精准无误：基于激光微加工技术的方法用于改进干燥基质的点状制备，并通过环境电离质谱法进行了原理验证分析演示 作者：Daniel O. Reddy, Malek Hassan, Jonathan O. Graham, Jared Viggers, Katherine E. Williams, Randy E. Ellis, Thomas R. Covey, Jacob T. Shelley, Richard D. Oleschuk

《Micromachines》：Spot on: A Laser Micromachining-Based Approach to Improve Dried Matrix Spot Preparation with Proof-of-Principle Analytical Demonstrations Using Ambient Ionization Mass Spectrometry Daniel O. Reddy, Malek Hassan, Jonathan O. Graham, Jared Viggers, Katherine E. Williams, Randy E. Ellis, Thomas R. Covey, Jacob T. Shelley and Richard D. Oleschuk

　　摘要：随着环境电离质谱方法的应用日益广泛和受到普遍青睐，干基质点（DMSs）作为一种有用的样品存储技术和分析平台重新受到重视。然而，精确控制液体限制和样品定位仍存在挑战。在本文中，我们提出了一种基于激光微加工的方法，在疏水性纸基底上制备带有可视化识别元素（即光栅）的DMSs，这些元素围绕表面能陷阱（SETs）分布。这种定位的DMS基底与直接质谱分析相结合，具体包括液体微接点-表面采样探针-质谱（LMJ-SSP-MS）和流动大气压余辉-质谱（FAPA-MS）技术。通过激光微加工方法，可以在直径小至0.55毫米的SETs上制备出带有十字线的DMSs，与传统DMS制备方法相比，其尺寸缩小了大约12倍。使用LMJ-SSP-MS和FAPA-MS分别在模拟水溶液和人工尿液溶液中检测到了这种DMSs上的咖啡因。进一步改进后，该方法可以通过计算机视觉和机器人技术实现自动化，从而扩大DMSs的应用范围并优化分析工作流程。

1. 引言
干基质点（DMSs），也称为干样品点（D(S)Ss），作为一种临床上有用的采样工具，在环境科学、毒理学等多个领域逐渐受到关注，并最终成为样品制备/存储技术。虽然DMS技术不要求液体样品必须是生物来源的，但最常见的应用包括生物液体或生物流体，如血液（干血点（DBSs）[17,18,19]、唾液（干唾液点（DSSs），有时缩写为DSaSs[20]以避免与干样品点（DSSs）[21,22,23]混淆]以及尿液（干尿点（DUSs）[24,25,26]。DMS技术的核心是将液体样品施加到存储基底上，通常使用滤纸作为基底。当液体样品在一定时间内根据环境条件和液体类型/体积干燥后，即认为DMS制备成功完成；这一点通常通过移液或直接将基底接触待采样液体来完成。尽管有完全自动化的DMS方法报道[24,31,32,36,37]，但这种自动化主要针对DMS制备后的工作流程（即DMS处理和分析步骤），而不是将液体施加到基底上的步骤本身（尽管考虑到小体积和粘度等问题，这种区分是可以理解的，尤其是对于像血液这样“具有挑战性”的液体[38,39]）。

