利用irm-13C核磁共振（NMR）和红外质谱（IRMS）技术区分植物来源和动物来源的胆固醇

《Magnetic Resonance in Chemistry》：Differentiation of Plant and Animal-Derived Cholesterol Using irm-13C NMR and IRMS

　　**摘要**

在欧盟，供人类消费的动物产品被归类为动物源性产品（POAO），而不供人类消费的产品则被视为动物副产品（ABPs）。POAO和ABPs都受到严格的监管，以确保动物和公共健康，并通过各种欧盟指令和法规进行控制。过去十年中，消费者对植物来源的化妆品、植物提取物和营养补充剂的需求也大幅增加。即使有认证的参考标准，确保这些复杂消费品中使用的成分、原材料和辅料的来源仍然具有挑战性。本文报告了一种可靠的方法，利用irm-13C核磁共振（NMR）和同位素质谱（IRMS）来识别胆固醇的来源，胆固醇是化妆品和美容产品中的常见成分，该方法可以区分植物来源和动物来源的胆固醇。此外，我们还展示了能够区分半合成胆固醇与植物来源和动物来源的胆固醇。

**1 引言**

胆固醇（1）由动物生物合成，在植物中的含量要低得多[1]。植物中含有大量具有类似胆固醇化学结构的物质，但其分子构成略有不同，这些物质被称为植物甾醇[2]。除了在动物体内调节或参与多种生化途径外，胆固醇还是多种化妆品、营养补充剂和植物基消费品的关键成分[3-5]。在化妆品中，胆固醇用作保湿剂和润肤剂，有助于软化皮肤并改善细纹和皱纹的外观。它还被认为有助于增强皮肤的屏障功能并防止环境损害[6, 7]。令人担忧的是，有证据表明动物来源的成分可能导致传染性海绵状脑病（TSE），这是一种致命的朊病毒疾病，发病后几个月到几年内可能导致疾病[8-12]。因此，一些制造商使用植物甾醇来合成胆固醇，这种胆固醇有时也用于制药[13, 14]。欧盟对动物源性产品（POAO）和动物副产品（ABPs）的监测非常严格，旨在确保动物和公共健康[15]。虽然在美国的监管相对宽松，但消费者仍然强烈偏好不含动物来源成分的产品[16, 17]。这些产品通常被宣传为“纯”植物成分制造，其价格通常高于成分来源不明的传统产品[18-20]。分析这些纯植物来源产品的关键原材料、辅料和活性成分是一个巨大的挑战。一般来说，确认成分来源的唯一有效分析方法是基于2H或13C的同位素比例分析。这些分析可以通过同位素质谱（IRMS）来确定材料中的平均同位素比例[21-24]，或者通过irm-13C NMR（同位素比例监测）来确定每种同位素体的具体摩尔分数[25, 26]。这两种技术，尤其是irm-13C NMR，可以提供分子的独特同位素指纹，从而揭示其历史和来源的详细信息。这种方法已被证明是追踪如茴香脑[27]、苯甲醛[28, 29]、香草醛[29, 30]、甘油[31, 32]等基本成分真实来源的可靠方法[27, 28, 29, 30, 31, 32]。它也是鉴定果汁[35]、葡萄酒[36]、橄榄油[37]和其他高价值食品[38]的宝贵工具。对于胆固醇而言，确定其来源尤其具有挑战性，因为导致角鲨烯的生物合成途径在动物和植物中遵循相同的初级步骤。这种生物合成过程始于从乙酰辅酶A（acetyl-CoA）生成甲瓦龙酸（mevalonate），随后通过释放CO2形成异戊二烯单元，并将六个异戊二烯单元缩合形成线性中间体角鲨烯。在动物体内，角鲨烯环化形成初级前体羊毛甾醇（lanosterol），然后经过19步氧化和甲基基团的去除或迁移进一步转化为胆固醇（图1）[39]。在植物体内，角鲨烯环化形成环阿魏醇（cycloartenol），并通过一系列酶促步骤进行修饰，包括侧链还原和去甲基化，从而形成胆固醇（图1）[40]。因此，植物来源和动物来源胆固醇的2H或13C同位素组成之间的任何差异都是由于特定酶结构和动力学[41, 42]、地理区域、环境条件[43]、提取程序[43]以及许多其他因素[44]的微妙差异所致。有趣的是，已经使用irm-13C NMR和2H作为同位素探针来研究各种角鲨烯样本的来源。在那项研究中，通过直接比较和主成分分析（PCA）方法[45]来检测2H的位点特异性相对同位素丰度。所得数据能够清楚地区分角鲨烯与鱼肝油、橄榄油和合成来源。最近，Bejjani及其同事使用绝热再聚焦INEPT技术分析了多种动物来源的胆固醇样本[46]。在那份报告中，他们成功地使用PCA确定了不同鸡卵来源和养殖类型的胆固醇来源。在另一份报告中，优化的高分辨质谱（HSQC）数据被用于分析奶酪样本中的胆固醇，但未得出关于不同奶酪样本来源的具体结论[47]。与需要复杂脉冲序列的替代NMR实验相比，这种简化的实验设计更符合制定符合联邦监管政策的方法的实际应用需求。此处采用的直接13C NMR方法优先考虑了可重复性和易于实施的特点，使其更适合常规和监管应用。

