.0X（绿色）和1.2X（橙色）的引物混合浓度下扩增。误差条表示±1标准差（n = 4）。

PowerPlex? 18E系统对反应组分浓度的小变化具有耐受性，在所有测试的主混合液和引物对浓度下都获得了全基因型，表明与推荐的反应条件略有偏差不会影响系统的整体性能。

**基于PCR的研究 – 参考样本的直接扩增**
在所有测试的循环数下，所有预期的等位基因都成功进行了基因分型（数据未显示）。循环数的增加导致平均峰高的增加（数据未显示）。这些结果证明了PowerPlex? 18E系统在直接扩增工作流程中的稳健性，其中DNA输入和质量可以是可变的。额外循环导致的峰高增加与提取的DNA结果一致，证实了无论样本制备方法如何，扩增都是可预测的。

**反应体积**
从所有12.5 μL和6.25 μL的反应中都获得了全基因型（数据未显示）。总体而言，当在6.25 μL的减少体积下扩增时，样本的平均峰高增加（数据未显示）。在6.25 μL的减少体积下观察到的平均峰高增加与提取的DNA反应体积结果一致，即在保持DNA质量的同时将反应体积减半实际上使DNA浓度翻倍。

**结论**
PowerPlex? 18E系统是一种为Spectrum CE系统和Spectrum Compact CE系统设计的8色多重检测系统。该STR系统利用其多色能力为常染色体STR位点产生较小的扩增子。

PowerPlex? 18E系统的性能由四个实验室根据SWGDAM验证指南进行了测试。通过提取的DNA和多种直接扩增底物确定了多个试剂盒参数的优点和局限性。结果表明，PowerPlex? 18E系统对人类DNA具有特异性，在不同的模板量范围内表现出可靠的性能，精确且准确，并且足够稳健，可以与多种热循环仪型号兼容。它还证明了克服不同抑制剂的能力，并能在多种样本类型下运行。开发验证研究的结果为法医实验室执行自己的内部验证研究提供了背景。这里记录的信息也验证了PowerPlex? 18E系统的可靠性，使其适合用于法医DNA实验室。

**未引用的参考文献**
[34], [35]
CRedi

**作者贡献声明**
Alan Pierce：写作 – 审查与编辑，调查。
Katja Anslinger：写作 – 审查与编辑，调查。
David Moore：写作 – 审查与编辑，调查。
Vallone Peter：写作 – 审查与编辑，调查。
Thompson Jonelle：写作 – 审查与编辑，写作 – 原始草稿，验证，监督，项目管理，方法学，概念化。
Birgit Bayer：写作 – 审查与编辑，调查。
Rachel Knoener：调查。
Hamilton Elizabeth：写作 – 审查与编辑，可视化，调查，正式分析。
Steffen Carolyn：写作 – 审查与编辑