在废水环境中快速克服Taq聚合酶的抑制作用：利用电位PCR技术实现17分钟内对硝化细菌的阿托摩尔级检测

《ACS Electrochemistry》：Rapidly Overcoming Inhibition of Taq Polymerase in Wastewater Media: 17-Minute Attomolar Detection of Nitrobacter Based on the On-Electrode PCR Technique

　　高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片

通过聚合酶链反应（PCR）检测细菌通常需要提取和纯化分析物DNA序列，整个分析过程通常需要5到8小时。在这项研究中，我们展示了如何大幅简化这一流程，将检测时间缩短至17分钟。电极上（oE-PCR）技术通过将正向引物共价连接到伪石墨纤维电极上来进行基于表面的5循环PCR扩增，从而省去了电泳分离步骤。目标序列是Nitrobacter基因组DNA（340万碱基对）中的16S rDNA基因的225个碱基对序列以及细胞外环境（e）DNA。oE-PCR技术能够克服未经处理的原始污水和鸡汁基质对Taq聚合酶的抑制作用，这些基质对其他PCR变体来说都是具有挑战性的。表面扩增子的检测是通过引入电化学活性的钴(III)三(1,10-菲啶)插合物来实现的，随后进行方波伏安（SWV）分析。检测结果相对于空白对照和无模板对照（NTC）是阳性的。oE-PCR过程的总时间为17分钟，检测限低于20阿摩尔（aM）。该方法的检测限超过了在废水基质中检测Nitrobacter DNA所需的纳摩尔（nM）水平。虽然qPCR可以提供定量结果，但它耗时较长。然而，oE-PCR可以作为qPCR的快速筛选工具。能够在如此复杂的基质中快速检测Nitrobacter，在医学、环境和法医学领域可能具有重要的应用价值。

**引言**
聚合酶链反应（PCR）是分析和基础研究不可或缺的工具。各种形式的PCR都依赖于Taq聚合酶，这是一种耐热酶，能够复制DNA序列。(1) 然而，酶的功能取决于从样品基质中去除Taq聚合酶抑制剂。废水中含有许多这类抑制剂，包括腐殖酸、富里酸、胆盐、尿素、酚类化合物、多糖和Mg2+。(2,3) 来自污水的样品尤其具有挑战性。(4) 到目前为止，还没有研究能够在不进行提取的情况下在这种基质中进行PCR。(5) 使用商业DNA分离试剂盒和PCR技术，整个分析过程需要3到6小时。(6?9) 从主要检测技术——荧光的角度来看，这种净化步骤也是必要的，因为荧光对散射颗粒非常敏感。(10) Nitrobacter能够将亚硝酸盐氧化为硝酸盐，这是废水处理中的一个重要步骤，因为硝酸盐对环境的危害较小。(11,12) 在废水排放到环境中之前，检测Nitrobacter对于废水监测非常重要。(13,14) 已经使用了几种方法来完成这项任务，包括细胞培养、原位杂交和定量（q）PCR。(15?17) 其中，后者是检测、定量和监测环境中Nitrobacter种群的金标准。(18) 然而，qPCR需要几个小时的时间，因为它需要从细胞中提取DNA并进行进一步的分离步骤。(19?22) Nitrobacter的细胞外（e）DNA是生物膜基质的一部分，该基质起到保护作用，防止宿主反应。(23) 这个目标不需要破坏细胞和分离DNA，因此有可能减少工作量。eDNA通常以皮摩尔（pM）或更低的浓度存在，但在PCR之前需要广泛的预处理。(5,24) 另一种简化工作流程的方法是固相（sp）PCR，它可以消除PCR后的分离步骤。(22) 这是通过使用表面固定的引物来实现的。然而，到目前为止，还没有关于在未经处理的废水样品中使用spPCR的成功记录。这项技术仅限于经过处理的样品。(25) 在之前的出版物中，我们在一种基于纳米晶石墨涂层的微Fe珠的复杂基质（鸡汁）中观察到了原位PCR。固定的引物通过共价键连接到表面。(26) 这种键非常牢固，能够承受56至95°C的热循环。这种spPCR的形式的显著特点是它能够在不进行任何样品处理的情况下扩增目标序列，这是先前文献中未观察到的。(26) 本研究展示了一种基于简化的eDNA PCR序列的快速Nitrobacter鉴定技术，该技术不需要对污水样品进行任何处理——即电极上的oE-PCR过程。电化学技术是基于表面现象的，这进一步减少了工作量，因为其他检测技术（如光吸收或荧光）基于体积性质，需要将目标从散射颗粒中分离出来。所使用的电极材料是来自爱达荷大学的石墨热解沥青反应（GUITAR），这种材料具有丰富的基面结构缺陷，可以通过化学方法进行更大程度的修饰。(26,27) 这增加了GUITAR表面双链扩增子的浓度。电化学检测是通过钴(III/II)三(1,10-菲啶)[Co(phen)33+]插合物来激活的。(28) 结果表明，该检测平台可以在20分钟内完成筛选，并具有非常低的检测限（LOD）。

