综述：超临界角荧光与拉曼技术在生物光子学中的应用

《Laser & Photonics Reviews》：Supercritical Angle Fluorescence and Raman Techniques in Biophotonics

　　摘要

荧光显微镜和拉曼显微镜在生物成像领域越来越受欢迎，因为它们能够以出色的对比度提供三维图像，无论是使用标记物还是无标记物的方式。目前，传统的光学显微镜技术可以相对容易地测量样品对比度的这两种机制，但所能达到的分辨率范围有限。最近在光学显微镜方面的发展通过检测操作，可以轻松达到衍射极限的分辨率，这利用了衰减波（EW）。例如，基于衰减波的超临界角（SA）显微镜可以提供比现有的全内反射（TIR）技术更多的轴向限制信息，并且可以在需要或不需要荧光染料和标记物的情况下进行结构和功能成像。这篇综述首先探讨了SA荧光（SAF）和拉曼（SAR）显微镜的基本原理，阐明了其背后的物理机制以及它们相对于传统成像技术的优势。我们深入研究了光学原理和仪器设备，强调了衰减波和临界角在激发和检测样品的荧光信号和拉曼散射中的作用。总之，这篇综述文章全面概述了生物光子学中SAF和SAR显微镜的当前状态。

1 引言

自从Hans Lippershey和Zacharias Janssen在1590年代初发明光学显微镜以来，它在生物成像领域发生了革命性的变化[1, 2]。然而，经典光学显微镜的分辨率受到轴向和横向限制，这一理论由Abbe在1873年提出[3]。在过去的几十年里，科学界为提高分辨率、穿透深度和成像速度做出了许多努力，因为生物医学应用的需求不断增加[4, 5]。其中，开发并应用于生物医学、材料和无标记成像的几种远场光学显微镜技术包括共聚焦激光扫描荧光（CLSF）[6, 7]、二次谐波产生（SHG）[8, 9]、双光子和三光子激发[10-13]、相干拉曼散射（CRS）[14]和泵浦-探测显微镜[15-17]。上述技术提供了关于研究样品的独特信息和特性。在许多涉及荧光的光学显微镜和光谱实验中，需要高度敏感和选择性的技术来检测位于表面附近的信号[18-21]。通常，表面是水溶液/玻璃或塑料的界面，在那里会发生许多现象，如脂质双层形成、细胞生长和表面等离子体[22-24]。然而，在界面处检测感兴趣的信号始终是一个关键因素，因为样品的焦体积产生的强信号会掩盖其他信号。当偶极发射体位于界面附近时，其行为及其正确理解已成为光学领域最大的挑战之一[25, 26]。表面附近的荧光分子的性质可能会发生显著变化，这可能会影响诸如荧光寿命、旋转相关时间和各向异性等重要参数。因此，对表面敏感的技术已成为能够实时表征材料和生物样品的强大检测和分析工具[27, 28]。需要指出的是，光学方法有几个根本性的限制，最明显的是分辨率（横向和轴向）。光学显微镜的进步进一步推动了超分辨率成像技术的发展，如受激发射耗尽（STED）[29]、随机光学重建显微镜（STORM）[30]和光激活定位显微镜（PALM）[31]。然而，这些传统的超分辨率成像和显微光谱工具并不专注于表面或界面研究。例如，作为最先进的分析技术，利用衰减波（EW）现象的表面敏感技术是光学成像和光谱中的金标准，用于从体相介质中区分感兴趣的信号[32, 33]。衰减波也被用于荧光光谱和显微镜中，也称为全内反射荧光（TIRF）[34-38]。此外，近场扫描光学显微镜（NSOM）技术提供了亚衍射分辨率，可以在近场区域捕获衰减波[39-44]。然而，这些技术涉及对大量扫描数据的后处理，导致实验时间消耗较长。此外，空间频率调制被应用于一系列超分辨率技术，包括超透镜[45-49]和微球透镜[50-55]。这些方法基于使用空间频率压缩的单次衰减波收集，将大的衰减波波矢转换为传播光。此外，报道了在波导边界和界面处的表面等离子体极化子或局域等离子体处的衰减波照明下的超分辨率显微镜的空间频率位移[56, 57]。从显微镜分辨率的角度来看，通过使用在一个方向上衰减的衰减光可以实现亚衍射分辨率。尽管这些方法如TIRF和NSOM利用了衰减光，但两种技术在分辨率极限上有所不同。TIRF在轴向（z）上超过了分辨率极限，因为它是选择性表面激发的，但在横向（x,y）上仍然是衍射极限的，而NSOM在所有三个空间维度上都实现了这一点。在过去的几年中，基于衰减波的TIRF显微镜在各种应用的光学成像中得到了最广泛的使用[58, 59]。值得注意的是，全内反射（TIR）显微镜不仅限于基于标记物或荧光的应用，也适用于无标记物或一般的拉曼散射应用[60]。从概念上讲，当激光束在高数值物镜的后焦平面（BFP）上以临界角以上照射时，衰减波会在视场范围内产生。值得注意的是，一种类似的技术可以使用抛物面反射器在荧光光谱中实现表面附近的荧光信号的轴向限制，也称为禁光或超临界角荧光（SAF），用于单分子检测，这一技术最早由Seeger小组的出版物提出[61, 62]。与其他技术（如激光扫描共聚焦显微镜[63]）相比，SAF技术提供了三维（3D）单分子检测的亚衍射轴向分辨率。应该注意的是，SAF是TIRF的逆过程，换句话说，SAF检测在表面附近表现出衰减场。衰减波和SAF都是用于荧光显微镜和光谱的光学现象。主要区别在于，衰减波依赖于光在两种不同折射率的介质界面处发生全内反射时的激发现象。相比之下，SAF基于在接近界面的分子处收集荧光信号的发射现象。SAF技术的发展和最近进展在生物成像、材料科学和传感应用中取得了重大突破[64-72]。SAF相对于TIRF的主要优势在于，衰减发射不依赖于激发角度。最重要的是，TIRF光学技术超出了我们综述的范围，尽管它们在照明原理上有相同的相似之处。最近，SAF技术的发展成为一些综述的主题[73, 74]。最新的综述文章重点介绍了SAF技术的基本原理，但没有详细描述近年来应用的各种SAF显微镜。此外，这篇综述文章详细介绍了包括无标记（无需染色）的超临界角拉曼（SAR）[75]在内的SAF方法，从而避免使用荧光标记。这篇综述专门讨论了基于两种成像对比机制的SA显微镜和光谱：荧光（标记）和拉曼（无标记）。在本文中，我们涵盖了与其他团队相关的SAF技术的最新发展、优势和挑战。此外，我们还讨论了SAF显微镜中的各种实验和技术创新。在这篇综述的第一部分，我们总结了SAF的基本概念以及包括SAF成像在内的各种SAF技术的实验实现。综述的第二部分讨论了SAF在超分辨率成像、荧光相关光谱（FCS）和生物传感中的各种潜在应用。除了SAF的讨论外，还介绍了超越荧光的SAR技术，它利用了无标记的拉曼散射。我们还强调了SAF和SAR技术的新兴趋势和未来发展方向，这些技术可能会进一步增强这些技术在生命科学研究中的能力。