尽管DMSs在应用范围和分析物定量方面取得了显著进展[6,43,44]，但仍需进一步努力以促进其作为通用样品制备和存储方法的更广泛应用。在DMSs的分析方面，已有许多经过临床验证的方法适用于各种生物流体和分析物组合（例如，含有N[(3R-1-Azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl]furo[2,3]pyridine-5-carboxamide]的人工脑脊液[7]、含有卡马西平的唾液[45]以及含有微量元素的血清[46]）。这些方法通常依赖于液相色谱-质谱/(质谱)（LC-MS/(MS)分析[47]，这被认为是定量DMS分析的金标准[48,49]，尽管也有其他分析技术用于定性[14,49]和（半）定量[50,51]分析DMSs。总的来说，这些分析发展对DMS的进步和临床应用至关重要。然而，DMS的一个常被忽视的方面是其两个核心组成部分之一——纸基底[20]。尽管已有许多研究致力于增强和理解作为DMS制备、处理和分析基础的底物的性能，例如涂有二氧化硅或其他功能化处理的纸[52,53,54,55]、商业产品的比较[56,57]以及液体流动的基本分析[58,59,60,61,62]。尽管纸是一种理想且知名的DMS基底，尤其是考虑到其低成本和可持续性[63,64,65,66]，但由于其固有性质（如液体样品的横向和纵向扩散[3,67,68]），纸作为DMS基底仍存在某些挑战。样品扩散及其相关问题在DMSs中是众所周知的[57,69,70,71]。不过，有时样品扩散并不一定构成问题，或者可以通过某些方法减轻这些问题，例如样品不均匀性和由此引起的分析物损失。例如，在典型的DMS工作流程中，液体样品被施加到基底上并通过毛细作用扩散；之后可以储存DMS以备后续处理，然后从DMS上打孔并提取样本。通过这种工作流程，尽管点的不均匀性和孔位置的可重复性不理想，但消化步骤的接近完整性通常可以弥补这些缺点。此外，也有研究试图在干燥过程中更好地限制液体样品。例如，Baillargeon等人（2022年）提出了一种带有四个均匀点的图案化DBS卡片，每个点（直径约6毫米）可以容纳约10微升血液[72]。Kim等人（2013年）使用商用等离子提取卡片（NoviPlex）制备用于质谱分析的干血浆点[73]；该卡片用于从约25微升全血中分离和收集约2.5微升血浆。最终，血浆浓缩成6.35毫米的圆盘进行提取和分析。

总体而言，DMSs是样品制备和分析工具包中的重要组成部分。因此，在本文中，我们提出了一种基于激光微加工的双湿润纸基底，该基底具有精细至0.55毫米的微流控特征——即表面能陷阱（SETs），以解决传统DMS基底面临的可视化定位和样品扩散问题。简而言之，SETs是表面能高于周围区域的精确定义区域[74,75,76]。本文提供了一种可适应的激光微加工方法，在SET周围制备可视化元素，以便于DMS的制备。特别是在纸基底上的无色样品情况下，SETs可能难以可视化，从而难以沉积样品。这些带有辅助可视化的光栅元素的SETs可以捕获并限制液滴在基底上的表面扩散（即抵抗横向和纵向扩散）。结合材料表征，我们通过使用两种环境电离质谱技术（1）液体微接点-表面采样探针质谱（LMJ-SSP-MS）和（2）流动大气压余辉-质谱（FAPA-MS）展示了基底的有效性。需要注意的是，本文侧重于DMS基底设计和功能的改进以及分析兼容性验证，而非全面的定量（生物）分析验证。

2. 材料与方法
使用了Fisher Scientific滤纸（直径150毫米，Cytiva Whatman? Qualitative Grade Plain Circles–Grades 1和3）（加拿大安大略省渥太华）。Aculon? A和AL-A从Aculon, Inc.（美国加利福尼亚州圣地亚哥）购买，蓝色、绿色、红色和黄色的食用色素溶液（Club House品牌）从当地杂货店购买。去离子水（DI H2O）（>18.2 MΩ cm）使用Sartorius Stedim Biotech Arium? pro DI水系统（德国哥廷根）制备，Fisher Chemical甲醇（MeOH）[HPLC等级，加拿大安大略省渥太华]也用于实验。Merck KGaA甲酸（FA）（LiChropure?，98–100%适用于HPLC）（德国达姆施塔特）也被使用。