**实验部分**
**材料与方法**
关于GUITAR功能化和X射线光电子能谱（XPS）的更多细节，请参见（支持信息SI）。

**样品收集和定量PCR（qPCR）的DNA提取**
废水样品由爱达荷大学Erik R. Coats教授的实验室提供，来自他们的缩比模型废水处理设施，时间分别为2020年7月1日和7月2日。样品按照制造商的说明使用Qiagen DNA提取试剂盒（美国马里兰州杰曼敦）进行处理。进行定量PCR（qPCR）以确定样品中Nitrobacter的存在及其相对于真细菌的丰度。Nitrobacter和真细菌的引物来自文献。(31,32) 2020年7月1日和7月2日收集的样品分析显示，Nitrobacter占总真细菌种群的0.91%和2.17%。(33) 分别提取每个样品的DNA，然后合并。Thermo Fisher Scientific NanoDrop分光光度计（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）测定合并后的样品浓度为115.3 ng/μL。需要注意的是，oE-PCR方法不需要样品处理或DNA分离步骤。

**电极上PCR过程和伏安研究**
伏安研究使用Bioanalytical Systems CV-50 W电位计和Ag/AgCl参比电极进行，两者均来自BASI（美国印第安纳州西拉斐特）。方波伏安（SWV）参数为1.0 mV的步进电位和10 mV的幅度，频率为10 Hz。工作电极由沉积在碳纤维上的GUITAR组成，具体细节见SI。SI中包含了将引物共价连接到GUITAR表面的程序。PCR过程直接在经过引物修饰的电极表面上进行。在标准PCR管中加入以下成分：一个带有固定25个碱基正向引物的GUITAR纤维电极（SI中的表S1和S2）、10 μL 0.4 μM的20个碱基反向引物（表S1）、含有目标Nitrobacter dsDNA的处理样品（10 μL，来自废水，表S1）、PCR混合液（25 μL）和水（5 μL）。然后将这些成分混合在PCR管中。纤维随后进行5到30圈的PCR热循环，期间不取出。每个循环包括在95°C下变性2分钟，在56°C下退火30秒，在72°C下延伸3分钟。PCR完成后，用pH 7.10的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗纤维三次，然后将其暴露在pH 7.10、含有0.020 M [Co(Phen)33+]的溶液中1分钟，以便Co(III)复合物插入表面结合的dsDNA中。之后将纤维从该溶液中取出，放入pH 7.10、含有0.10 M PBS的电化学测试溶液中，以及来自Alfa Aesar（马萨诸塞州沃德希尔）的参考电极和A石墨棒电极。使用鳄鱼夹将三个电极连接起来。未经处理的样品在PCR步骤之前直接使用或通过0.45 μm滤膜（Whatman，马萨诸塞州马尔堡）过滤后加入10 μL样品。

**结果与讨论**
**提取的Nitrobacter基因组DNA的扩增**
之前使用我们的快速PCR技术的研究主要集中在短链单链DNA（ssDNA）序列上。(26) 在这项研究中，我们检测了其完整的基因组状态下的eDNA。（34) 基因组DNA在与表面结合的引物结合时可能会引起空间相互作用。(35) 为了评估这个问题，我们检测了提取并纯化的Nitrobacter DNA（Qiagen DNA提取试剂盒）。选择的Nitrobacter目标序列是来自NR_027578.1基因库的16S rDNA基因的225个碱基对（bp）序列（表1）。(36) 提取的（0.76 nM）基因组DNA被注入含有逆转录酶的无核酸酶水中（10 μL），并与逆转录酶和混合液一起加入PCR管中（SI中的表S4）。然后将带有固定正向引物的电极浸入该管中（见图1A–C）。为了适应DNA在电极表面的空间效应，表面固定的正向引物（SI中的表1）包含一个间隔基团（?(OC2H4)6?）。关于电极上PCR（oE-PCR）的循环次数的优化在SI的第3节和图S4中讨论，结果表明5次PCR循环足以使GUITAR电极表面饱和扩增子和其他dsDNA物种（图1D和SI的第3.1节）。PCR步骤如图1D所示，同时显示了表面结合的dsDNA物种。在GUITAR上对表面结合的dsDNA扩增子的电化学检测是通过将其浸入pH 7.10、含有0.10 M PBS的20 mM钴(III)三(1,10-菲啶) [Co(phen)33+]插合物溶液中进行的，随后进行SWV分析。Co(phen)33+与dsDNA的结合常数（Kb）为5.8 × 10^3 M^?1。(37) 这种伏安信号基于CoIII还原为CoII复合物的过程。(28) 从样品到检测的整个过程大约需要17分钟。