2 超临界角荧光背后的理论

在经典电动力学框架中，荧光分子表现为完美的偶极发射体，并在所有方向上各向同性地发射荧光[76-78]。当分子嵌入介电均匀的环境中时，荧光发射的角分布遵循立体角[79]。当荧光团靠近两种不同折射率（RI）的介质之间的界面时，这种行为会发生显著变化，例如玻璃/空气。这种荧光发射通过一种称为SAF的强大方法在界面附近被收集。与基于衰减激发的TIRF不同，SAF指的是衰减发射。衰减场可以通过在总内反射的临界角以上对样品/玻璃界面进行光照来产生，该临界角由Snell定律给出。描述信号效率的分子检测函数是激光激发高斯光束轮廓和轴向SAF收集轮廓的乘积。衰减场的强度沿着光轴的轴向（z）呈指数衰减，如方程（1）和（2）所示[80, 81]。

(1)
(2)

其中是z = 0处的强度，是入射角依赖的衰减长度。假设一个波长为的激光以角度照射到具有折射率（水）和（盖玻片）的样品的界面上。因此，衰减场在界面附近的薄轴向部分可以延伸到约100纳米。在TIRF显微镜中广泛使用的两种常见方法是棱镜型和物镜型[82]。然而，棱镜型设置受分辨率限制，并且在分析生物样品时仅限于获得亚衍射极限的信息[83]。因此，TIRF物镜具有出色的特性，可以在SA下照射样品/盖玻片界面。通常需要高数值孔径（NA）大于1的物镜，才能在玻璃/空气界面进行实验[84]。当荧光团位于低RI的介质中时，激发的荧光团要么发射大部分荧光，要么向高RI的介质散射。传统上，来自荧光团的辐射分布足够接近界面，这被称为禁光检测或SAF。为了在临界角以上收集荧光信号，SAF使用高NA的定制物镜和抛物面镜片[66, 85, 86]。TIRF的灵敏度取决于激光照射角度。另一方面，SAF不依赖于照射角度，样品可以在临界角以下或光照射下被激发以填充BFP。这样，可以在体相溶液中激发荧光样品，并随后检测到θc以下的荧光发射。这种照明使得可以从临界角以下的荧光团检测到荧光信号，从而实现了所谓的亚临界角荧光（UAF）。这两种检测模式都可以使用单个显微镜物镜实现，该物镜可以选择性地同时分离表面附近的荧光信号和体相中的荧光信号。图1a显示了玻璃/水界面处SAF信号发射的原理。图1b展示了基于抛物面镜的SAF显微镜物镜的示意图，它在水/玻璃界面收集SAF和UAF发射。图1c显示了随机定向的偶极发射体发出的辐射的角分布。SAF通过收集角实现表面限制，而TIRF主要依赖于临界角以上的激发。值得注意的是，SAF在超临界收集角处的强度与方程（1）中的指数衰减有关。油浸式显微镜物镜的收集效率（CE）依赖于方程（3）和（4）来表达[87]。

（3）

（4）

其中，是随机偶极子进入负半空间（玻璃）的通量强度分布，是玻璃/浸油的光学折射率（RI）。图1在图查看器中打开

（a）玻璃/水界面处超临界角荧光（SAF）信号发射的原理。（b）物镜照明（绿色）和收集光（红色）的示意图，物镜同时收集SAF和亚临界角荧光（UAF）信号。（c）来自水/玻璃界面的随机取向偶极子发射器的辐射强度的角度分布。经[88]许可复制。（d）水/玻璃界面处总内反射荧光（TIRF）和SAF检测的表面限制强度随表面距离的比较。TIRF激发角度在62°、64°、68°和74°时，衰减波（EW）的强度会下降。SAF的CE在62°到80°的SA范围内获得。经[89]许可复制。版权所有2004年，美国光学学会。图1d显示了SAF和TIRF随表面距离的轴向限制。在这种情况下，SAF成像的基础在于收集表面近场区域的衰减场。

4 SAF和SAR显微镜的仪器和实验实现

SA技术已在荧光显微镜中使用了数十年，但拉曼光谱学的最新进展使得这种技术成为一种无标记方式研究样品的分析工具。在实验讨论中，我们将讨论限制在出版物中报道的几种SA显微镜和光谱学设置中涉及的仪器和关键元件。实验上，可以将SA方法与任何激光扫描系统结合，构建SAF和SAR成像模式。最重要的是，SAF显微镜系统可以配置二极管激光器、高灵敏度光电探测器（CCD或PMT）和TIRF物镜（在获取SA任务中起主要作用的关键光学元件）。在扫描显微镜中，SAF组分可以通过使用非球面透镜和抛物面收集元件的专用物镜与UAF分离。Seeger的团队使用NA约为1.0的物镜实现了这一点，并将其用于表面敏感成像应用。图2显示了一般SAF显微镜系统的示意图。图2在图查看器中打开

