通过热塑性聚（乳酸-羟基乙酸）与锶改性磷酸钙骨水泥的混合挤出打印技术实现的双相骨植入物

《ACS Omega》：Biphasic Bone Implants through Hybrid Extrusion Printing of Thermoplastic Poly(lactic-co-glycolic) acid and Strontium-Modified Calcium Phosphate Bone Cement

　　高分辨率图像下载 MS PowerPoint 幻灯片

双相支架将生物活性陶瓷与可降解聚合物结合在一起，在骨再生方面具有巨大潜力，但在界面整合和加工性方面存在挑战。在这项研究中，使用优化的基于挤出的 3D 打印和后处理协议成功制备了由锶改性的磷酸钙水泥（SrCPC）和聚（L-乳酸-共-羟基乙酸）（PLLA–PGA）交替组成的双相支架。在水中的降解研究表明，双相支架中 SrCPC 相的存在缓冲了 PLLA–PGA 的酸性降解产物，延缓并减弱了随时间变化的 pH 值下降，并影响了聚合物相的降解。单轴压缩测试显示，双相支架的机械性能介于单相 PLLA–PGA 和 SrCPC 支架之间，并且在 24 周的观察期内有所下降。在接近生理条件的细胞培养基中的老化实验表明，两种材料之间存在显著的相互作用，这从 SrCPC 相中释放的锶和磷酸根离子的分布以及双相系统中材料表面结构的差异中得到证实。这也反映在类成骨细胞 SaOS-2 的细胞反应上，显示出细胞-材料相互作用的局部异质性。尽管如此，细胞实验表明，双相支架中生物活性的 SrCPC 组分对细胞增殖和碱性磷酸酶活性有显著的积极影响，这些指标明显高于单相 PLLA–PGA 支架。

1. 引言
骨组织具有很高的再生能力，可以自发修复健康患者的小缺陷。然而，由于肿瘤切除、创伤或感染等原因导致的大骨缺损需要通过填充移植物来重建缺损并恢复组织功能。由于目前的金标准——自体骨的可用性有限，并且需要在供体部位进行第二次手术干预，因此人们非常关注可降解生物材料的开发，这些材料可以暂时填充缺损并支持骨组织再生。(1,2)

基于聚乳酸（PLA）的生物材料已经用于骨再生，并获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，其特点是具有高生物相容性和良好的机械硬度。(3?5) 通过调整 PLA 的结晶度可以调节其降解速率。(6) PLA 有三种异构形式：L-乳酸、D-乳酸和外消旋（D,L）乳酸；对于大多数应用，选择 (L) 异构体 (PLLA)，因为它在体内优先代谢。(4) 聚酯的降解机制基于其酯键的随机水解，释放出单体，例如 PLA 的乳酸。PLA 比聚羟基乙酸（PGA）更疏水，因此比 PGA 更耐水解攻击。(4) 聚（L-乳酸-共-羟基乙酸）（PLGA）的共聚物可以更好地控制降解速率，相比于其组成单体 PLA 和 PGA。(5) 作为热塑性塑料，PLA 在高温下熔化并在冷却后重新固化，因此适用于 3D 打印，例如通过熔融丝制造（FFF），也称为熔融沉积建模（FDM）或无丝自由成型制造。(7) 因此，可以制造出具有定义好的孔结构以及特定形状和尺寸的 3D 支架和植入物。

另一类已经用于临床应用的生物材料是基于磷酸钙（CaP）的陶瓷。著名的代表包括自固化磷酸钙水泥（CPC），作为可注射的、FDA 批准的骨替代材料。CPC 由一种或多种 CaP 相的前体粉末和液相组成；混合后会发生溶解和再沉淀反应，导致水泥硬化。(8) 本研究使用的基于 α-三钙磷酸盐（α-TCP）的 CPC 在水泥固化过程中形成低溶解度的纳米晶（缺钙）羟基磷灰石。(8,9) CPC 是可降解的，并具有优异的骨传导性和生物相容性。(10) 可以通过锶离子对其进行修饰，以实现 Sr2+ 的局部长期释放，从而刺激骨形成，从而增加骨再生。(11?13) 通过将 α-TCP 基前体粉末悬浮在生物相容的油基载体液体中，可以生成可用于临床应用的 CPC 糊状物；只有在与水溶液接触时，水泥固化反应才会开始，此时油会被水替换。(14,15) 这些油基 CPC 糊状物也适用于基于挤出的 3D 打印支架和植入物，具有很高的形状保真度。(16?18) 由于 CPC 打印过程中的条件温和，固化反应不会产生热量，且对周围环境中的离子浓度和 pH 值影响较小，因此它们还可以与（负载细胞的）水凝胶结合，通过多通道挤出打印生成双相结构，例如用于修复骨软骨缺损。(19?21)

尽管这两种材料已经在临床使用，但它们都有各自的优点和局限性。热塑性聚酯如 PLA 或 PLGA 具有良好的机械硬度，但它们的中间降解产物会导致局部 pH 值下降，这可能会引发炎症反应并损伤骨细胞。(22) 基于 CaP 的材料，如纳米晶 CPC，具有高生物活性和与天然骨矿物质的物理化学相似性，但它们很脆，因此通常无法承受机械负荷而不发生断裂。(8,23) 因此，研究集中在通过结合不同材料来开发改进的植入物材料上。一种常见的策略是生成复合材料，即将 CaP 基（纳米/微米）颗粒作为填料整合到聚合物基质中。(24,25) 在我们之前的工作中，我们使用 3D 打印制备了由共聚物 PLLA–PGA（已获 FDA K121606 批准用于特定临床用途）和不同矿物填料（碳酸钙、碳酸锶、锶改性的羟基磷灰石（SrHAp）、α-三钙磷酸盐（α-TCP）、β-三钙磷酸盐（β-TCP）组成的复合支架，并研究了它们的降解行为。(26) 矿物填料颗粒（10 wt %）的整合影响了聚合物的打印性能；然而，通过调整工艺参数，仍可以高精度打印。在老化过程中，CaP 相（SrHAp、α-TCP、β-TCP）能够缓冲 PLLA–PGA 的酸性降解产物。另一方面，10 wt % 的矿物填料颗粒似乎并未提高 PLLA–PGA 支架的生物活性，但导致了（不希望的）适度尺寸增加。(26)