ACROS Organics罗丹明6G（R6G）（99%，纯度）以及Sigma-Aldrich? Allura Red AC（染料含量80%）和咖啡因（粉末，ReagentPlus）（美国密苏里州圣路易斯）也被使用。Aldrich Indigo（悬浮液，稀释）（美国密苏里州圣路易斯）和Sigma Nile Blue（C.I. 51180；Basic Blue 12）氯化物（染料含量约90%）（美国密苏里州圣路易斯）也被使用。Pickering Laboratories人工尿液（稳定型）（美国加利福尼亚州山景城）和Ward’s Science人工尿液（实验室级）（加拿大安大略省圣凯瑟琳斯）也被使用。从不同商业来源购买了直径1.75毫米的PETG 3D打印机丝材，并使用了Prusa Research 3D打印机（Original Mini/i3）。DataPhysics Instruments GmbH（德国菲尔德施塔特）的光学接触角测量仪（OCA 15 Pro）用于测量水接触角（WCA），Oxford Lasers Ltd.（英国牛津郡）的A系列皮秒紧凑型激光微加工系统用于切割纸基底以及制备光栅和SETs。光学显微镜图像使用Keyence VHX 7000光学显微镜（美国伊塔斯卡）获取。视频S1–S3使用Vision Research Phantom v2512高速相机（美国新泽西州韦恩）拍摄，拍摄速度为每秒30,000帧（fps）；Phantom配备Tokina AT-X PRO MACRO 100 F2.8 D镜头。视频播放速度显示为30 fps。对于LMJ-SSP-MS设置，使用了Sciex 4500三重四极杆质谱仪（加拿大安大略省康科德），并在正离子模式下操作，使用Component Supply Company 304 SS Hypo Tube 30G薄壁电极和Molex Polymicro熔融石英毛细管（部件编号1068150026）；载液比例为94.9:5.0:0.1 MeOH:DI H2O:FA。关于LMJ-SSP-MS[77,78,79]，探针由两个同心管组成，溶剂或溶剂混合物被泵入其中；这种设置有助于形成连续流动的液滴，可以接触表面。通过这种液滴-表面接触，表面被采样，分析物:溶剂混合物通过文丘里效应和质谱相关的压力降/真空被输送到质谱的离子化源[80]。LMJ-SSP-MS的采样时间为2.5秒，使用正离子模式下的多反应监测（MRM）进行咖啡因分析，Q1的质量电荷比（m/z）设置为194.9 m/z，Q3的质量电荷比分别设置为138.0和110.0 m/z。其他质谱参数包括碰撞气体5磅/平方英寸（psi）、帘幕气体20 psi和离子源温度300°C。对于FAPA-MS设置，使用了Prosolia Inc.的可调支架来安装和控制FAPA源，FAPA源连接到Thermo Q Exactive? Orbitrap MS（德国不来梅）。简而言之，FAPA-MS利用等离子体产生的加热/热氦气/试剂离子流（即余辉）使分析物从表面脱附/离子化到质谱离子化源[81,82,83]。为了与定制的源支架兼容，DMS使用双面胶带粘附在疏水涂层玻璃载玻片上并放入样品架中。FAPA的电流设置为30 mA，氦气流速为2.50 L/min。Q Exactive MS在正离子模式下使用单离子监测（SIM）操作，m/z = 195，咖啡因的质荷比确定为195.086。其他orbitrap参数包括分辨率设置为140,000和进样毛细管温度320°C。

3. 结果与讨论