**2 实验**

**2.1 样品**

本研究分析了九份动物来源胆固醇（MilliporeSigma Inc.）、八份植物来源胆固醇（ChemHub）和八份半合成形式的胆固醇（图1），该半合成形式由Chem Dynamics Inc.从植物来源胆固醇中间体合成。

**2.2 胆固醇样本1–4的HRMS分析**

所有样本均溶解在MS级的2:1 CHCl3:MeOH溶液中，并通过在同一溶剂中连续稀释至最终浓度0.01 mg/mL。质谱分析使用Waters Xevo G2-XS QToF质谱仪与Waters I-Class Acquity UPLC系统联用进行。注射体积为3 μL，色谱柱为Waters Acquity BEH C18 MS柱（内径2.1 × 50 mm；颗粒大小S-1.7 μm；部件编号186002350；系列编号0457340222514），检测波长为214和238 nm。所有溶剂均为LC–MS级（Honeywell）。色谱分离的流速为0.45 mL/min，溶剂A的组成为50:50 (v/v) H2O:MeOH（添加0.1%甲酸和10 mM醋酸铵），溶剂B的组成为80:20 (v/v) IPA:MeOH（添加0.1%甲酸和10 mM醋酸铵）。分离过程遵循Chandramouli和Kamat的方法[48]。简而言之，30分钟的梯度洗脱包括以下步骤：0–4 min，40%溶剂B；4–6 min，40%–60%溶剂B；6–16 min，60%–100%溶剂B；16–22 min，100%–40%溶剂B；最后6 min恢复初始条件。样品和色谱柱分别保持在10°C和40°C。质谱采集采用正离子模式的电喷雾离子化源。使用甲酸钠在100.00至1800.00 amu范围内校准仪器，Leu-Enkaphalin作为正离子模式下的内标质量，m/z = 556.2771 amu。采用Waters MSE采集模式，功能1不使用碰撞能量进行全扫描（MS1），功能2根据分析物大小使用从35到45 V的高碰撞能量进行扫描（MS2）。

**2.3 NMR光谱**

NMR样品在5-mm NMR管（Norrell Inc.）中制备，将200 mg的动物来源、植物来源或半合成胆固醇溶解在600 μL的99.9% CDCl3（Cambridge Isotope Laboratories Inc.）中。NMR数据在Bruker Biospin 600-MHz AV-III系列数字NMR仪上记录，配备5-mm TXI逆向探头，温度为298 K。以下实验用于样品分析：1D 1H NMR数据采集32次扫描；扫描宽度（SW）= 12,000 Hz；氧核屏蔽（o1p）= 6.175 ppm；松弛延迟（relaxation delay）= 1.0 s。1D 13C数据采集采用逆向门控解耦，抑制核氧交换（NOE），共512次扫描；扫描宽度（SW）= 36231.9；氧核屏蔽（o2p）= 70 ppm；采集时间（acquisition time）= 904.4 ms；WALTZ-16用于异核解耦，功率水平为4.5 W[30]。由于该方法开发时无需专门的解耦序列，因此未进一步进行参数优化，以兼容常规NMR仪器。通过使用逆向检测线圈将1H线圈置于样品附近，从而提高了13C的信噪比（SNR）。数据使用2-Hz的LB进行校正，并用三阶多项式函数进行基线校正。所有样品均使用个性化的积分区域（详见支持信息），积分过程中未进行偏置校正。由于所有样品的13C共振峰重叠一致，因此未对13C信号进行去卷积处理，从而允许进行可靠的比较分析而不会引入模型依赖的偏差。每个样品采集四个重复样本进行积分和统计分析。每个重复样本的1D 13C数据采集总共需要约5小时。所有NMR数据处理和化学位移预测均在MestReNova版本14.2.3-29241中进行。