在目前的工作中，我们探索了另一种将聚合物 PLLA–PGA 与 CaP 相结合的策略。通过使用多通道/多工具 3D 打印系统，将 PLLA–PGA 与锶改性的 CPC 糊状物（SrCPC）（15）共打印，通过交替沉积这两种材料来创建双相支架。我们系统地评估了单独和组合材料的可打印性，并通过在水中以及细胞培养基中进行降解研究来表征所得双相支架，以模拟生理条件。我们还研究了成骨细胞对双相材料系统的反应。我们测试了以下假设：与单相 PLLA–PGA 支架相比，双相支架会 (i) 由于矿物相的缓冲作用而在降解过程中表现出较低的 pH 值下降；(ii) 由于 SrCPC 组分的生物活性和骨传导性以及显著的骨刺激锶离子释放，从而改善细胞在支架中的定植。为了阐明两种材料相及其环境之间的相互作用，我们在 70 天的时间内补充了元素表面表征和离子交换分析。

2. 材料和方法
2.1. 打印材料
PLLA–PGA（重量比 85:15）颗粒来自 Evonik Industries AG（德国埃森）。锶改性的自固化磷酸钙水泥糊状物（SrCPC）由 INNOTERE GmbH（德国拉德贝乌尔）制造，该糊状物由一种或多种 CaP 相的前体粉末和液相组成；混合后发生溶解和再沉淀反应，导致水泥硬化。(15) SrCPC 基于 α-三钙磷酸盐（α-TCP），如本研究中使用的那些，在水泥固化过程中形成低溶解度的纳米晶（缺钙）羟基磷灰石。(8,9) CPC 是可降解的，并具有优异的骨传导性和生物相容性。(10) 可以通过锶离子对其进行修饰，以实现 Sr2+ 的局部长期释放，从而刺激骨形成，从而增加骨再生。(11?13) 通过将 α-TCP 基前体粉末悬浮在生物相容的油基载体液体中，可以生成可用于临床应用的 CPC 糊状物；只有在与水溶液接触时，水泥固化反应才会开始，此时油会被水替换。(14,15) 这些油基 CPC 糊状物也适用于基于挤出的 3D 打印支架和植入物，具有很高的形状保真度。(16?18) 由于 CPC 打印过程中的条件温和，固化反应不会产生热量，并且对周围环境中的离子浓度和 pH 值影响较小，因此它们还可以与（负载细胞的）水凝胶结合，通过多通道挤出打印生成双相结构，例如用于修复骨软骨缺损。(19?21)

尽管这两种材料已经在临床使用，但它们都有各自的优点和局限性。热塑性聚酯如 PLA 或 PLGA 具有良好的机械硬度，但它们的中间降解产物会导致局部 pH 值下降，这反过来可能会引发炎症反应并损伤骨细胞。(22) 基于 CaP 的材料，如纳米晶 CPC，具有高生物活性和与天然骨矿物质的物理化学相似性，但它们很脆，因此通常无法承受机械负荷而不破裂。(8,23) 因此，研究集中在通过结合不同材料来开发改进的植入物材料上。一种常见的策略是生成复合材料，即将 CaP 基（纳米/微米）颗粒作为填料整合到聚合物基质中。(24,25) 在我们之前的工作中，我们使用 3D 打印制备了由共聚物 PLLA–PGA 和不同矿物填料（碳酸钙、碳酸锶、锶改性的羟基磷灰石（SrHAp）、α-三钙磷酸盐（α-TCP）、β-三钙磷酸盐（β-TCP）组成的复合支架，并研究了它们的降解行为。(26) 矿物填料颗粒（10 wt %）的整合影响了聚合物的打印性能；然而，通过调整工艺参数，仍然可以高精度打印。在老化过程中，CaP 相（SrHAp、α-TCP、β-TCP）能够缓冲 PLLA–PGA 的酸性降解产物。另一方面，10 wt % 的矿物填料颗粒似乎并未提高 PLLA–PGA 支架的生物活性，但导致了（不希望的）适度尺寸增加。(26)

在目前的工作中，我们探索了另一种将聚合物 PLLA–PGA 与 CaP 相结合的策略。通过使用多通道/多工具 3D 打印系统，将 PLLA–PGA 与锶改性的 CPC 糊状物（SrCPC）（15）共打印，通过交替沉积这两种材料来创建双相支架。我们系统地评估了单独和组合材料的可打印性，并通过在水中以及细胞培养基中进行降解研究来表征所得双相支架，以模拟生理条件。我们还研究了成骨细胞对双相材料系统的反应。我们测试了以下假设：与单相 PLLA–PGA 支架相比，双相支架会 (i) 由于矿物相的缓冲作用而在降解过程中表现出较低的 pH 值下降；(ii) 由于 SrCPC 组分的生物活性和骨传导性以及显著的骨刺激锶离子释放，从而改善细胞在支架中的定植。为了阐明两种材料相及其环境之间的相互作用，我们在 70 天的时间内补充了元素表面表征和离子交换分析。

2. 材料和方法
2.1. 打印材料
PLLA–PGA（重量比 85:15）颗粒来自 Evonik Industries AG（德国埃森）。锶改性的自固化磷酸钙水泥糊状物（SrCPC）由 INNOTERE GmbH（德国拉德贝乌尔）制造，该糊状物由一种前体粉末（α-三钙磷酸盐、无水二钙磷酸盐、碳酸锶、羟基磷灰石和作为催化剂的磷酸氢钾）混合到油基载体液体（Miglyol、Cremophor ELP 和 Amphisol A）中。(15)
2.2. 支架制备
打印使用 BioScaffolder 3.1（GeSiM mbH，德国拉德贝格）进行，该设备配备了用于 3D 打印 SrCPC 的非回火气动打印头。对于 PLLA–PGA 的 FFF，打印头还配备了一个外部加热的墨盒。表 1 提供了单相和双相支架的相关优化制备参数。所有类型的支架都使用传统的玻璃板作为打印基底。SrCPC 的挤出使用内径为 410 μm 的圆锥形塑料针头（Globaco GmbH，德国罗德马克）进行。单相 SrCPC 3D 打印后，将获得的支架在饱和水气氛（>95% 湿度）中于 37 °C 下孵育 3 天以进行水泥固化。PLLA–PGA 颗粒被填充到高温墨盒中，并在 170 °C 下回火 2 小时以实现最佳和均匀的加工。在打印过程中，金属喷嘴被加热到 180 °C 以提高打印性能。对于双相 PLLA–PGA/SrCPC 支架，打印程序与单相支架类似，但调整了 PLLA–PGA 的打印速度和 SrCPC 的层高以保证最佳打印效果。制造完成后，双相支架在饱和水气氛（>95% 湿度）中于 37 °C 下孵育 3 天，然后用 0.9% NaCl 进行彻底清洗以去除油基载体液体。对于细胞培养和降解实验，单相和双相支架使用最大 25 kGy 的低剂量 γ-辐照进行灭菌。