一般超临界角荧光（SAF）显微镜系统。两个独立的信号（SAF和亚临界角荧光（UAF）由两个探测器检测。此外，许多研究小组展示的典型SAF和SAR显微镜设置如图3所示，其组件如下讨论。例如，Barroca及其同事展示了全视场SA荧光（F2-SAF）显微镜用于成像活细胞[90]。图3a展示了具有双通道检测模式的多模实时F2-SAF成像设置。在这种设置中，商用倒置显微镜配备了物镜（Apochromat 60×，NA 1.49，Nikon）和标准130 W汞灯，以及两个相同的EM-CCD（iXon+，Andor Technology）相机用于HEK 293细胞成像。UAF信号被一个带有不透明圆盘的圆形掩模阻挡，只允许SA光通过。此外，SAF现象还使用传统共聚焦显微镜实现，以实现生物细胞膜成像的高横向分辨率[91]。该团队进一步展示了他们的全场技术作为虚拟SAF（vSAF），在界面处的轴向限制约为100 nm[91, 92]。图3b展示了vSAF显微镜设置。在这种设置中，显微镜系统配备了白光照明、高NA（1.49）物镜和vSAF光学系统。vSAF光学系统由三个透镜组成，安装在显微镜和相机之间。可拆卸的Bertrand透镜与相机同步。此外，Deschamps及其同事后来将vSAF用于单分子定位显微镜（SMLM）[93]。在这种设置中，荧光信号通过油浸物镜（60×，NA 1.49，Nikon）以俯视模式收集，并通过50:50分光器分离。两个透镜和一个楔形镜同时收集SAF和UAF发射，并最终由EM-CCD（iXon+，Andor Technology）的两个部分成像。此外，Cabriel等人还展示了基于SAF技术的3D SMLM[94]。图3c展示了双视图显微镜设置的示意图。显微镜设置设计了五种不同的激光器和TIRF油浸物镜（APO 100×，NA 1.49，Nikon）。检测路径配备了双视图像差成像与SAF产量（DAISY）模块，用于生物样品的可重复3D超定位成像。此外，图3d展示了结合了像差PSF工程和所有三个方向结构化照明模式的ZIMFLUX设置[95]。ZIMFLUX设置包括一个642 nm的二极管激光器（F-04306-107，MPB Communications）。光束使用声光调制器（3080-125，G&H）进行调制。在样品平面上使用的总功率为3 mW，样品直径约为50 μm。光束通过Glan-Taylor偏振棱镜（GT10-A，Thorlabs）和电光光调制器（EM400K，Leysop）来调节偏振角度。使用半波片（WPH05M-633，Thorlabs）和四分之一波片（WPQ05M-633，Thorlabs）来校正椭圆偏振。光束通过物镜（UplanFL N，4x/0.13，Olympus）准直到保持偏振的光纤（P1-488PM-FC-1）。光束通过数字微镜装置（DLP7000BFLP，Texas Instruments）引导。光束通过位于傅里叶平面中的定制空间滤波器。光束通过长通二向色镜（Di03-R660-t1-25.2×35.6，Semrock）反射，并由物镜（CFI Apo 1.49 TIRF 100XC Oil，Nikon）聚焦。最后，背反射信号通过可变形镜（Multi-3.5，Boston Micromachines）引导，并添加大约90 mλ的像差到PSF中。CMOS相机（01-KINETIX-M-C，Teledyne Kinetix Scientific CMOS）用于捕获传感器平面上的发射光，像素大小为6.5 × 6.5 μm2，导致样品平面上的像素大小为65 nm。最近，SA与STED显微镜结合使用以提高轴向分辨率[96]。图3e展示了STED-SAF显微镜设置。在这种配置中，超连续光源（SC450-HE，Fianium）提供两个输出光束，波长分别为λexc = 488 ± 6 nm的激发光束和λSTED = 585 ± 10 nm的耗尽或STED光束。STED光束通过聚合物掩模（VPP-A1，RPC Photonics）引导。圆偏振的STED光通过消色差四分之一波片（RAC 3.4.15，Bernhard Halle Nachfl.）导向物镜的后孔。激发光和STED光束通过高数值孔径（60×，NA 1.49，Nikon）的油浸物镜紧密聚焦在样品上。使用压电舞台扫描器（P-545）和扫描控制器（E-710，Physik Instrument）对样品进行3D扫描。荧光信号通过二向色镜。分光器（BP145B1，Thorlabs）使用掩模分离SAF信号。最后，荧光信号由两个光纤尾纤单光子雪崩光电二极管（SPAD，Picoquant）检测。所有图像都由SymPhoTime 64软件（SPT64，版本2.1，PicoQuant）分析。尽管在荧光领域的出版物数量不断增加，但Serrano和Seeger在拉曼光谱学中也展示了SA[75]。图3f展示了SAR显微镜设置的示例，该设置可以同时在不同通道中测量亚临界角拉曼（UAR）和SAR信号。在这种设置中，一个工作在633 nm波长的二极管激光器通过定制的物镜引导到显微镜中。UAR和SAR的背散射信号通过中心带有不透明表面的45°镜分离。对于荧光信号，两个相同的全光子雪崩二极管（SPADs）配备了检测单元。对于拉曼信号，两个芯径为200 μm的相同多模光纤连接到冷却至-70°C的低噪声CCD相机。最后，UAR和SAR信号可以通过两个独立通道检测。图3在图查看器中打开