**2.4 统计方法**

多变量统计分析使用Solo版本9.5（Eigenvector Research Inc.）和Matlab版本9.9.0.2037887（R2020b）更新8进行。使用动物来源和植物来源胆固醇的相对同位素分数生成正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）模型。由于在NMR处理过程中进行了相对同位素分数的先验归一化，数据仅进行了自动缩放。交叉验证采用Venetian blinds方法，每次盲法测试排除13%的数据。半合成胆固醇的相对同位素分数被应用于OPLS-DA模型作为测试集，以确定模型的预测准确性。

**3 结果与讨论**

我们对植物来源和动物来源胆固醇的分析首先使用IRMS进行。根据提供的样品，质谱得到的同位素丰度分析可以区分动物来源、植物来源和半合成来源的胆固醇。半合成胆固醇含有22个碳的植物来源成分，与植物来源胆固醇标准更为相似（图2）。然而，较大的变异性阻碍了统计上的显著区分。随后进行了irm-13C NMR分析，以提供这些样品来源的额外确认证据。

**图2** 动物来源、植物来源和半合成胆固醇的相对同位素分数比较，通过比较含有（A）零个、（B）一个和（C）两个13C原子的胆固醇分子的数量来区分三种来源。（D）IRMS得到的含有胆固醇的13C的代表性同位素包络图。从左到右分别标出了含有零个、一个和两个13C原子的特征。质量和离子计数按照Chandramouli和Kamat的方法[48]进行测量。尽管13C的特定同位素插入变化通常小于40‰（40千分之一），而2H的插入变化超过500‰（500千分之一），但irm-13C NMR作为直接比较单次实验中不同分子位置同位素含量的方法优于2H[30]。此外，13C在天然丰度和整体灵敏度上远高于氘，因此需要更少的样品和更短的分析时间。然而，与2H不同，13C不是四极的，因此在松弛延迟和数据采集过程中必须注意增加的松弛时间和由核氧交换（heteronuclear NOE）引起的复杂性[24, 49, 50]。从相对角度来看，位点特异性丰度通常远小于2H[49]，可以通过标记在位置i的13C同位素体的摩尔分数fi来计算。实际的相对摩尔分数fi可以根据单标记同位素体的信号面积Si来确定[23]：

通过上述方程计算摩尔分数fi可以有效地评估同位素体的相对丰度，假设13C测量的精度为千分之一（permil）。出于认证目的，由于没有严格的真实性要求，摩尔分数谱可以作为一个同位素指纹使用[26]。此外，在存在重叠或分子简并的情况下，为了获得有效的结果，并不需要测量所研究分子所有位置的同位素含量。如图3所示，通过分析胆固醇中每个特定碳原子的13C相对摩尔分数特征，可以清晰地区分植物来源和动物来源的材料。图3（在图查看器中打开）

(A) 动物来源和植物来源胆固醇的相对同位素分数比较，显示出27个碳原子中有11个碳原子在两组样本之间存在明显差异。(B) 分别位于42.0 ppm和31.8 ppm的四个等时碳原子。加入半合成植物来源的胆固醇样本后，发现有一部分碳原子的值在植物来源和半合成样本中显示出一致且可重复的差异，与动物来源的胆固醇形成对比（图4）。与初始分析相比，当11个碳原子在植物来源和动物来源的胆固醇之间显示出明显分离时，加入额外的植物样本后，这11个位点中有8个碳原子在两个植物数据集之间仍然保持高度一致，显示出与动物样本的显著差异。在这些位置上，半合成胆固醇与原始植物材料的值更为接近，证明了植物来源胆固醇的同位素差异并非特定于某个样本的异常现象。因此，这8个碳原子是最可靠的标志物，可用于区分植物来源和动物来源的胆固醇。图4（在图查看器中打开）