表 1. SrCPC 的挤出 3D 打印和 PLLA–PGA 的 FFF 的加工参数
| 材料类型 | 针头尺寸 [μm] | 打印速度 [mm·s–1] | 压力 [kPa] | 打印头温度 [°C] | 层高 [μm] |
|---------|------------|--------------|-------------|-----------|
| 单相支架 | SrCPC | 410 | 10 | 120 | 室温 |
| | PLLA–PGA | 400 | 45 | 170 | 320 |
| | 双相支架 | SrCPC | 410 | 10–12 | 120 | 室温 |
| | PLLA–PGA | 400 | 1.5 | 50 | 170 | 320 |

对于降解研究（在第 2.4 和 2.5 节中描述），使用表 1 中列出的打印参数打印了具有 PLLA–PGA 结构、高度为 5 mm、90° 网格结构、链间距为 1.5 mm 和底面积为 10 × 10 mm 的支架。对于细胞培养实验（在第 2.6 节中描述），打印了具有 90° 交织网格结构、轮廓（双相 PLLA–PGA 结构）和圆形（? 13 mm）的支架，以适应 24 孔细胞培养板。交织结构允许不仅观察支架内部更深处的细胞行为，还可以比较不同材料相附近的细胞行为。
2.3. 打印保真度表征
根据 Ribeiro 等人的方法（27）进行了 SrCPC 和 PLLA–PGA 的丝熔合测试。打印了六层具有逐渐增加的链间距和 90° 层间位移的条纹（图 1a,d）。使用立体光显微镜（Leica M205 C，配备 DFC295 相机，德国）对打印结构进行成像。使用 ImageJ（1.51w，美国国立卫生研究院）测量了条纹宽度、条纹间距和熔合段长度。形状保真度比率是通过将熔合段长度（fs）除以条纹宽度（fd）并分配给相应的链间距（d）来确定的（图 1g）。最佳形状保真度定义为比率 1。

图 1
图 1. 使用 BioScaffolder 3.1 单相 3D 挤出打印 SrCPC 和熔融丝制造 PLLA–PGA 支架。（a–c, e–g）具有不同孔结构的支架的立体光显微图像。（a, d）具有 90° 层间位移的蜿蜒孔结构。这些类似于 (g) 中绘制的每层的丝熔合测试。在 BioRender (2026) 中创建：https://BioRender.com/l5ae864。相应的形状保真度比率 (fs/fd) 显示在 (h, i) 中。