改进DMS基底的第一步是使滤纸基底疏水化。为了使这一过程更加普及，选择了一种易于应用和涂覆的疏水化配方——即Aculon?。这种特定的疏水化处理包括简单的两步涂覆过程：首先涂覆底涂层Aculon? AL-A，然后涂覆顶涂层Aculon? A。在应用过程中，将纸基底完全浸入Aculon? AL-A小瓶中，密封后进行五分钟超声处理，取出后空气干燥约二十分钟。干燥后，再将基底完全浸入Aculon? A小瓶中，密封并超声处理五分钟，取出后空气干燥约两分钟。注意，Aculon? AL-A基于甲醇，而Aculon? A基于丙酮，因此干燥时间有所不同。为了更好地理解涂层过程，论文将纸张浸入两种不同的涂层溶液中，不同时间不进行超声处理，如图1所示。例如，在图1a中，纸张基底迅速浸入Aculon? AL-A溶液的小瓶中，立即取出并风干。使用Aculon? A溶液对基底重复相同的处理过程。图1显示了不同涂层时间对液滴接触角（WCA）的影响：(a) WCA ≈ 145.1° ± 3.3° (n = 5)，(b) WCA ≈ 145.8° ± 2.5° (n = 5)，(c) WCA ≈ 145.7° ± 1.6° (n = 5)，(d) WCA ≈ 145.6° ± 3.6° (n = 5)，(e) WCA ≈ 145.7° ± 1.9° (n = 5)，以及(f) WCA ≈ 146.9° ± 3.3° (n = 5)。如图1所示，Aculon?涂层能迅速使基底变得疏水，通过瞬时涂层获得的WCA与将基底浸泡在Aculon?溶液中长达30分钟所获得的WCA几乎相同。需要注意的是，基底的设计意图是表面液体捕获和干燥。因此，Aculon?涂层必须充分渗透并覆盖多孔纸张基底，而不仅仅是施加一层表面涂层，特别是因为最终的基底将承载一个激光微加工的SET，液滴将被施加到SET上，然后被限制并干燥以用于存储/采样。

为了评估涂层在滤纸中的渗透效果，在涂覆后的纸张基底上激光微加工了一个SET。如果基底按预期工作，液体应该主要在SET内干燥，即使不是完全干燥，也就是说，最大限度地抵抗横向和纵向扩散。然而，在激光微加工后，很难甚至不可能在纸张基底上看到SET以沉积有色液滴（见图S1）。因此，需要在SET周围添加视觉识别或定位元素。考虑到激光微加工系统的可实现精度（约50微米[75]），准备了一个用于定位元素的测试设计（见图2）。这些不同的微加工图案可以轻松地在OnShape等商业软件中绘制、修改，并导入激光微加工软件（AlphaCAM 2013 R2版本12.5.0.160/Oxford Lasers XY Profiling 291013 AFIT Post Processor/Cimita版本4.0.21.0）中。选择Whatman Grade 3 (WG3)滤纸而不是Whatman Grade 1 (WG1)滤纸，是因为WG3的厚度更大，孔径更小[84]，特别是考虑到目的是最小化基底内的液体流动。相关研究表明，WG3更适合在SET周围进行更精细的激光微加工设计（见图S2）。

通过这些液滴沉积和润湿的实验，发现疏水涂层确实起到了作用，尽管效果不是最佳的，如图2b中的插图所示，绿色染料扩散到了激光微加工边界之外，这很可能是由于液体通过纸张纤维扩散和渗透所致。作为下一步，评估了用于制备SET的主要激光微加工参数——即激光功率（见视频S5）和速度（见视频S6）。需要注意的是，较低的激光功率可以增强表面改性效果。具体来说，增强的表面改性意味着SET尽可能减少液滴的横向或纵向扩散。较低的激光功率可以减少表面损伤，从而降低横向和/或纵向扩散的可能性，并减少对激光源的能量需求。此外，较高的激光写入速度有助于减少使用激光的时间（即能量消耗和磨损），以及准备基底的时间，这对于扩大生产规模具有重要意义。评估表明，过高的激光功率会对SET的功能产生不利影响；在50%的激光功率下，液体会渗透到基底中。为了更好地描述激光的影响，使用8%、25%和50%的激光功率制备的SET获得了光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）图像（见图S3和S4）。光学显微镜和SEM图像显示，激光功率的增加会逐渐损坏基底。此外，这些图像还显示材料烧蚀加剧，因为随着激光功率的增加，SET的圆形边界变得更加明显，SET中心的损伤也更大。在50%的激光功率下，足够的材料被烧蚀，可以使用Keyence VHX-7000数字显微镜的内置3D深度测量功能观察到激光微加工形成的深度（见图S5）。SEM图像进一步显示，激光产生了微结构；激光烧蚀材料，导致疏水涂层被去除，纤维素纤维受损并重新暴露。由于SET变得湿润（即亲水性改变），并且能够保留液滴，这些发现证实了激光在物理化学上改变了表面。