(A) 动物来源、植物来源和半合成胆固醇的相对同位素分数比较，表明植物来源和半合成材料与动物来源的材料存在明显差异。为了清晰起见，半合成样本的误差条被省略了，但可以在支持信息中查看。(B) 分别位于42.0 ppm和31.8 ppm的四个等时碳原子。利用植物来源和动物来源胆固醇的相对同位素分数，生成了一个交叉验证的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型（图5）。使用半合成胆固醇的相对同位素分数作为测试集，该模型将所有八个样本正确分类为植物来源的胆固醇，交叉验证的类别错误率为0%。这一结果证实了irm-13C核磁共振技术能够准确区分动物来源和植物来源的胆固醇，并能够准确判断未知来源的胆固醇的真正来源。图5（在图查看器中打开）

正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）对动物来源、植物来源和半合成胆固醇的13C核磁共振数据进行了分析。(A) 动物来源胆固醇的OPLS-DA模型用红色表示，植物来源胆固醇用绿色表示（样本量分别为9个和8个），阴影区域代表每个类别的95%置信区间。该模型使用Venetian blinds方法进行了交叉验证（每次随机排除13%的数据），交叉验证的类别错误平均率为0%。(B) 使用OPLS-DA模型对半合成胆固醇样本进行类别预测（见图A）。测试样本用蓝色表示（样本量为8个），所有半合成样本均被正确分类为主要来自植物来源的胆固醇。

4 结论

应用红外质谱（IRMS）和irm-13C核磁共振技术提供了一种稳健且可重复的方法，用于区分植物来源、动物来源和半合成来源的胆固醇。IRMS获得的整体同位素测量结果揭示了不同胆固醇来源之间的13C掺入量存在可测量的差异，而irm-13C核磁共振技术则能够更深入地研究特定位置的同位素组成，从而得到直接反映生物合成起源的独特分子指纹。在植物来源、动物来源和半合成来源的胆固醇样本中保守的8个特定碳原子位置，是最容易受到不同生化和酶促过程引起的微小同位素差异影响的碳原子。尽管特定位置的13C测量的定量限受到逆探针配置灵敏度降低的影响（如在TXI探针中观察到的那样），但本研究中使用的样本量足以保证分类的准确性，没有限制该方法的适用性。多变量分析进一步证实了这些发现，OPLS-DA模型能够完全区分动物来源和植物来源的胆固醇，并正确地将半合成胆固醇分类为主要来自植物来源的胆固醇。利用植物来源和动物来源胆固醇中13C分布的差异，该方法非常适合用于化妆品、营养保健品和药品领域的法规遵从性、质量控制和防伪，因为在这些领域中验证成分来源变得越来越重要。

作者贡献

Anika M. Singh：概念化、撰写初稿、方法论设计、实验研究。Subir Chakraborty：概念化、监督、资金获取。Remington X. Poulin：概念化、撰写初稿、审稿和编辑、资金获取、方法论设计、实验研究、监督、软件使用。R. Thomas Williamson：概念化、撰写初稿、监督、实验研究、方法论设计、项目管理、审稿和编辑、资源协调、资金获取、软件使用。

致谢

感谢NSF资助项目编号#0821552和2116395对用于本研究的NMR光谱仪的采购。此外，Yousry和Linda Sayed基金也提供了资金支持。作者还感谢UNCW研究与创新基金对仪器的支持。

利益冲突

Subir Chakraborty声明他是Chemo Dynamics公司的首席执行官。其他作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究发现的NMR数据和分配信息可在本文的支持信息中找到，文件名为“NMR and MS data for model_01262026”和“Plant vs Animal Cholesterol_supporting information_01262026”。如需获取本研究生成的原始13C NMR数据，可联系相应的作者。