（a）F2-SAF成像实验设置的示意图。DM：二向色镜；L：透镜。经美国光学学会许可从[90]复制。（b）用于单分子定位显微镜（SMLM）的vSAF显微镜设置。经美国光学学会许可从[93]复制。（c）实验DAISY显微镜设置。BS：分光器；BFP：后焦平面；EPI：荧光显微镜。经Nature Portfolio许可从[94]复制。（d）ZIMFLUX显微镜设置。AOM：声光调制器；PP：偏振棱镜；EOM：电光调制器；HWP：半波片；QWP：四分之一波片；L：透镜；M：镜；ExF：激发滤光片；DMD：数字微镜装置；SF：空间滤光片；DC：二向色镜；EF：发射滤光片；DM：可变形镜。经美国光学学会许可从[95]复制。（e）刺激发射耗尽（STED）超临界角荧光（SAF）显微镜设置。PBS：偏振分光器；DF：耗尽滤光片；ExF：激发滤光片；PP：相位板；QWP：四分之一波片；PES：定位舞台扫描；EmF：发射滤光片；MMF：多模光纤；AM：振幅掩模；APD：雪崩光电二极管；DM：二向色镜。经Elsevier Inc.许可从[96]复制。（f）双通道超临界角拉曼（SAR）和亚临界角拉曼（UAR）显微镜设置。DBS：二向色分光器；BS：分光器；FM：翻转镜；FC：光纤耦合器；OF：光纤；SPAD：单光子雪崩二极管。经Springer Nature许可从[75]复制。

4 超临界角技术的应用

超临界技术的发展最初集中在生物传感和生物成像应用的荧光上。此外，拉曼显微镜和光谱学也被证明可以无标记地利用超临界技术的独特优势。本节介绍了SAF和SAR的应用，首先介绍了这些先进光学模式获得突出地位的历史背景和背景。它简要介绍了相关现象的物理原理和数学框架，阐明了SAF和SAR显微镜技术的最新发展和实现，并强调了在生物成像、单分子检测、生物传感、医学科学、FCS和拉曼光谱学中的关键应用。接下来的例子展示了SAF和SAR显微镜在微米和亚微米尺度研究中的显著进步。

4.1 单分子定位显微镜

在本节中，我们重点介绍了一些基于SAF方法的超分辨率成像工作。光学显微镜的衍射极限为横向约200 nm和轴向约500 nm的分辨率。尽管各种光显微镜技术最近取得了进展，但SMLM如PALM和（直接）STORM [(d)STORM] 可以轻松提供低至5–10 nm的横向分辨率[97, 98]。此外，STORM扩展到使用圆柱透镜的像差成像，可以实现3D SMLM的50–60 nm轴向分辨率[99]。在光显微镜中超分辨率技术的发展之后，该技术于2014年获得了诺贝尔奖。Stefan Hell领导的团队开发了一种称为MINFLUX的强大超分辨率技术，可以在3D中实现纳米级分辨率[100, 101]。此外，MINFLUX与基于波形的照明结合使用，以增强2D [102] 和3D [103] 的视野。最近，由于SAF显微镜在提高表面敏感生物成像应用的分辨率方面的兴趣日益增加。在这种情况下，SAF在利用定位显微镜研究单分子时可以发挥其优势。通过表面选择性3D-SAF显微镜（3D-SAFM）可以实现亚衍射纳米级轴向分辨率[63]。图4a显示了用Cy5标记的小鼠胚胎NIH 3T3成纤维细胞微管网络的图像。微管网络的大部分位于盖玻片第一个波长约600 nm范围内，并且如图4b的插图所示，可以轴向定位并限制在表面附近。图4在图查看器中打开

（a）胚胎成纤维细胞微管网络的三维（3D）超临界角荧光（SAF）图像。（b）插图：图（a）中感兴趣区域的像素的3D表示[虚线框]。样品的扫描采用了156纳米的像素大小和3毫秒的积分时间。刻度尺为10微米。经许可转载自[63]。版权归2010年美国物理学会所有。使用SAF进行的单分子研究显著提高了三维定位显微镜的分辨率[94]。图5展示了带有DAISY图像的生物样本的多色SMLM。为了测试分辨率性能，将大肠杆菌附着在盖玻片上，然后用两种AF647和AF555荧光染料标记。图5a,b显示了大肠杆菌的2D和3D SMLM图像。图5c显示了图5a中黄色线上的x-z切片。测量得到的细菌直径约为1微米，其边缘没有明显的分辨率损失。为了进一步证明这一点，横向和轴向的直方图分别用蓝色虚线和实线框表示。细胞的底部轴向标准差为30纳米，顶部为45纳米，而两种颜色的横向标准差均为27纳米。此外，DAISY还被用来可视化培养的大鼠海马神经元的亚膜支架。图5d-f显示了支架内两种蛋白质adducin和β2-spectrin的双色2D图像。adducin和β2-spectrin分别用AF657和AF555荧光染料标记。图5在图查看器中打开。

多色单分子定位显微镜（SMLM）的DAISY结果来自生物样本。(a) 用两种不同的AF647（红色）和AF555（青色）荧光染料标记的活大肠杆菌的2D图像。(b) (a)中显示的场域的三维（3D）图像。颜色条分别代表AF647和AF555的深度。(c) 沿着(a)中黄色线的x-z切片以及框内区域的轴向和横向剖面，其中σ值代表分布的标准差。(d-f) 用AF647和AF555荧光染料标记的大鼠海马神经元的双色2D图像。(g) (e)中显示的感兴趣区域的横向剖面。(h) (f)中显示的感兴趣区域的x-z切片。(a)和(e)的刻度尺为2微米，(d)为5微米，(f)为1微米。经许可转载自[94]，版权归2019年Springer Nature所有。图5g显示的横向剖面表明，adducin环和β2-spectrin表位的交替模式及其190纳米的周期性可以通过DAISY轻松在横向上分辨出来。图5h显示的x-z切片进一步表明，DAISY还可以在600纳米深度的整个轴突直径上分辨出adducin环和β2-spectrin蛋白的亚膜定位。此外，Zelger等人引入了SA定位显微镜（SALM）或直接光学纳米显微镜（DONALD）来研究DNA纳米尺样品上的DNA PAINT成像[104, 105]。名为ZIMFLUX的单分子定位显微镜方法结合了结构化照明模式，用于进一步探索纳米结构和生物样本的三维成像[95]。图6a显示了从附着在盖玻片上的随机取向的3D DNA折纸纳米尺样本捕获的视野（FOV），长度为81 ± 21纳米。FOV为16.6 × 16.6微米2。图6b展示了图6a中感兴趣区域的放大图像，其中定位结果与大小为10纳米的高斯核进行了卷积。图6c展示了结合位点与纳米尺相对于盖玻片的极角之间的欧几里得距离l，这表明PSF模型的准确性，与水平线有轻微偏差。图6d显示了纳米尺的长度，像差的PSF平均值为83 ± 7纳米，ZIMFLUX的平均值为83 ± 8纳米。图6e展示了沿z方向的实验精度和Cramér–Rao下界（CRLB）精度。对于像差的PSF，簇的中位数值为11.7纳米；对于ZIMFLUX估计，中位数值为6.0纳米。当ZIMFLUX结合像差PSF工程与传统SMLM方法相比时，实验结果显示在SAF条件下3D纳米DNA折纸纳米结构的定位无偏，轴向定位精度提高了1.5倍。