此外，过高的激光写入速度也不利于保持SET（圆形）的几何形状/均匀性。总体而言，如果激光功率和速度过高，SET无法最大程度地保持液体在圆形边界内。尽管如此，在这个阶段，确定了以下优选条件：(1) Aculon? AL-A涂层时间五分钟并超声处理，干燥时间二十分钟；(2) Aculon? A涂层时间五分钟并超声处理，干燥时间两分钟；(3) 使用激光参数（功率8%（约2.7毫瓦）、速度1.50毫米/秒、间距15微米）对SET进行激光微加工。通过测量接触角（WCAs）来评估这些不同准备阶段的基底（见图S6）。使用改进的涂层工艺，完全涂覆的WG3滤纸显示1微升去离子水（DI H2O）的WCA约为138.9° ± 0.8°（n = 3），表明疏水化成功。然后，在将1微升去离子水滴沉积到激光微加工的SET上后，液滴的WCA约为150.3° ± 1.8°（n = 3），表明激光改变了表面纹理并增加了WCA，这与Cassie–Baxter润湿模型一致，这一点得到了图S3中呈现的激光诱导微结构的支持[86,87]。

鉴于功能性的定位SET设计，我们评估了收紧SET周围的十字线以进一步限制液体流动的效果（见图3）。图3显示了绿色染料（直径0.55毫米）SET周围收紧的十字线设计。(a)显示了带有收紧十字线的完整绿色染料SET。(b)显示了SET的放大视图。图(b)中的虚线圆圈近似表示理想的SET边界。虽然SET将液体很好地限制在大约0.50毫米直径的区域内，但仍有一些液体在期望区域之外扩散/渗透。为了确定这种扩散/渗透是由于可视化剂还是激光微加工方法引起的，我们使用了不同的着色剂（见图4）。图4显示了粉色染料（直径0.55毫米）SET周围收紧的十字线设计，其中染料为罗丹明6G。(a)显示了带有收紧十字线的完整粉色染料SET。(b)显示了SET的放大视图。如图4所示，SET的功能取决于分析物的相对疏水性。虽然绿色食品染料溶液的油性促进了某种程度的扩散/渗透，尤其是由于其中含有丙二醇（PG）（logP范围约为{-1.1, ?0.8}），但使用罗丹明6G（R6G）（logP范围约为{5.1, 7.2}）作为可视化剂时也会出现渗漏，这可能是由于R6G的两亲性[89]，这对于未来可能使用这种基于纸张的SET进行液体采样的工作是一个重要考虑因素。因此，测试了一种相对更亲水的水溶性染料溶液——Allura Red（logP范围约为{-1.3, ?0.4}（见图5）。图5显示了红色染料（直径0.55毫米）SET周围收紧的十字线设计。(a)显示了带有收紧十字线的完整红色染料SET。(b)显示了SET的放大视图。如图5所示，Allura Red溶液在SET上的表现优于R6G溶液和绿色食品染料溶液。尽管如此，SET外部仍然有可观察到的扩散/渗透现象。再次利用激光的精度，通过增加额外的扩散/渗透路径来物理限制液体流动；改进的定位SET设计包括位于十字线之间的弯曲拱形结构（见图6）。图6显示了红色染料（直径0.55毫米）SET周围收紧的十字线设计，其中染料为Allura Red。(a)是从上方使用光学显微镜观察到的带收紧十字线的完整红色染料SET。(b)显示了SET的放大视图。顶部面板（“俯视图”）是从上方使用光学显微镜观察到的染料SET的正面。(a)显示了带有收紧十字线的完整红色染料SET。(b)显示了SET的放大视图。底部面板（“仰视图”）是从上方使用光学显微镜观察到的染料SET的背面。(a)显示了带有收紧十字线的完整红色染料SET的背面。(b)显示了SET背面的放大视图。