使用质谱成像技术对不同洗脱溶剂进行系统评估，以用于分析小分子代谢物

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Systematic assessment of different wash solvents for the analysis of small molecule metabolites using mass spectrometry imaging

　　摘要：清洗协议是一种简单且常用的方法，用于提高质谱成像（MSI）中低丰度或难电离化合物的检测能力。这些清洗程序旨在通过去除干扰代谢物来增强分析物的电离，从而提高目标代谢物的电离效率和检测效果。然而，尽管清洗协议在MSI中得到了广泛使用，但其对小分子代谢物（SMM）的影响尚未进行系统评估。在这项研究中，我们研究了12种不同的水性和有机清洗溶剂，以评估它们对肿瘤组织中SMM信号强度的影响，使用了解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）技术。结果表明，添加清洗步骤是提高目标代谢物检测灵敏度的有效方法，超过90%的检测分析物在经过最佳清洗溶剂处理后显示出灵敏度提升。虽然氯仿在去除脂质方面最为有效，但乙酸乙酯是最通用的溶剂，能够显著提高极性和半极性代谢物（包括氨基酸、核酸化合物、糖类和有机酸）的检测效果。相比之下，基于水的清洗方法虽然增强了脂肪酸和脂质的信号，却去除了亲水性代谢物。本研究强调了根据感兴趣的分子类别调整预处理协议的重要性，并为提高多种代谢物的离子检测灵敏度提供了有针对性的指导。

引言：质谱成像（MSI）是一种越来越受欢迎的技术，能够以空间分辨的方式同时可视化组织样本中的多种内源性（如代谢物、肽、脂质）和外源性分子（如药物）。尽管MSI仪器和方法的灵敏度和质量分辨能力不断提高，但增强复杂基质中低丰度或难电离化合物检测能力的技术仍然非常有必要。对于特定的分子靶标（如药物或某些代谢物），可以使用选择性离子监测（SIM）技术。SIM利用小的质量窗口来监测特定的质荷比（m/z），从而提高低丰度化合物的检测灵敏度[1]。另一种提高目标化合物检测能力的方法是组织内化学衍生化（OTCD）[2]，在这种方法中，目标化合物与另一种分子在组织内发生反应，生成具有更好电离特性的衍生物。衍生后的目标分子可以在释放标记基团后直接或间接地进行可视化[3]。对于非靶向的脂质组学或代谢研究，可能需要选择性地提高特定分子组的可见性，这可以通过结合质谱的离子迁移谱（IMS）技术来实现[4]。在这种技术中，离子根据其迁移率（由大小、形状和电荷决定）进行分离，并通过质谱进行分析。一种不需要特殊设备的更简单方法是应用清洗协议。在MSI测量之前，使用单一或多种溶剂对组织进行清洗，通过去除次要的分子基团来增强分析物的电离，从而减少剩余分子基团的总体电离抑制。因此，所选清洗溶剂的理化性质需要有利于目标分子。清洗协议是组织内蛋白质成像的先决条件。在不同的例子中，使用了酒精[5,6,7,8]、有机溶剂（如二甲苯、氯仿[9, 10]和水性缓冲液[11]等溶剂来增强成像实验中的蛋白质信号。在这些例子中，通过清洗掉脂质分子来最小化信号抑制，从而增强了蛋白质信号。为了增强脂质信号，发现几种水性缓冲液（如甲酸铵和醋酸铵）非常有用[12, 13]。也有报道使用溶剂清洗技术来成像小分子代谢物（SMM）[14]。测试了多种有机溶剂（包括氯仿、酒精、乙腈（ACN）和丙酮）在大鼠脑组织中的应用效果[14]。据报道，15分钟的氯仿清洗可以增加m/z 150–500范围内化合物的信号强度并使检测到的化合物数量翻倍，同时去除了一部分脂肪酸和单酰甘油[14]。Sun等人[15]报告称，丙酮浸泡可以提高MALDI-MS成像SMM（如多胺、胆碱、肉碱、氨基酸、核苷、碳水化合物、有机酸和易电离脂质）的灵敏度和覆盖率，同时降低肽和蛋白质的水平。尽管清洗协议在许多MSI相关研究中被常规使用，但选择合适的清洗条件往往依赖于个人经验或试错。迄今为止，尚未有系统评估清洗条件对MSI实验中SMM强度影响的报告。在这项工作中，我们系统评估了12种常用清洗溶剂对DESI-MSI中多种代谢物组（包括氨基酸、核苷酸、TCA循环中间体、脂肪酸和极性脂质）的分析物信号和定位的影响。由于MSI已成为基础和应用癌症研究中的重要工具，我们在新鲜冷冻的PANC-1异种移植肿瘤组织上进行了这项研究。基于在Metaspace平台上免费提供的参考数据集[16]的分析，我们提供了一个实用指南，帮助MSI科学家根据他们的实验需求选择有效的清洗方法。