4.2 基于超临界角的STED显微镜

受激发射耗尽（STED）方法最初应用于荧光显微镜中，以实现低于衍射极限的横向分辨率[106, 107]。然而，实现传统STED显微镜的优异轴向分辨率需要复杂的仪器，这可能会降低横向分辨率[108]。STED方法需要高激光功率来诱导耗尽，这可能导致光漂白，并对活细胞成像产生负面影响。STED方法与TIRF显微镜结合，用于PtK2细胞中免疫染色微管的轴向切片成像和FCS[109, 110]。然而，TIRF显微镜在FOV内存在照明不均匀的问题，并且由于杂散激发导致轴向限制丧失[82]。基于SAF的STED被证明可以在玻璃/介质界面实现亚衍射轴向切片[96]。STED-SAF显微镜可以在生物样本上实现亚波长轴向切片。图7A-I显示了用Alexa Fluor 488（AF 488）染料标记的微管网络在固定COS-7细胞中的图像。图7中的两个样本的微管网络图像是通过不同的模式获得的，分别是共聚焦（A和F）、共聚焦-SAF（B和G）、STED（C和H）以及STED-SAF（D和I）。在SAF和STED-SAF模式下都可以观察到靠近表面的微管网络的表面选择性特征。强度剖面显示在图7E,J中。这些图表得出了三个结论：(i) 与共聚焦相比，STED的横向分辨率得到了提高；(ii) 与STED相比，STED-SAF具有更好的轴向切片能力；(iii) 与STED相比，STED-SAF没有横向分辨率的损失。STED-SAF的对比度增加高于共聚焦-SAF，表明STED-SAF有效地去除了密集标记的3D结构中的背景。

4.3 超临界角荧光相关光谱

FCS是一种强大的技术，可用于研究多种物理量，包括浓度、扩散系数和结合动力学。标准的共聚焦FCS存在表面选择性问题。已经报道了使用衰减波（即TIR-FCS）的表面限制FCS[111-114]。在TIR-FCS中，由于激发角度的限制，荧光发射受到严重限制，导致分辨率下降和光漂白。因此，SA-FCS成为一种有前景的技术，用于在观察体积内轴向和横向测量荧光限制[115, 116]。SA-FCS最初是使用荧光染料溶液和膜进行扩散测量的[117]。他们提出的理论框架使我们能够准确和定量地研究SA-FCS相关曲线。在FCS中，可以对扩散分子进行2D和3D的统计分析。理想情况下，时间依赖的荧光强度的标准化时间自相关函数G(τ)由方程(5)给出。

两个独立探测器的信号SAF和UAF的互相关可以表示为方程(6)：

其中 和 分别是时间t和稍后时间(t + τ)时SAF和UAF通道的强度均值偏差。τ是延迟时间。为了评估共聚焦-FCS相关曲线，可以应用3D数学高斯扩散模型[118]，得到的自相关函数表示为方程(7)：

其中C是荧光团的浓度，ω0是激光焦点的1/e2半径，D是扩散系数，S是描述检测体积轴向扩展的结构参数。当荧光团的扩散在2D中受到限制时，自相关函数表示为方程(8)：

SA-FCS在2D中的自相关函数表示为方程(9)：

z扫描的扩散时间( 和粒子数(PN)可以用下面的方程(10)和(11)表示为抛物线函数：

其中λ是激发光的波长，Δz是物镜聚焦位置与最小光束腰部的焦点平面之间的距离，n是介质的折射率。图8显示了使用Alexa 488荧光样本通过共聚焦-FCS和SA-FCS获得的自相关曲线。两个自相关曲线分别用方程(7)和(9)进行拟合。自由Alexa 488的扩散系数固定为410 μm2/s，以确定几何参数。对于SA-FCS曲线，激光焦点的1/e2半径为0.485 μm，略高于衍射极限的0.338 μm。SA-FCS的更高振幅是由于与共聚焦-FCS相比，其检测体积更小。图8在图查看器中打开。