虽然引入拱形结构改善了液体在SET内的捕获效果，但仍有一些可去除的区域，以进一步限制液体在SET边界内的流动。因此，使用激光微加工系统去除了三个额外的矩形区域（见图7）。需要注意的是，随着额外区域的去除，SET的粘附性会减弱；即结构稳定性降低。图7显示了红色染料（直径0.55毫米）SET周围收紧的十字线设计，其中(a)是使用光学显微镜从上方观察到的染料SET的正面，(b)是使用光学显微镜从上方观察到的染料SET的背面。如图7所示，额外的矩形切除显著改善了液体在SET内的保留效果，这可能是由于(1)减少了液体可以扩散/渗透出的纸张纤维/孔隙数量，以及(2)涂层可以更好地渗透到激光微加工区域的入口增加。重要的是，SET的背面没有观察到红色染色，表明液体仅被限制在表面。

为了更好地描述改进的十字线设计对减少SET外部扩散的效果，通过比较初始收紧十字线设计（见图3、图4和图5）和最终改进十字线设计（见图7）中的扩散情况，量化了每种染料的渗漏距离。具体来说，对于这两种设计中的每一种，使用Fiji/ImageJ 1.54p版本，从SET的中心到SET的边缘画了一条线，并测量了这段距离。然后，从同一个中心向SET外的三个外部点各画了一条线，这些点是特定染料扩散得最远的可观察距离（见图S8）。将SET的半径（参考距离）从每个点的扩散距离中减去，得到平均值。如表1所示，改进的十字线设计显著提高了所有三种测试染料的液体限制效果。为了进一步评估这种基底的能力，还测试了几种额外的着色剂（见图S9和表S1）。从这些额外的测试中可以明显看出，溶液的油性（而不是染料化合物的油性）对SET的功能影响更大。特别是对于食用色素染料，当使用1 μL的稀释食用色素溶液（大约1滴食用色素溶解在20 mL的DI H2O中）时，SET的表现优于使用1 μL纯食用色素时。因此，溶质-溶剂组合是使用该基底时的一个重要考虑因素。对于这种涂层-基底组合，水性溶液表现最佳。表1显示了在初步设计和改进设计中三种染料的SET扩散距离的评估结果。由于靶向SET表现良好，我们展示了将SET与AIMS技术结合使用的方法，具体包括两种AIMS技术：（1）LMJ-SSP-MS（基于溶剂的提取/脱附）和（2）FAPA-MS（基于等离子体的提取/脱附）。对于这两种技术，纸张基底应尽可能平坦以确保均匀采样；然而纸张本身并不均匀。为了辅助LMJ-SSP-MS的采样过程，我们设计并3D打印了一个保持表面平坦的采样支架（见图8、图S10和S11以及文件S1和S2）。图8展示了用于LMJ-SSP-MS采样的3D打印纸张基底的示意图和演示。（a）显示了组件的顺序放置，包括一个3D打印的底座、一个疏水涂层的玻璃片以提高平坦度并防止液体微接头接触3D打印的底座和纸张基底，以及一个顶部外壳来封闭支架并保持平坦度/刚性。（b）展示了在支架上滴有Allura Red溶液的纸张基底，以便观察支架中的SETs。将样品放置在支架中后，在纸张基底上沉积了1 μL浓度为1 ppm的咖啡因和100 ppm的Allura Red。滴液在室温条件下干燥，大约需要10分钟（见图S12）。然后使用LMJ-SSP-MS对DMSs进行采样。虽然需要注意不同3D打印材料与（有机）溶剂之间的兼容性，但由于LMJ-SSP除了接触纸张基底外不与其他任何物质接触，因此3D打印机丝材与溶剂的兼容性不是主要问题。此外，为了防止LMJ-SSP中的溶剂渗透到纸张基底并接触到下面的3D打印材料，在纸张基底和3D打印材料之间放置了一个疏水玻璃片。LMJ-SSP由一个改进的3D打印机底盘支撑和控制，实现了自动化采样[90]。随后对DMSs进行了采样，结果表明基底/SETs适用于表面分析（见图9和视频S7）。图9显示，使用LMJ-SSP-MS对DMSs进行采样时，结果非常明显，因为在靶向SET上制备的DMSs产生的信号明显高于在疏水滤纸上制备的DMSs（即没有SET的DMSs）。