高分辨率图像下载 MS PowerPoint 幻灯片

2.4. 在水中的老化和降解分析
通过 γ-辐照灭菌的单相 PLLA–PGA 和 SrCPC 支架以及双相 PLLA–PGA/SrCPC 支架在 37 °C 的去离子水中孵育（每组 4 个支架；总共分析 20 个支架），时间为 24 周，参考 DIN EN ISO 10993-13。(28)
2.4.1. pH 值和电导率的测量
在孵育期间（n = 3）使用 pH/电导率计（Multi 9260 IDS，pH 电极 Sentix 980 IDS 和电导率电极 TetraCon 925；WTW，Xylem Analytics，德国魏尔海姆）监测孵育批次中的 pH 值和电导率。
2.4.2. 机械测试
在配备 20 kN 载荷细胞的通用测试机（Zwick-Roell Z010，Zwick/Roell，德国）上进行单轴压缩测试，以恒定的横梁速度 5 mm·min–1 进行位移控制，直到标准位移 3.5 mm 或样品失效，以先发生者为准。杨氏模量（E）是通过线性最小二乘法拟合工程应力-应变曲线的初始线性区域来确定的。抗压强度（σc）被定义为失效前的峰值（最大）工程应力（应力-应变曲线的局部最大值）。2.4.3. 差示扫描量热法在孵育第0周、第2周、第4周和第24周采集的样品经过干燥器干燥后，使用差示扫描量热法（DSC；214 Polyma；Netzsch，Selb，德国）进行检测，该方法符合DIN EN ISO 11357-3标准。样品首先以10 K/min的加热速率从-20°C加热到210°C（第一次加热），然后以10 K/min的冷却速率冷却，之后再次以10 K/min的加热速率从-20°C加热到210°C（第二次加热）。氮气的流速为60 mL/min。在分析过程中考虑了双相支架中各材料相的质量。2.5. 在细胞培养基中的老化及生物活性分析单相SrCPC和PLLA–PGA支架以及双相PLLA–PGA/SrCPC支架首先在70%的乙醇中浸泡30分钟进行消毒，然后冲洗在含有Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，该培养基添加了15%的胎牛血清（FCS；Corning，美国）和100 μg/mL的链霉素（PS），以去除残留的载体液体和乙醇。去除上清液后（时间点：第0天），所有样品在细胞培养基中培养超过70天（37°C，5% CO2，湿润环境）。培养基在培养1天、3天、7天、9天、14天、21天和28天后进行更换。2.5.1. 扫描电子显微镜和能量分散X射线光谱在培养70天后，样品被收集用于扫描电子显微镜（SEM）分析。支架首先用碳片固定在铝制样品架上，然后进行金溅射涂层，并使用配备场发射枪的ZEISS DSM 950显微镜（Carl Zeiss AG，Oberkochen，德国）进行成像。显微镜在SEM模式下操作，电压为4 kV（点大小为3）。对于能量分散X射线光谱（EDX），需要7 kV的电压。2.5.2. 离子释放/吸收在70天的培养期间收集的上清液通过电感耦合等离子体-光发射光谱法（ICP-OES，Plasma Quant PQ9000 Elite，Analytik Jena，德国）分析钙、磷酸盐和锶离子的释放/吸收情况。2.6. 细胞培养实验2.6.1. 播种与培养使用类成骨细胞系SaOS-2（ATCC 243；DSMZ，Braunschweig，德国）研究细胞对双相支架的直接接触反应。细胞在37°C和5% CO2的细胞培养基中扩增。支架在细胞培养基中预培养过夜，然后以不同的密度（每个支架5 × 10^4或5 × 10^5个细胞）接种到24孔细胞培养板中。在37°C和5% CO2条件下培养24小时后，将接种的支架转移到新的24孔板中，并向每个支架添加1 mL含有成骨补充剂的细胞培养基，其中包括10^-7 M的地塞米松、50 μM的抗坏血酸-2-磷酸盐和10 mM的β-甘油磷酸盐（均来自Sigma-Aldrich，德国）。在培养过程中，每周更换一次培养基。2.6.2. 细胞数量和ALP活性的量化在不同培养时间点采集的细胞接种支架，用磷酸盐缓冲盐水（PBS；ThermoFisher，美国）洗涤，并在-80°C下保存直至进行生化分析，解冻后在冰上用500 μL裂解缓冲液（1% Triton X-100在PBS中）孵育50分钟。使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定法（Promega，美国）根据制造商说明通过测量490 nm处的吸光度来测定乳酸脱氢酶（LDH）活性，并通过定义的细胞数量的LDH活性校准线将其与细胞数量相关联。碱性磷酸酶（ALP）活性是通过将用于细胞数量测定的相同细胞裂解液 aliquots（20 μL）与80 μL ALP底物溶液（1 mg/mL的对硝基苯酚磷酸盐在0.1 M二乙醇胺、0.1% Triton X-100、1 mM MgCl2中，pH 9.8；均来自Sigma-Aldrich）在37°C下孵育来测定的。10分钟后，加入1 M NaOH停止酶反应，并在405 nm处读取吸光度。通过将吸光度与对硝基苯酚校准线相关联来计算特定的ALP活性。2.6.3. 荧光显微镜在培养不同时间点采集的细胞接种支架，用PBS洗涤后固定在4%甲醛的PBS中。在用0.2% Triton X-100处理以渗透细胞后，样品在1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中孵育以减少非特异性染色，随后用DAPI（Sigma-Aldrich）和Alexa Fluor 488 phalloidin（Invitrogen）染色以可视化细胞核和肌动蛋白细胞骨架。使用Keyence AIO荧光显微镜BZ-X800（Keyence，日本）对染色样品进行成像。2.7. 统计分析所有数据均使用单因素方差分析（ANOVA）进行评估，随后使用GraphPad Prism 9软件进行Tukey多重比较测试。显著性差异的假设为p < 0.05。3. 结果3.1. SrCPC和PLLA–PGA双相支架的制备首先评估了由SrCPC或PLLA–PGA组成的单相3D打印支架的形状保真度（图1）。确定了单相打印的参数以获得形状最佳的支架。SrCPC和PLLA–PGA都可以使用BioScaffolder 3.1和内径分别为410 μm和400 μm的针头进行挤出。虽然SrCPC浆料可以直接加工，但PLLA–PGA颗粒需要在高温挤出头中熔化后才能挤出。为了研究最小的可打印孔径，基于每层中蜿蜒纤维之间90°偏移的多层孔径结构进行了开发（图1a,d）。观察到PLLA–PGA的最小孔径容易闭合，而SrCPC则不会。尽管如此，设计和打印结构的高度一致性证明了两种单相材料的高形状保真度。此外，还测试了其他支架结构：直径为13 mm、层方向为90°、纤维间距为1 mm的小支架，无论使用何种材料都能成功打印，且打印形状没有明显缺陷（图1b,f）。同样，层方向为60°的支架（图1c,g）也能成功打印。随后，根据Ribeiro等人的方法（27），对图1a,d中显示的支架的打印保真度进行了定量评估，证明了SrCPC和PLLA–PGA的良好可打印性（图1g–i）。对于孔径小于1 mm的PLLA–PGA，保真度比率fs/fd显著高于1；而对于孔径约为1 mm的支架，该比率达到了最佳值1。对于孔径小于1 mm的SrCPC，保真度比率接近1，但仍在可接受的偏差范围内。因此，为了确保高形状保真度，打印的双相支架的孔径至少为1 mm。图2展示了支架设计（a, e, i）以及多层结构（15层）和边长为13 mm的支架的相应打印结果，包括单相和双相支架。在制备双相支架时，需要调整材料特定的打印参数以适应加工行为的差异。具体来说，PLLA–PGA的打印速度相对于单相结构降低了，以促进材料界面之间的适当结合。层间粘附是多材料3D打印中的常见挑战，特别是对于不同相的材料。发现，在支架周围添加外围的PLLA–PGA轮廓可以提高整体结构完整性。相比之下，由于PLLA–PGA的附着力太弱，无法在SrCPC上实现可靠的纤维排列，因此无法在SrCPC上形成SrCPC轮廓。同样，沉积在PLLA–PGA上的SrCPC的纤维附着力也比SrCPC之间的接触弱，导致纤维线性和局部打印精度降低（图2j,k中的箭头所示）。尽管与单相结构相比形状保真度存在这些偏差，但仍成功打印出了SrCPC/PLLA–PGA支架。图2显示了单相和双相PLLA–PGA/SrCPC支架的打印过程（a, e, i）以及打印支架的立体显微图像（(b, f, j)：顶视图；(c, g, k)：顶视图，细节；(d, h, l)：侧视图）。蓝色箭头表示SrCPC在PLLA–PGA纤维上的附着力比在SrCPC之间的接触弱。整个制备过程的示意图，包括后处理（m）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片双相材料系统的关键方面是打印支架的后处理。单相PLLA–PGA支架必须冷却固化。对于像SrCPC这样的水泥状支架，之前的研究表明，最佳固化过程是在水饱和气氛中的设定过程（30），从而形成纳米晶态的锶替代羟基磷灰石（15）。在潮湿条件下初步设定3-5天后，通常使用丙酮等有机溶剂去除(Sr)CPC支架中的油基载体液体（31）。然而，这种方法不适用于双相PLLA–PGA/SrCPC支架，因为丙酮会通过诱导聚合物溶解而降解热塑性相。基于这些考虑，开发了一种后处理方案，如图2m所示。打印后立即将支架转移到37°C的水饱和气氛中的湿润室中，以促进SrCPC的初步固化。培养3天后，小心地将支架从基底上取下，并用0.9% NaCl溶液彻底冲洗以去除水泥表面的残留载体液体。最后，样品在真空下干燥并使用低剂量γ-辐照（最大25 kGy）进行灭菌，以保持聚合物相的结构和机械完整性。3.2. 在水中的降解研究包括机械测试根据DIN EN ISO 10993-13:2010-11指南，在去离子水中进行了降解研究，并在24周期间评估了机械性能。每2周测量一次上清液的pH值和导电性（图3a,b）。pH值的测量显示所有含PLLA–PGA的支架类型都逐渐酸化，表明聚合物正在降解。在单相PLLA–PGA支架中，pH值立即迅速下降，6周后稳定在约2.5。相比之下，单相SrCPC的上清液在整个研究期间保持约7.5–8的生理pH值。双相支架在12周前保持生理pH值，之后降至约4.5并稳定下来。图3显示了在去离子水中培养24周期间支架特性的变化：测量pH值（a）和导电性（b）（W0–4：n = 3次，W24：n = 2次测量）；通过测定杨氏模量（c）比较机械性能（p < 0.05，ns=不显著）和抗压强度（d）（n = 3）；24周后的支架显微图像（e）；以及所有支架组成的DSC数据（f–h），n = 2）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片导电性测量支持了这些发现。在单相支架中，PLLA–PGA样品的导电性增加，表明带电氢离子的持续形成，反映了聚合物的持续降解；而SrCPC的导电性保持恒定，表明离子释放稳定。双相支架的导电性在整个12周内始终低于单相SrCPC，这与它们较低的SrCPC含量一致。与12周后的pH值下降相对应，导电性显著增加，到第24周时，双相支架的导电性是单相PLLA–PGA的两倍以上。这支持了pH数据，并表明离子释放显著增加，从而表明了强烈的降解行为。为了进一步评估降解情况，我们对在第0周、第2周、第4周和第24周取出的支架进行了单轴压缩测试，以确定杨氏模量和抗压强度（图3c,d）。单相PLLA–PGA支架的杨氏模量和抗压强度随时间显著下降，而单相SrCPC在长达4周的时间内保持了相当的机械性能。只有在第24周时才观察到SrCPC支架的机械稳定性明显降低。双相支架的机械性能介于单相样品之间。在第4周之前，它们的杨氏模量相似，抗压强度略有提高。然而，到第24周时，这两个值都降低到了与PLLA–PGA支架相当的水平。24周培养后的显微图像（图3e）进一步支持了这些发现：单相SrCPC支架保持了完整的结构完整性，而PLLA–PGA支架则出现了部分分解。双相支架出现了部分断裂和较大碎片的丢失。此外，还观察到PLLA–PGA链的明显变白，进一步表明由于聚合物基质的结构变化而导致了进一步的降解。