(a) 在50 nM Alexa 488溶液中，通过共聚焦（实心圆）和超临界角荧光相关光谱（SA-FCS）（空心圆）获得的自相关曲线，并用方程(7)和(9)进行拟合。共聚焦-FCS和SA-FCS的激光功率分别为14 mW和87 mW。插图：共聚焦和SAF的检测体积。刻度尺为0.2 μm。(b) 在含有0.003% BP-GM1的DOPC支持的脂质双层（SLB）上通过SA-FCS获得的自相关曲线，并用方程(8)进行拟合。该值用自由的Alexa 488溶液进行了校准。激光功率为2.5 mW。经生物物理学会许可转载自[117]。此外，SA-FCS还被用于扩散测量[120]。图9a,b显示了用Lifeact-Venus标记的活COS-7细胞的荧光图像，使用了UAF和SAF通道。我们可以看到，这两幅图像的轴向信息不同。在UAF图像中，来自内部的密集肌动蛋白纤维多层重叠可见。相比之下，由于SAF的高表面选择性对比度，靠近盖玻片的薄层肌动蛋白纤维可见。此外，使用表达Lck10-EGFP的COS-7细胞进行了x-z切片。图9c,d显示了UAF和SAF的轴向切片图像。由于SAF的优异轴向分辨率，荧光信号是从靠近盖玻片的细胞膜收集的。图表显示了沿z位置的荧光脂质的扩散时间和粒子数，如图9e所示。使用方程(10)和(11)，分别测量了在SLB中Oregon Green 488与1,2-十二烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DHPE-OG488）结合的荧光分子的扩散时间和粒子数，步进大小为0.5 μm，距离为3.0 μm。两条曲线的物镜光束腰部分别为301 nm和281 nm。这个实验值与理论分辨率非常吻合，理论分辨率估计为1.22λ/2NA ≈ 286 nm，其中物镜的数值孔径（NA）为1. 此外，还使用荧光相关散射（FCS）技术通过测量标记脂质的扩散来表征SLB（脂质双层）的动力学和结构完整性[121]。这项工作展示了诸如清洁程序（例如，使用Piranha处理与氧等离子体处理）以及囊泡悬浮液的储存温度等因素如何影响最终膜的流动性和密度。对于含有胆固醇的SLB，FCS数据是通过异常扩散模型进行分析的。该异常因子量化了有序脂质结构（如脂质筏）的存在对脂质分子运动的阻碍程度。因此，FCS作为一种工具，可以用来监测SLB随时间的变化，确保在经过EDTA清洗等优化步骤后，脂质在两层中仍然能够均匀移动。

图9：使用Lifeact-Venus标记的活COS-7细胞的荧光图像，分别显示了（a）亚临界角荧光（UAF）和（b）超临界角荧光（SAF）通道下的情况。刻度尺为5 μm。图c和d分别显示了用Lck10-EGFP标记的COS-7细胞的x-z图像，对应UAF和SAF通道，刻度尺为3 μm。图e展示了使用z-scan SA-FCS技术测量的DHPE-OG488在脂质双层中的扩散时间（黑色轴）和粒子数量（蓝色轴）。转载自[120]，经美国光学学会许可。

4.4 使用超临界角荧光进行生物传感

光学生物传感器已成为一种强大的分析工具，能够以高特异性和灵敏度实时检测生物和化学物质[122]。在过去的几十年里，光学生物传感技术在多学科领域得到了快速发展，用于表征溶液/玻璃界面发生的现象。在基于荧光的免疫和DNA检测中，通常使用玻璃和聚合物基底的光学生物芯片系统[123-125]。超临界角荧光（SAF）的主要研究兴趣在于其在表面敏感检测应用中的潜力。需要注意的是，基于荧光的生物传感器会受到基底自体荧光的影响而产生背景噪声[126-128]。因此，基于衰减场（如TIRF）的生物传感器为生物传感应用带来了许多可能性[129, 130]。TIRF是一种常用的方法，用于限制荧光团在盖玻片-样品界面处的激发。这种选择性照明减少了来自样品内部的背景荧光，显著提高了信噪比（SNR），从而便于研究表面附近发生的事件。在本节中，我们将重点介绍使用SAF技术的不同生物传感应用。2002年，Ruckstuhl及其同事首次展示了SAF生物传感器[131]。在这项工作中，他们使用SAF技术检测到抗原浓度低至10^-13 mol/l。此后，同一团队使用SAF技术进行了多项研究，包括检测聚合酶活性、单核苷酸多态性以及纤维素修饰玻璃表面上的分子相互作用[132-134]。与之前的研究类似，SAF技术还被进一步应用于生物芯片读取器中，以实现快速检测分析[135]。他们开发的系统配备了由压电马达驱动的扫描平台，适用于即时诊断。该荧光芯片读取器的检测限（LOD）为每μm^2 0.14个Cy5染料分子，成像空间分辨率为5 μm。自那时起，SAF技术已广泛应用于多种生物传感应用，如免疫测定、聚合酶链反应（PCR）和细菌病原体检测[136-138]。此外，Kurzbuch等人提出了一种聚合物生物芯片，其SAF技术的检测限可达到人类IgG为10 pg/ml，DNA为10 pM[139]。这里我们举了一个使用SAF检测病原体的例子。最近，Nguyen等人设计了具有固体抛物面结构的SAF结构，这些结构对大肠杆菌（E. coli）的荧光信号具有高度敏感性[140]。这些SAF结构制造在高度分别为0、10、20、50、100和200微米的聚合物芯片上。图10a展示了使用最佳SAF高度时，从聚合物芯片的两个腔室获得的荧光强度的检测限（LOD）。每个腔室包含15个SAF结构。聚合物SAF芯片的LOD为5.42 × 10^4个分子。图10b显示了微阵列上E. coli的扫描荧光图像及其LOD。图10c显示了荧光强度与分子数量的关系图，红色框标出了相关数据。这种最佳SAF芯片可用于通过固相聚合酶链反应（SP-PCR）检测病原体E. coli。因此，这种SAF芯片能够检测到每μL中3.37 × 10^2个E. coli基因组的拷贝。图10d展示了荧光强度与每次反应中拷贝数之间的关系图。