需要注意的是，在图9中，“Aculon Glass”代表疏水涂层的玻璃片[9%相对标准偏差（RSD），“SET Glass”代表在疏水涂层玻璃上制备的SET（12% RSD），“Aculon Paper”代表疏水涂层滤纸（10% RSD），“SET Paper”代表在疏水涂层滤纸上制备的SET（5% RSD）。“AUC”表示“曲线下面积”。这一发现表明，靶向SET的制备方式能够有效限制液滴的移动，同时避免过度横向扩散。图9进一步说明了纸张作为理想的DMS基底的优势，不仅因为纸张作为微流控基底的可持续性考虑[63,91,92]，还因为靶向SETs提供的信号强度高于玻璃基底。已知玻璃基底会导致分析物回收率/信号减弱；在这种情况下，这种效应可能是由于咖啡因在玻璃表面的结晶[93,94,95,96]。尽管带有和不带有靶向SET的疏水涂层纸张的性能相当，但SETs对于将液滴限制在明确的基底区域内至关重要，尤其是当溶液无色时。有趣的是，这项演示表明，表面疏水处理提高了LMJ-SSP从纸张上脱附分析物的能力（降低了%-RSD），这与我们之前的工作相比有所不同，在之前的工作中，未经处理的纸张是使用LMJ-SSP-MS分析时较为困难的基底之一[97]。最后，这个实验强调了疏水处理、SETs和十字线对于表面采样的重要性。如果没有改进的SETs，使用裸露的玻璃或纸张作为基底无法获得可靠的信号，尤其是考虑到样本点可视化的挑战。通过将0.625至5 ppm的咖啡因标准溶液（1 μL）滴在改进的SETs上，让其干燥后，再使用LMJ-SSP进行采样，制备了一条校准曲线（见图10）。通过线性回归得到校准曲线的截距标准误差，计算出检测限（LOD）为0.013 ppm（13 ppb），定量限（LOQ）为0.041 ppm（41 ppb）。为了展示LMJ-SSP方法的全面性，我们进行了一个实验，其中LMJ-SSP对同一DMS进行了二十五次采样（见图S13）。如图S13所示，1 μL浓度为1.25 ppm的咖啡因水溶液产生的DMS信号中，大约30.4%与第一次采样相关，随后依次减少到25.4%、15.6%，直到二十五次采样后DMS的信号几乎消失。也就是说，在最初的LMJ-SSP采样之后，信号仍然存在。图10显示了使用干燥后的咖啡因标准溶液点制备的标准曲线（n = 5）。为了评估基质效应，将干燥的人工尿液（1 μL浓度为1.25 ppm的咖啡因溶液）的平均AUC除以干燥的水溶性咖啡因（1 μL浓度为1.25 ppm的咖啡因溶液）的平均AUC，结果约为51%，表明由于人工尿液基质的影响，咖啡因信号减少了大约49%。因此，在使用这种方法制备和分析复杂基质（如真实生物流体）时，可能需要在滴液沉积到基底之前进行样品清洗（例如固相微萃取）。作为对比，Abady、Jeong和Kwon[98]最近的一项研究使用HPLC-MS/MS对DBS中的小分子心血管药物进行了定量分析，报告的LOD范围从阿托伐他汀的0.1 ppb到普鲁卡因胺的100 ppb，LOQ范围从阿托伐他汀的0.5 ppb到普鲁卡因胺的500 ppb。在另一项使用干燥口腔液滴的研究[99]中，Gorziza等人使用LC-MS/MS方法报告了几种滥用药物的LOQ，范围从安非他明的0.2 ppb到氯胺酮的500 ppb。在最后一个例子中，Moretti等人使用LC-MS/MS分析了DUS中的大麻素及其代谢物，报告的LOD范围从大麻二酚的0.3 ppb到11-羟基-δ-9-四氢大麻酚的1.9 ppb，LOQ为10 ppb[100]。因此，LOD/LOQ会因分析物-基质组合的不同而有所不同。总体而言，我们在这里报告的方法显示出潜力，尤其是在进一步改进后，特别是由于这种新型基底与环境MS结合使用不需要色谱步骤。重要的是，更广泛的方法适用性需要针对特定分析物进行测试和开发。例如，已知姜黄素可以与纤维素材料结合[101,102,103]，因此可以想象某些分析物在SET上的表现可能很好，但在使用环境脱附技术干燥后可能难以从基底上分离出来。