采用差示扫描量热法（10 K/min）监测了各种支架结构的热行为（图3f–h）。正如预期的那样，单相SrCPC在观察期间使用的温度下保持了稳定的热性能，表明材料随时间的改变可以忽略不计。相比之下，单相PLLA–PGA支架的玻璃化转变温度（Tg）和熔化温度（Tm）显著下降：Tg从58°C降至44°C，Tm从162°C降至128°C。有趣的是，在前4周内可以看到两个吸热熔化峰，24周后这些峰合并为一个。此外，还观察到了PLLA–PGA混合物典型的在100至130°C之间的放热峰（32）。双相PLLA–PGA/SrCPC支架也显示出类似的趋势，Tg和Tm分别从60°C降至42°C和163°C降至135°C。有趣的是，在双相条件下，放热峰不那么明显。

3.3. 在细胞培养基中的老化
尽管在H2O中的支架降解提供了有关SrCPC对PLLA–PGA降解影响的有用见解，但它缺乏生理相关性，因为人血液中含有多种调节这一过程的离子和蛋白质。与我们的先前工作（26）类似，还进行了为期70天的额外降解研究，将样品浸入细胞培养基中，以研究这两种材料在类似体内的环境中的相互作用。与在H2O中的观察结果一样，单相和双相支架中的PLLA–PGA链在几周后变白了，这是由于微裂纹和坑洞形成导致的光散射变化（33），表明培养基中正在进行降解（图4）。SEM分析揭示了70天后的进一步表面变化：单相SrCPC支架保持了其特征性的磷灰石纳米晶体表面形态（18），而在单相PLLA–PGA支架上观察到了沉积物（26）。在双相支架中，SrCPC表面显得更加圆润，并有平坦的区域——这表明表面有沉积物积累，而PLLA–PGA链则显示出许多小孔且没有沉积物。

为了评估支架表面的沉积物，对镀金样品进行了EDX分析（图5）。SrCPC表面显示了C、O、Na、Mg、Sr、P和Ca的元素信号，其中O、Ca、Sr和P来自SrCPC。Na、Mg和Cl的存在可能反映了来自培养基的沉积。有趣的是，在70天后（D70），双相支架的表面没有检测到Sr，而单相SrCPC支架显示出的Sr峰与第0天（D0）时的峰相似（图5）。

PLLA–PGA表面由于高加速电压（7 kV）而给EDX分析带来了挑战，这会损坏表面。然而，在70天的培养后，表面主要显示高含量的C和O，但只有单相支架显示出了Na、Cl和Ca的信号，这表明有NaCl和CaCl2的吸附。此外，系统地评估了70天期间培养基与支架之间钙、磷酸盐和锶的离子交换动态（图6）。正如预期的那样，单相PLLA–PGA支架与测试离子几乎没有相互作用，既没有吸收也没有释放钙、磷酸盐或锶。相比之下，单相SrCPC支架表现出持续的钙吸收，并伴随着磷酸盐和锶离子的持续释放。对于双相条件，由于支架中SrCPC的含量较低，钙的吸收减少了（图6a,d）。有趣的是，没有释放出磷酸盐（图6b,e），并且在14天的培养后Sr的释放也减少了（图6c,f）。

3.4. 荧光显微镜和细胞反应的生化表征
通过将SaOS-2细胞接种在打印和后处理的PLLA–PGA/SrCPC支架上来评估双相支架的细胞相容性；单相支架由SrCPC或PLLA–PGA组成，作为参考（图7a）。荧光显微镜分析显示，在接种高细胞数（5 × 10^5细胞/支架）后1天，所有三种类型的支架都被细胞均匀覆盖（图7b）。同样，在14天的培养后，细胞遍布整个支架；然而，在双相条件下，观察到SrCPC和PLLA–PGA链之间的细胞密度存在差异：虽然PLLA–PGA链完全被细胞覆盖，但SrCPC链上的细胞密度似乎降低了（图7b）。