**表1. oE-PCR与其他快速DNA方法的比较**
| 技术 | 定量检测限（LOD） | 总时间 |
|-------------|-------------|--------------|
| oE-PCR | 20 aM | 17分钟 |
| 无提取的污水中Nitrobacter eDNA | | |
| LAMP | 1.33 aM | 60分钟 |
| 从污水中提取的Bacteroides属DNA | | |
| RPA | 4.15 fM | 70–75分钟 |
| 从污水样本中提取的Thiohalobacter DNA | | |
| RPA/CRS | | |
| CRISPR/Cas12a | 5.48 aM | 60分钟 |
| 从污水中提取的T. gondii DNA | | |
| qPCR | 0.143 fM | 8–10小时 |
| 数字PCR | 2 aM | 8–10小时 |
| 废水中的Pseudomonas aeruginosa | | |

**图1**
图1. 电极上PCR过程的示意图。GUITAR纤维电极显示在A–C中。步骤I是样品准备步骤。步骤II（图1D）是PCR热循环的可能性，详见SI的第3.1节，其中详细描述了基于表面的dsDNA物种的形成过程。

**高分辨率图像**
下载MS PowerPoint幻灯片

**SWV结果**
SWV结果显示在图2和图3中。图2还显示了无模板对照（NTC）和空白对照。目标浓度的计算基于Nitrobacter dsDNA中16S rDNA区域的225 bp（660 g/mol）。图2中20 aM DNA样品的信号明显高于对照组。对照组的残余响应是由于Co(phen)33+与固定正向引物的负电荷ssDNA之间的较弱静电相互作用。(28) p值（n = 4）是相对于对照组的。图3显示了不同浓度的提取Nitrobacter dsDNA的SWV峰电流。通过改变10 μL样品中提取的基因组DNA的浓度来确定检测限（LOD）（图1C）。8.0 aM的样品浓度与对照组没有显著差异（p = 0.07）。基于此，估计Nitrobacter目标dsDNA的LOD ≤20 aM。另外10 μL的鸡汁对照与NTC和空白对照的响应相似。鸡汁本身不含Nitrobacter。在PCR管中加入10 μL的鸡汁基质（38）和10 μL的20 aM Nitrobacter目标（图1C）与无核酸酶水溶液中的20 aM目标响应没有显著差异。值得注意的是，鸡肉汁基质对于PCR来说是一个特别具有挑战性的基质。(38) 图3中的另一项对照研究使用了固定的正向鸡肉引物（见支持信息中的表2）来靶向Nitrobacter DNA。这一对照结果与其他对照结果没有显著差异，进一步证明了该检测方法的特异性。相对较低的检出限（LOD）可能基于引物的表面密度，通过Ru(NH3)63+的循环伏安法（CV）估计其表面密度为3.81 × 10^14分子/平方厘米（见补充信息的第4节和图S5）。(39) 这与其他材料相比要高得多。(40?43) 与其他碳材料相比，改良后的GUITAR表面结合的单链DNA（ssDNA）浓度高出1-2个数量级。同样重要的是，表面结合的Co(phen)33+氧化还原探针的伏安信号在整个检测过程中保持稳定（见补充信息的第5节和图S6）。这一结果与关于金纳米粒子上结合的双链DNA（dsDNA）的相关文献一致。(28) 尝试对未涂层碳纤维进行改性并未成功，因为在应用开放电位PCR（oE-PCR）协议时没有产生任何显著的伏安信号。这与比较GUITAR和玻璃碳电极化学改性的研究结果相似。(44) 值得注意的是，金表面改性剂基于硫醇键，而硫醇键无法承受PCR的热循环。(45) 使用7种不同的电极在20 aM的检出限下评估了oE-PCR的可重复性，平均信号为174 ± 11.28 μA/平方厘米，证明了电极间响应的一致性。

图2：经过5次PCR循环后，表面结合的dsDNA中插入的Co(phen)33+的方波伏安（SWV）响应，包括空白对照（NTC）和提取的Nitrobacter dsDNA（20 aM）。