（a）通过荧光扫描图像确定聚合物芯片上两个腔室中荧光强度的检测限（LOD）。（b）使用SP聚合酶链反应（SP-PCR）在超临界角荧光（SAF）芯片上检测E. coli的荧光图像。（c）图10(a)中荧光强度与分子数量的关系图。（d）图10(b)中荧光强度与每次反应中拷贝数之间的关系图。转载自[140]，经英国皇家化学学会许可。该团队还使用嵌入聚合物微芯片中的SAF微透镜阵列，对血液样本中的沙门氏菌血清型typhimurium和enteritidis进行了检测[141]。图11a,b展示了使用磁珠从 spiked血液中检测(a) S. typhimurium和(b) S. enteritidis的荧光扫描图像。S. typhimurium和S. enteritidis的LOD分别为86 CFU/ml和94 CFU/ml。整个分析时间少于3小时，其中选择性的血细胞裂解步骤耗时5分钟。图11c显示了不同细菌浓度下的信噪比（SNR）。研究表明，SP-PCR的灵敏度比直接结合磁珠的PCR方法高出10倍。SAF微透镜阵列是有效的、高度敏感的病原体检测工具。同一团队还将先进的环介导等温扩增（LAMP）技术与SAF结合，用于快速检测多种病原体，包括沙门氏菌属、弯曲杆菌属等[142]。

4.5 无标记的超临界角拉曼显微光谱技术

本文介绍的无标记技术，特别是拉曼光谱技术，在生物光子学研究中因独特的优势而受到关注。与通常需要使用荧光染料进行标记和染色的荧光技术不同，拉曼散射是一种无需任何外源标记即可直接获取生物分子功能信息的方法。然而，拉曼散射的截面非常小，大约在10^-29–10^-31 cm^2范围内，因此信号较弱[143]。最近在无标记成像方面的拉曼显微镜技术进展使我们能够研究单个细胞和组织[144-146]。尽管如此，自发拉曼散射的信噪比（SNR）和轴向分辨率仍然有限，而这些参数对于大规模成像和光谱应用至关重要。在这种情况下，出现了不同的拉曼显微镜和光谱技术。其中，表面增强拉曼散射（SERS）和共聚焦拉曼散射（CRS）提供了高灵敏度和特异性检测[147, 148]。尽管SERS也有一些缺点，例如会导致光谱信息发生改变，并且在不同基底上略有差异。从技术上讲，CRS显微镜需要体积庞大且昂贵的高峰值功率激光器，这使得光学设置更加复杂。在表面敏感检测方面，透射反射拉曼显微镜（TIRR）显微镜仍然是许多研究领域的关注焦点[149, 150]。由于SA技术主要与超临界角荧光（SA）相关联，Seeger团队最近报告了首次使用定制的SA增强物镜进行拉曼显微镜的研究[75]。在本节中，我们将回顾两个无标记SAR应用的例子，因为目前关于SAR领域的研究较少。图12展示了聚苯乙烯珠子的拉曼散射结果。实验中使用了水悬浮液中的聚苯乙烯微球。图12a,b显示了UAR（紫外吸收反射）和SAR（表面增强反射）图像。可以清楚地看到，SAR信号对盖玻片表面的微球更为敏感，而UAR信号主要来自样品内部。为了进一步了解SAR的轴向限制，测量了单个聚苯乙烯微球的半径方向上的信号。图12c选择了一个稳定的微球作为研究对象。聚焦光束在X0位置横向移动，步长为210 nm，如图12d所示。从X0到X6的每个位置都获取了拉曼光谱。图12e,f显示了聚苯乙烯微球的UAR和SAR光谱。当横向位置从中心移动到X6 = 1260 nm时，SAR强度减小。

图12：水中的聚苯乙烯微球的拉曼成像和光谱结果。（a）亚临界角拉曼（UAR）和（b）超临界角拉曼（SAR）图像。图像是通过选择性过滤1000 cm^-1波长的光获得的。图像旁边的颜色条表示强度范围（0-6000）。（c）盖玻片表面上平均大小为3.3 μm的单个微球。（d）描绘了微球在盖玻片表面上横向位置移动的示意图。图(e)和(f)中的聚苯乙烯微球的拉曼光谱显示了不同的峰分配。激发功率分别为0.5 mW（用于成像）和50 mW（用于光谱采集），对应的功率密度约为2 × 10^5和2 × 10^7。UAR和SAR采集通道的曝光时间分别为0.2秒和20秒。转载自[75]，经Springer Nature许可。除了之前的工作外，我们还使用SAR光谱研究了脂质双层中淀粉样蛋白（Aβ）聚集的结构[151]。图13a展示了与纯水相比，含有DOPE-free SLB的UAR和SAR光谱。图13b展示了含有DOPE-ATTO647的多层脂质的UAR和SAR光谱。在SAR通道中，观察到958 cm^-1处的拉曼位移，对应于O?P?O对称伸缩。这一峰的分配表明脂质极性头部靠近基底。传统的拉曼光谱在疾病研究中得到了广泛应用。在这里，我们讨论了Aβ蛋白的聚集，这是阿尔茨海默病等神经退行性疾病的主要原因。使用SAR技术可以深入了解表面处的蛋白质聚集机制，从而开辟新的分析方法，这些方法具有非侵入性、定量性、信息丰富性和可重复性以及快速性。为了理解蛋白质的二级结构，应用SAR研究了肽与SLB相互作用时的α-螺旋和β-折叠结构。图13c展示了Aβ(1?40)和Aβ(1?42)在单层SLB上的UAR和SAR光谱。UAR和SAR测量可以清晰地识别出酰胺I和III的峰值。酰胺I的波数分别为1650 ± 10 cm^-1（α-螺旋）和1670 ± 10 cm^-1（β-折叠）。由于UAR的收集体积较大，其信号强度高于SAR。Aβ(1?42)的酰胺I在1660 cm^-1（紫色）和1689 cm^-1（红色）处的拉曼峰被解卷积。β-折叠峰的面积占α-螺旋的46.9%。同样，酰胺I在1648和1683 cm^-1处的峰也归属于α-螺旋和β-折叠结构。然而，α-螺旋峰的面积仅占β-折叠的3%，难以与基线区分。此外，在1242 cm^-1处的峰属于β-折叠结构。UAR和SAR的结果进一步表明，Aβ(1?42)主要位于脂质表面附近，表现出明显的α-螺旋结构。然而，这些肽在远离脂质膜的地方聚集，并呈现出β-折叠结构。在Aβ(1?40的情况下，它表现出两种结构，在这些结构中α-螺旋不再局限于表面。图13d和e展示了假设的Aβ(1?42)和Aβ(1?40)吸附在SLB（支持脂质双层）上的结构示意图。该研究进一步扩展了他们的研究，揭示了钙离子对脂质膜上β-淀粉样肽聚集的机制[152]。应用结构活性（SAR）来研究钙离子在不同时间范围内对Aβ聚集的影响。研究表明，钙离子对Aβ1–42的影响比对40个氨基酸变体的影响更大。这项工作将为无标记方式更好地理解Aβ聚集开辟新的途径。