对这一现象的更详细分析提供了有趣的见解，表明了两种材料的相互影响。图7c显示了在高细胞数（5 × 10^5细胞/支架）接种后，单相和双相支架中单个SrCPC和PLLA–PGA链的更高放大倍数图像。接种后1天，单相支架中的SrCPC链完全被细胞覆盖，且细胞分布均匀。相比之下，双相混合支架中的SrCPC链覆盖的细胞较少，且形态更为圆润。单相和双相支架中PLLA–PGA链上的细胞粘附情况相似；单相支架上的细胞密度略高。在14天的培养后，SrCPC链的情况相同；在单相支架中，它们被密集的细胞覆盖，而在双相支架中，细胞密度几乎没有增加。然而，在第14天，单相和双相支架中的PLLA–PGA链出现了差异。尽管单相支架中的细胞密度似乎降低了，但在双相支架中细胞密度增加了。使用低10倍的接种细胞数（5 × 10^4细胞/支架）进行实验再次表明了两种材料在双相支架中的相互作用（图7d）：接种后1天，单相和双相支架中的SrCPC和PLLA–PGA链上的细胞密度和形态相似；由于接种细胞数较低，单相支架中的细胞密度显著低于图7c中的支架。在14天后，单相支架中的SrCPC链被密集的细胞殖民，而双相支架中的细胞密度略有增加。

4. 讨论
在这项研究中，我们建立了一种打印和后处理协议，用于制造由SrCPC和PLLA–PGA组成的双相支架，旨在减轻PLLA–PGA的酸性降解，从而提高所得植入物的生物相容性和生物活性。正如预期的那样，双相结构表现出两种组分的材料特异性特征的组合。此外，我们在体外实验中观察到两种材料之间的相互影响。

4.1. 打印和后处理
双相PLLA–PGA/SrCPC支架的制造面临特定挑战，这些挑战源于基于挤出的打印过程中根本不同的材料类别和处理温度的结合。单相支架已经成功地按照既定程序生产出来（26,34）。对于双相打印，处理条件的差异变得明显，并加剧了打印过程。特别是PLLA–PGA的高温挤出与SrCPC的室温挤出之间的差异导致材料界面处的链粘附有限，从而影响了几何精度。这一挑战在将熔融的PLLA–PGA沉积到SrCPC纤维上时尤为明显，这使得纯SrCPC和双相框架无法用于支架的稳定。因此，唯一可行的选择是打印一个支撑性的PLLA–PGA框架来保持结构的完整性。此外，PLLA–PGA纤维的自粘性较差，这可能是由于喷嘴输出端与环境条件之间的温度梯度较大导致快速固化所致。结果，纤维可能过早固化，降低了界面质量。尽管提高环境温度理论上可以增强纤维的粘性，但在我们的打印机设置中这种调整是不可行的。另一种尝试是使用Arburg Plastic Freeforming 3D打印系统，该系统设计用于在较高环境温度（55°C）下进行热塑性材料的挤出，但它与SrCPC的挤出不兼容。作为折中方案，我们将BioScaffolder系统的打印温度提高到了170°C。因此，我们的目标是在尽量减少热降解风险的同时，提高纤维的粘性和几何形状的保持能力。降低打印速度进一步改善了不同相之间的粘性，这与之前的复合材料制造策略一致。尽管进行了这些调整，仍然观察到纤维宽度的轻微变化，特别是在粘接点之间的纤维直径上（见图2k）。与结合聚合物相和陶瓷填料的复合系统的报告相比，我们的方法在挤出后没有表现出热膨胀。总体而言，热塑性塑料和可挤出陶瓷浆料（如PLLA–PGA/SrCPC）的双相打印提供了一种更灵活的方法，可以将矿物相整合到聚合物支架中，并在更宽的范围内调整聚合物/陶瓷的比例，而传统的复合材料3D打印方法是将陶瓷填料直接整合到聚合物相中。然而，这一过程仍然凸显了在基于挤出的方法中结合热塑性塑料和陶瓷相的普遍难度。

在后处理方面，我们的方案包括在潮湿条件下设置3天，随后用0.9%的NaCl轻轻清洗以去除SrCPC载体液体，最后通过γ-辐照（最大25 kGy）进行灭菌，旨在保持水泥的完整性和聚合物的稳定性，同时考虑临床应用。尽管如此，NaCl处理可能导致比单相3D打印CPC植入物所用的丙酮处理更高的油残留量。然而，先前的研究表明残留油不会对细胞行为产生负面影响；所有载体液体成分都是生物相容的，且CPC浆料已被批准作为可注射的骨缺损填充材料用于临床应用。

正如预期的那样，SrCPC纤维有效地缓解了PLLA–PGA在水环境中水解降解通常伴随的pH值下降。SrCPC成分起到了缓冲作用，延缓并减弱了周围介质的酸化。令人惊讶的是，与之前研究PLLA–PGA和各种矿物微粒复合支架的情况相比，本研究中单相PLLA–PGA和双相支架的pH值下降得更早（14天对比84天）。这种加速的酸化现象强调了制造过程对聚合物的热降解影响。此外，像SrHAp这样的陶瓷填料在之前的研究中在整个112天研究期间都起到了缓冲作用，而在本研究中，pH值在98天后（14周）明显下降。尽管如此，SrCPC仍有效地将pH值缓冲到了大约4.4，远高于单相支架观察到的约2.5的pH值，但与其他研究结果一致。与Ahlfeld等人的研究直接对比，这些发现强调了制造技术对支架降解的显著影响。特别是，之前研究中使用的Arburg Freeformer系统可能比本研究中使用的BioScaffolder系统引起的热降解更少。本研究的结果明确表明，即使矿物相不直接与聚合物接触（如复合材料中的情况），只要其位于聚合物附近，也能实现缓冲效果。

与pH值下降一致，单相PLLA–PGA支架的上清液电导率持续增加，这支持了PLLA–PGA的早期开始和持续降解。单相SrCPC支架的电导率保持恒定，这与先前研究中已知的离子释放情况相符。有趣的是，在前12周内，双相PLLA–PGA/SrCPC支架的上清液电导率低于两种单相支架类型。这可以解释为SrCPC成分的离子释放较少，因为其纤维数量较少，且PLLA–PGA的降解速度较慢。后者可能是由于缓冲了酸性降解产物，而这些产物已知会加速酯键的水解。双相PLLA–PGA/SrCPC组在第12周后电导率的急剧增加可以与pH值的下降联系起来，表明PLLA–PGA成分的降解加剧。同时，pH值降至大约4.4可能导致SrCPC纤维中的羟基磷灰石局部溶解，从而增加了双相支架内的离子释放，使其电导率在后期超过了两种单相组。