高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片

图3：经过15分钟、5次PCR循环后，表面结合的扩增子的SWV峰电流信号（图1D）。所有电极在伏安测量前都暴露于20 mM [Co(phen)33+]中。p值是相对于空白对照的。目标Nitrobacter dsDNA的检出限估计为20 aM。误差条为一个标准偏差区间，n = 4。
高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片

电位检测技术在未经处理的废水样品中克服了抑制作用
废水是一种复杂的基质，其中含有竞争性的eDNA，包括但不限于Nitrosomonas、聚磷酸盐积累菌（PAOs）、糖原积累菌（GAOs）以及许多可能的PCR抑制剂。(47?49) PCR过程中Taq DNA聚合酶的抑制是整个过程的重要障碍。这种酶会被多种化合物和颗粒物抑制。(50?52) 关于废水和其他基质中PCR抑制的文献非常多。(53?55) 在本研究中，使用oE-PCR技术检测了废水基质。这种基质需要经过特殊处理才能成功进行定量PCR（qPCR），包括PCR前的准备、DNA分离和PCR后的分离步骤。整个过程可能需要几个小时。(22) 本研究考察了快速oE-PCR技术克服这些抑制的能力。在第3.1节中，没有将提取和分离的Nitrobacter dsDNA分成10 μL的等分样本，而是直接将废水注入PCR管中。废水样本可以未经处理或经过0.45 μm过滤后使用。这些研究的SWV峰电流结果显示在图4中。过滤后的样本（p = 0.002，n = 4）与空白对照和NTC有显著差异，但与0.76 nM缓冲溶液中的分离dsDNA的SWV峰电流相似。然而，未经处理的样本与空白对照没有显著差异。这表明在应用oE-PCR技术之前，原始样本只需简单过滤即可。这一步不会增加太多时间，整个过程的总时间仍然在20分钟内。需要注意的是，本研究没有进行细胞破坏处理。在未经处理的废水样本中检测到的DNA是细胞外的。值得注意的是，该方法的检出限超过了在废水基质中检测Nitrobacter DNA所需的nM水平。(14,56) 这是已知唯一一种无需DNA分离即可使用PCR检测Nitrobacter的实例。

图4：未经处理的废水样本的oE-PCR SWV电流密度。比较了过滤后的废水（使用0.45 μm过滤器）、未经处理的样本以及分离的DNA（0.76 nM）样本。误差条基于4次测量的一个标准偏差。
高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片

oE-PCR与qPCR的比较
qPCR方法需要大量的样本准备工作，既费力又耗时，而oE-PCR所需的样本准备时间最少，并能快速检测目标物质。然而，虽然oE-PCR只能确认Nitrobacter的存在而不能量化其数量，但qPCR可以提供定量信息，从而更好地评估环境状况。值得注意的是，检测Nitrobacter对于废水处理设施的过程控制和法规遵从性非常重要。(57) 同时，快速检测Nitrobacter也非常关键，因为它们的缺失会引发快速的硝酸盐积累。(58) 当需要定量分析时，oE-PCR可以作为qPCR的快速筛查手段。

结论及其他PCR变体的比较
表1展示了oE-PCR相对于其他PCR技术的优势。总体而言，17分钟的快速检测时间和低检出限（约aM）在表格中表现良好。数字PCR和qPCR技术可以为DNA分析提供定量结果，但它们仍然需要较长的时间来进行PCR过程，如表1所示。还有三种相关的PCR技术：环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和RPA/CRISPR/Cas12a技术，这些技术速度快且对PCR抑制剂的耐受性更强。(59?61) 然而，目前还没有关于这些技术在检测原始污水中应用Nitrobacter的报道。作为对比，提供了其他通过污水传播的细菌物种的检测结果。使用LAMP检测污水中的Bacteroides属细菌的检出限为aM，但需要提取步骤，从而增加了总体时间。(62) 使用RPA检测污水中的Thiohalobacter需要提取，且检出限为fM。(63) RPA/CRISPR/Cas12a可以检测Toxoplasma gondii，检出限为aM，但仍需要DNA提取。(61) 这三种等温技术仍然需要某种形式的样本准备，即细胞裂解和DNA提取/分离。而oE-PCR系统省略了这些步骤，可以直接在原始样本基质中检测Nitrobacter的eDNA目标。在这方面它具有独特性。尽管本研究主要关注废水，但我们预计这项技术也将应用于医学、法医、环境以及其他复杂介质中的目标检测。其克服PCR抑制剂的能力是其他技术无法比拟的，这一点在原始污水（图4）和未经处理的鸡肉汁（图3）中得到了验证，且检测时间仅为17分钟。我们预计oE-PCR将发展成为一种低成本、便携式的设备。市面上有价格低于300美元的廉价热循环仪可供使用。