图13

超临界角拉曼（SAR）和亚临界角拉曼（UAR）光谱：(a) 无荧光的支持脂质双层（SLB）与纯水的比较；(b) 含有DOPE-ATTO647的多层膜。(c) 在SLB上孵育的Aβ的酰胺I和III区域的SAR和UAR光谱。图(d) Aβ(1?42)和(e) Aβ(1?40)吸附在SLB上的假设结构示意图。经美国化学学会许可转载自[151]。

5. 总结与展望

将SA技术结合到荧光和拉曼显微镜中，为高特异性地可视化标记和未标记样品在界面处的情况开辟了新的前沿。这篇综述文章为包括生物传感、单分子研究以及各种生物样品成像在内的广泛应用领域做出了贡献。下表1描述了各种SA技术及其参数。SAF和SAR显微镜作为分析化学中的表面敏感工具具有特殊优势，能够以高灵敏度和轴向分辨率研究荧光和非荧光样品。从成像的角度来看，SAF显微镜扩展了三个主要方面：第一方面是使用商用高性能显微镜物镜进行单分子定位显微镜，以实现超分辨率成像；第二方面是将SAF技术与FCS（荧光相关光谱）结合，以研究荧光分子和脂质双层的分子浓度、扩散和流动动力学；第三方面是在拉曼光谱中展示SA技术用于无标记成像，超越了荧光成像的局限。这种新方法可以用于强大的成像和分析工具，以了解表面生物分子的宝贵信息。最后，从未来发展的角度来看，在考虑将这种超临界技术用于显微镜成像之前，必须考虑一些挑战。第一个挑战是高质量显微镜物镜的可用性和成本效益，特别是针对超临界应用的物镜。使用坚固的TIRF（透明反射荧光）显微镜物镜可以确保结果的准确性并具有出色的表面灵敏度。第二个挑战是SA背后的关键机制需要在生物成像应用中进一步探索。值得注意的是，目前关于光学显微镜中SA技术的知识仍然有限，这导致研究界存在重要的信息空白。因此，需要仔细理解现有的先进SA技术，以便为所需的应用设计高通量的SA显微镜。此外，虽然最初预计超临界技术主要用于基础生物医学研究，但未来市场可以扩展到更多临床应用，例如快速筛选分析工具，以研究治疗反应并评估其效果。因此，我们认为超临界成像这一领域和研究是从基础生命科学/生物医学研究市场向应用医学市场的重大扩展。

表1. 各种超临界角（SA）技术的概述，包括原理、特点和性能。分辨率分别代表横向和轴向分辨率。

| 技术 | 分辨率 | 显微镜物镜 | 应用 | 检测模式 | 局限性 | 参考文献 |
|------------------|---------------|-----------------|------------------|------------------|-------------|
| SAF-光谱 | 衍射极限 | 95×, NA 1.32 油（Leitz Wetzlar） | 抗原分子检测 | 透射模式，单点测量：SPAD | [61] |
| SAF-全场 | 100 nm | 60×, NA 1.49 油（Nikon） | 荧光成像 | 实时HEK细胞 | 背散射模式，逐帧成像：EM-CCD | [90] |
| SAF-共聚焦 | ～226 ±12 nm | 60×, NA1.49 油（Nikon） | 固定CHO细胞 | 点扫描：PMT | [91] |
| SAF-FCS | ～150 nm | 自定义NA 1.0油 | 荧光成像 | 活COS-7细胞 | 背散射模式，单点扫描：SPAD | [153] |
| SAF-STED | ～70 nm | 60×, NA 1.49 油（Nikon） | 固定COS细胞 | 背散射模式，单点扫描：APD | [96] |
| SAF-SMLM | ～10 nm | 100×, NA 1.7油（Olympus） | DNA折纸，活细菌膜 | 宽场模式，逐帧成像：EM-CCD | [154] |
| SAR | 衍射极限 | 自定义NA 1.0油 | 拉曼（无标记）：聚苯乙烯微球 | 背散射模式，单点扫描：CCD | [75] |

致谢

本工作得到了苏黎世大学（UZH）和瑞士国家科学基金会（SNSF）的支持。开放获取出版由苏黎世大学通过Wiley - 苏黎世大学协议与瑞士学术图书馆联盟共同促进。

作者声明没有利益冲突。

Subir Das在印度的高哈蒂大学和特兹普尔大学获得了物理学和纳米科学与技术的学士和硕士学位，随后在台湾国立阳明大学的生物光子学研究所获得了博士学位。他目前是瑞士苏黎世大学化学系的博士后研究员，研究兴趣包括光学显微镜、荧光成像、超快激光、非线性光学和光学技术。他曾担任国立阳明大学OPTICA学生分会主席。

Nathalia Simea Münch在巴塞尔大学获得了化学学士和硕士学位，目前正在瑞士苏黎世大学Stefan Seeger教授的指导下攻读博士学位，研究重点是超临界角拉曼光谱和荧光显微技术在固体支持脂质双层表面研究β-淀粉样蛋白聚集的应用。她是瑞士化学学会的成员。

Stefan Seeger在海德堡大学获得了学士学位，在柏林工业大学获得了硕士学位，均属于化学专业。他于1992年在海德堡大学获得博士学位，目前是瑞士苏黎世大学化学系的教授，也曾担任该校物理化学研究所的所长。他领导的实验室成功开发了超临界角荧光显微镜和光谱技术，以及具有超疏水性和超疏油性的表面纳米结构。