在24周的时间里，所有类型的支架都表现出杨氏模量和压缩强度的下降，这与降解相关的机械性能减弱一致。正如预期的那样，单相SrCPC支架在前4周内保持了其机械性能，24周后仅观察到轻微下降，这与它们几乎未改变的结构完整性相符。单相PLLA–PGA支架最初表现出良好的机械性能，但随着时间的推移迅速下降，这与先前的研究结果一致，并进一步证明了聚合物的显著降解，这一点在降解研究过程中部分支架断裂中也得到了证实。尽管双相支架包含一个稳定的PLLA–PGA框架，但其机械行为更接近单相SrCPC，表明架构中最脆弱的相决定了整个支架的机械性能。值得注意的是，在前4周内，双相支架的压缩强度略有增加，表明PLLA–PGA框架最初有助于承载载荷。然而，24周后，双相支架的机械完整性显著下降，材料损失严重（见图3e）。这一观察结果与广泛的聚合物降解一致，并支持了这样的假设：聚合物水解引起的局部pH变化可能进一步促进了SrCPC的溶解，削弱了相之间的界面结合。这种现象在体内植入后不会发生；它是由人工测试条件造成的，即在没有任何缓冲成分的水中进行的测试，以根据DIN EN ISO 10993-13标准表征聚合物成分的降解，并监测两种材料在无其他影响因素条件下的相互作用。

这种行为与复合材料系统的结果不同，在复合材料系统中，陶瓷填料分散在聚合物基体中。在这种情况下，陶瓷的添加通常会增强机械性能。然而，机械增强似乎取决于陶瓷的含量：例如，PCL/SrHAp复合材料在陶瓷含量达到30%时显示出机械强度的增加，但在50%时急剧下降。同样，Akindoyo等人报告称，在PLA/HAp复合材料中，随着羟基磷灰石（HAp）含量的增加，拉伸强度和冲击强度降低；Shuai等人发现，在HAp/PLLA–PGA系统中，增加PGA和HAp的含量会导致机械稳定性下降。Bayart等人也观察到，90% PLA与10% HAp混合的材料比单相PLA的杨氏模量和压缩强度更低，这种趋势在降解五个月后更加明显。另一方面，陶瓷填料在聚合物基体中的分散可能会带来显著的缺点。除了熔化行为的变化，导致加工时间窗口变小和适用的打印喷嘴范围受限外，90% PLLA–PGA和10%陶瓷填料颗粒（如SrHAp）的复合材料在细胞培养基或模拟体液中培养时会显著膨胀。

DSC分析显示，在24周的降解过程中，单相和双相支架的PLLA–PGA都经历了明显的热变化。这些变化与制造方法密切相关。使用Arburg Freeformer系统打印并经过相同降解协议的支架，其玻璃化转变温度（Tg）和熔化温度（Tm）的下降相对较轻（见支持信息：图S1）。值得注意的是，在前4周内，两种制造技术都观察到了双熔峰，并且在Freeformer打印的支架中这种现象持续到了24周后。这种现象通常归因于PLLA结晶过程中形成的不完美或亚稳态α晶体的存在，这些晶体在加热过程中会熔化、重新组织并再结晶。较低的熔化温度峰（峰I）对应于初级α晶体的熔化，而较高的熔化温度峰（峰II）则对应于再结晶后的更稳定的α晶体。这两种晶体相都是在制造过程中形成的，反映了PLLA典型的热行为。此外，使用BioScaffolder打印的支架在24周后放热峰的消失表明聚合物基体发生了进一步的结构重组，包括另一个再结晶过程。相比之下，双相支架在整个降解研究期间仅显示出一个熔化峰，表明PLLA中形成了更稳定的α晶体。与单相支架一样，Tg的逐渐降低可以归因于非晶区域的优先降解，导致结晶区域的比例增加。值得注意的是，使用BioScaffolder打印的支架中Tg的下降更为明显，这可能是由于Freeformer加工过程中较高的环境温度降低了冷却速率，促进了更广泛的结晶。Freeformer打印的支架中较低的非晶含量导致水解敏感性降低，整体降解速度减慢。

与先前的研究一致，陶瓷成分的加入使得DSC热图中没有放热峰的出现。尽管如此，观察到的Tg下降表明降解行为与单相PLLA–PGA支架相似。放热信号的减弱可能归因于再结晶过程的不明显或DSC测量条件的限制，这也出现在单相SrCPC对照组中。