为了补充基于液滴的LMJ-SSP-MS方法，我们还初步评估了基于等离子体的FAPA-MS方法。在这个演示中，将DMS放入FAPA源座的样品支架中，然后手动将含有DMS的样品支架引导到/进入试剂离子流中，当DMS进入流中时开始采样；采样过程如图S14所示。作为原理验证，我们在人工尿液中制备了100 ppm的咖啡因溶液，并将1 μL（即100纳克）的溶液滴在靶向SET上，然后使用FAPA-MS进行采样（人工尿液的全谱图见图S15）。使用SIM技术成功检测到了咖啡因（见图11）。为了进一步优化改进纸张基底与FAPA-MS的结合，可以实施内部标准、自动采样阶段和/或关闭离子流的机制，以减少采样变异性。作为背景信息，使用FAPA-MS的表面分析已经能够从电子液体样品中定量尼古丁，浓度约为8840 ppm[104]。在另一个例子中，FAPA-MS分析了应用于玻璃纤维滤纸的液体样品中的芳香成分，如法尼醇和patchoulol，分析物含量范围为10至200微克[105]。图11显示了FAPA-MS分析含咖啡因的DUS得到的光谱。4. 结论在本文中，我们提出了一种基于激光微加工的方法来制备改进的DMS基底。重要的是，这种疏水基底使用了靶向SETs，或者说是被十字线/网格包围的SETs，这些十字线/网格增强了涂层/疏水化过程，提高了液滴在SET内的限制/捕获效果，并有助于视觉检测/识别SETs。此外，我们希望通过将相机与自定义的对象检测程序或计算机视觉相结合，利用这些靶向SETs的可视性，实现自动化的、有针对性的采样，以支持进一步推广DMS与ADI-MS结合使用的临床有用采样-分析方法。通过这项原理验证工作，我们展示了我们在DMS基底方面的基本改进，未来的工作将利用这些网格SETs对各种不同的分析物、（生物）流体、基质以及光学和质谱分析技术进行全面的（生物）分析方法验证。补充材料
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- 表S1：可视化试剂估计的对数概率（logP）值范围及液体扩散距离总结
- 图S1：在激光微加工的Whatman Grade 3（WG3）滤纸上制备的表面能陷阱（SETs）上，不同干燥阶段的液滴情况
- 图S2：在Whatman Grade 1滤纸上制备并观察到的SETs
- 图S3：不同激光功率下制备的带有SETs的WG3滤纸的光学显微镜图像
- 图S4：不同激光功率下制备的带有SETs的WG3滤纸的扫描电子显微镜图像
- 图S5：50%激光功率下SET的三维（3D）深度结构
- 图S6：涂层过程中不同阶段的WG3滤纸
- 图S7：带有三个弧形结构和三个矩形切割口的空白/未标记的靶向SET设计
- 图S8：示例说明如何从SET中心绘制参考线（实线），以及从SET中心到三个外部扩散边缘绘制三条“扩散”距离测量线（虚线）
- 图S9：在0.55毫米SETs上使用的不同可视化试剂
- 图S10：
(a) 支架底座的尺寸（长度/宽度，单位：毫米）
(b) 支架底座各部分的高度/厚度
- 图S11：
(a) 支架夹具/顶部的尺寸（长度/宽度，单位：毫米）
(b) 支架夹具/顶部的各部分的高度/厚度
- 图S12：1微升去离子水滴在常温条件下在纸基板上干燥的过程的延时摄影
- 图S13：通过液体微连接—表面采样探针（LMJ-SSP）重复采样后，DMS中咖啡因信号衰减的色谱图
- 图S14：流动大气压余辉（FAPA）采样方法的演示
- 图S15：对1微升未稀释的Pickering实验室人工尿液进行FAPA-MS分析得到的全扫描光谱
- 视频S1：液滴润湿WG1滤纸的过程
- 视频S2：液滴润湿WG3滤纸的过程
- 视频S3：液滴润湿靶向SET的过程
- 视频S4：靶向SET捕获液滴的过程
- 视频S5：不同激光功率下的靶向SET
- 视频S6：不同激光速度下的靶向SET
- 视频S7：LMJ-SSP-MS技术的演示
- 文件S1：DMS支架底座
- 文件S2：DMS支架夹具