尽管在水中的降解研究提供了关于双相支架与单相PLLA–PGA支架相比的pH变化和降解行为的见解，但它未能帮助理解细胞行为；因此，我们在细胞培养基中进行了额外的降解研究，特别关注生物活性和离子释放/吸收。培养基中的降解导致PLLA–PGA纤维出现了类似的水中的白化现象。在这两种情况下，这种效应表明形成了微裂纹和凹坑，促进了流体扩散，从而加速了降解。这一过程还改变了材料的颜色。浸入水中时，由于pH值的显著变化，可能会促进自催化降解。相比之下，浸入缓冲介质中更可能促进水解降解。在细胞培养基中培养70天后，我们检测到了单相SrCPC，这是磷酸钙水泥的特征性纳米晶体结构。对于单相PLLA–PGA，可能是培养基中的NaCl和CaCl2在表面形成了连续层。对于双相支架，SEM分析显示PLLA–PGA纤维表面干净但有孔洞（见图4），这与之前的PLLA–PGA降解研究一致。这表明在单相PLLA–PGA支架上看到的沉淀物更倾向于附着在SrCPC上，而不是PLLA–PGA表面。这些孔洞进一步反映了70天内的显著降解过程。在双相支架中，SrCPC相呈现出圆形晶体结构，并伴有平坦的区域，这表明降解聚合物中的寡聚物发生了附着。(60)大多数扫描电子显微镜（SEM）观察结果得到了能量色散X射线光谱（EDX）测量的证实（图5）。对于单相SrCPC，预期的元素得到了验证，在培养基中孵育0天及70天后，其表面都能清晰地观察到Sr相。然而，在双相支架中，经过70天的孵育后，未能在SrCPC表面检测到Sr相，这与离子释放分析中观察到的Sr释放减少相吻合。这表明在SrCPC链上形成的沉淀物（图4）产生了屏蔽效应，从而减弱了Sr的释放。EDX进一步显示，双相支架中的SrCPC表面还吸附了Mg，表明介质中的Mg可能与磷酸根反应形成了连续的MgP层。不过，在当前条件下形成MgP层似乎不太可能，因为通常需要较高的碱性pH值（>8.6）。(63)此外，也不清楚为什么在单相支架的SrCPC表面没有检测到Mg的吸附。另一个复杂因素是，在双相支架中，从一开始就完全没有磷酸根离子的释放，这一点从降解研究的初期就可以明显看出。单相SrCPC支架则表现出磷酸根的释放，这是CPC的典型特征。(18)这一现象的原因同样不明确。虽然MgP的形成可能部分解释了这一现象，但假设在每个时间点，从水泥中释放的所有磷酸根都直接与Mg离子反应——且介质中的磷酸根浓度没有明显波动（如图6b,e所示，经过扣除介质中的磷酸根基线后）——似乎并不现实。另一种假设是，在双相支架中，由于存在PLLA–PGA，磷酸根离子没有从SrCPC中释放，这一假设部分解释了前20天内Sr释放量减少的现象，但也值得怀疑。尽管我们无法完全解释这些观察结果，但可以明确的是，在双相条件下，两种材料之间相互影响，固体聚酯的水解速率取决于局部离子环境、pH值、寡聚物的扩散性以及基体的孔隙率。(60)据我们所知，此前尚未有过这种效应组合的报道，这与我们之前描述的热塑性-陶瓷复合材料（如PLLA–PGA + SrHAp复合材料）的结果形成了鲜明对比。(26)未来的研究应包括连续的pH监测，即使在缓冲系统中也是如此，以检测可能的局部碱性和/或酸性变化，(64)随后通过X射线衍射技术更精确地表征材料表面的变化。

在培养基中的老化过程在单相PLLA–PGA和双相SrCPC表面形成了不同的表层，这改变了局部流体传输、离子交换和降解过程。因此，这些改变的材料性质影响了人类骨肉瘤细胞系SAOS-2的细胞定植情况，该细胞系常用于细胞相容性分析。(65)虽然如前所述，单相SrCPC支架能够支持密集且分布均匀的细胞层，(15)但在双相支架中，同样的陶瓷相却导致了细胞粘附和增殖能力的下降（图7c,d）。这表明，可能由于相邻聚合物的降解，局部表面环境或离子微气候发生了变化，从而影响了细胞对SrCPC的粘附。同样，SrCPC表面形成的MgP（其浓度不同，且某些形式的MgP可能具有细胞毒性(66)）是否对此现象有所贡献也值得怀疑。相比之下，对于PLLA–PGA链来说，情况则相反：在初始细胞附着阶段（第1天），单相和双相支架之间的差异不大，但在单相PLLA–PGA支架上培养14天后，细胞密度没有显著增加（5 × 10^4个细胞/单位面积），甚至有所下降（5 × 10^5个细胞/单位面积）；而在双相支架中的PLLA–PGA链上，细胞密度显著增加（两组均为5 × 10^4个细胞/单位面积；图7c,d）。这些观察结果表明，SrCPC的存在促进了细胞增殖，例如通过释放Sr^2+离子（如图6f所示），或通过平衡聚合物降解引起的局部pH变化来实现。ALP活性（骨形成分化的早期标志物）在单相SrCPC支架中更早达到峰值（第14天），表明SrCPC支持骨形成分化。而在PLLA–PGA和双相支架中，ALP活性持续增加，第21天达到最高值。总体而言，双相支架上的细胞增殖和ALP活性接近单相SrCPC支架，并且通常显著高于单相PLLA–PGA支架（图8），这突显了将SrCPC与PLLA–PGA结合的积极效果。

4.4 研究的局限性与展望
将SrCPC作为生物活性陶瓷相与PLLA–PGA作为可降解聚合物结合，并采用混合挤出打印技术，增加了制造过程的复杂性，包括打印和后处理步骤。在考虑其应用时，需要仔细权衡双相支架带来的好处是否足以抵消额外的工艺步骤和参数。本研究的体外实验证实了我们的第一个假设，即由于矿物相的缓冲作用，聚合物降解过程中的pH下降幅度较小。然而，第二个假设仅部分正确：尽管细胞实验显示双相支架中的细胞增殖和碱性磷酸酶活性显著增强，但长期来看，聚合物相的存在抑制了骨刺激性锶离子的释放。还应通过相关的骨缺损模型来评估混合支架的优越性。这也有助于评估双相支架中观察到的局部异质性对细胞-材料相互作用的影响，以及这些异质性对新骨形成的影响。从机械角度来看，未降解的PLLA–PGA支架的机械性能处于生理相关范围内（67?69），但单独的SrCPC结构本身较为脆弱，聚合物相的加入并未充分缓解这种脆性。在24周的观察期内，其机械性能如预期般下降，但具体的体内降解动力学仍有待研究。

5. 结论
我们成功实现了热塑性聚合物和陶瓷浆料的双相打印，尽管PLLA–PGA的打印参数需要进一步优化以减少热损伤。主要材料性能得到了保持，矿物相在聚合物降解过程中起到了缓冲酸性的作用，从而减少了酸化并提高了生物相容性。降解研究揭示了介质和成分特定的影响：在水中，双相支架中的PLLA–PGA组分似乎从单相PLLA–PGA典型的自催化降解转变为水解降解，这可能是由于SrCPC的缓冲效应。在培养基中，所有支架的降解主要是水解反应，并伴随着离子-表面相互作用，形成了不同的矿物沉积物，单相PLLA–PGA表面形成了富含NaCl的层，单相SrCPC表面形成了羟基磷灰石，而在双相支架中的SrCPC链上形成了先前未报道的富含镁的相。后者伴随着Sr释放的抑制以及磷酸根释放的缺失。这些由材料驱动的表面变化直接影响了细胞定植情况，双相支架的表现更接近单相SrCPC对细胞的响应，显示出更高的细胞增殖和骨形成活性。总体而言，这些发现突显了降解过程的复杂性，其中水解、离子交换、寡聚物扩散和pH依赖性缓冲同时发生。尽管如此，双相打印技术作为一种定制骨支架降解和生物活性的方法已经显示出巨大潜力，为未来的体内研究提供了坚实的基础，以阐明离子释放机制及其在骨刺激中的作用。