方法：
化学品：
从Sigma-Aldrich Chemie GmbH（德国陶夫基兴）购买了pH=4的柠檬酸钠缓冲液，其中含有1%（w/v）羟乙基纤维素、0.25%（w/v）吐温和0.05%（w/v）Antifoam A浓缩物。从VWR International GmbH（德国达姆施塔特）购买了丙酮、氯仿、二甲基亚砜（DMSO）、甲基叔丁基醚（MTBE）以及4%（w/v）磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的甲醛溶液。从Sigma-Aldrich Chemie GmbH（德国陶夫基兴）购买了乙醇（EtOH）、乙腈（ACN）和乙酸乙酯（EtOAc）。从Thermo Fisher GmbH（德国坎德尔）购买了二甲苯、醋酸铵盐和乙二胺四乙酸二铵（EDTA）盐水合物。从Th. Geyer GmbH & Co. KG（德国伦宁根）购买了磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂。使用HPLC级水制备了150 mM EDTA、150 mM 醋酸铵和PBS溶液，以及PBS、DMSO和EDTA后的额外水洗。用于DESI-MSI测量的HPLC级甲醇和水也是从Sigma-Aldrich Chemie GmbH（德国陶夫基兴）购买的。每种溶剂的log KOW和极性指数在补充表S1中提供。

组织制备：
通过将人类胰腺癌细胞系PANC-1注射到6周大的雌性裸鼠（Crl:NU(NCr)-Foxn1nu，Charles River）的侧腹中培养肿瘤。让肿瘤生长直到平均肿瘤体积达到150 mm3。为了符合3R原则减少动物数量，这些肿瘤来自对照组，并通过口服给予10 μL/g的载体溶液，该溶液含有pH=4的柠檬酸钠缓冲液，其中含有1%（w/v）羟乙基纤维素、0.25%（w/v）吐温和0.05%（w/v）Antifoam A浓缩物。尸检后，将肿瘤块快速冷冻在液氮中并储存在-80 °C直到进一步分析。然后将肿瘤嵌入7.5%（w/v）羟丙基甲基纤维素（HPMC）和2.5%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的块中。通过将块浸入-78 °C的异丙醇中，然后在-78 °C的2-甲基丁烷中快速冷冻。得到的块在-80 °C的冷冻柜中保存直到冷冻切片。使用Leica CM1950冷冻切片机（Leica Microsystems GmbH，德国韦茨拉尔）在-20 °C下将肿瘤样本连续切片至10 μm厚度，解冻后排列在Superfrost显微镜玻璃载玻片上，然后在氮气流下干燥。切片后的组织被送往病理学研究所（Klinikum rechts der Isar，TUM）进行苏木精和伊红（H&E）染色。结果图像在ImageScope × 64下进行查看。

清洗程序：
组织通过将玻璃载玻片浸入40 mL溶剂中30秒进行清洗，除了4%（w/v）甲醛清洗，后者保持5分钟以达到足够的组织固定。每个载玻片的中间部分保持未清洗（作为对照），而两侧部分分别浸入不同的溶剂中。对于EDTA、PBS和DMSO清洗，之后还进行了30秒的水清洗。对于乙醇清洗，添加了额外的水浸泡以重新水化组织。

DESI-MSI测量：
在自制的自动化2D移动平台上进行测量，该平台配备了一个自制的喷雾装置[17]，安装在一个Orbitrap质谱仪（Q-Exactive Plus，Thermo Scientific，德国不来梅）上。分析采用负离子模式，质量精度为3 ppm，使用以下仪器参数：S-Lens射频水平为75，毛细管温度为320 °C，最大注射时间为150 ms，质量分辨率在m/z 200时为70,000。测量在m/z范围80–900内进行，空间分辨率为150 μm。使用LC–MS级95%（v/v）甲醇作为喷雾溶剂，流速为2 μL/min，喷雾电压为±2 kV。溶剂由Harvard Apparatus Elite注射泵供应，配备2.5-mL Hamilton注射器。溶剂在2 bar的背压下用氮气雾化。所有数据存储在Metaspace上；访问链接在补充表S2中提供。

数据转换和分析：
原始文件使用ProteoWizard msConvert（版本3.0.4043）[18]转换为.mzML文件，然后使用imzML converter版本1.3 [19]编译为.imzML文件。数据进一步在LipostarMSI 2.1.0 [20]中处理，使用以下峰检测参数：最小信噪比（SNR）为0，噪声窗口大小为0.1 amu，最小绝对强度为0.1。强度低于基峰0.2%的峰被丢弃。使用窗口大小为7点、二阶和1次迭代的Savitzky-Golay平滑处理进行基线校正。线性插值用于基线校正，段大小为0.1 amu。数据集以5 ppm m/z容忍度、1%的最小峰频率、0.1的最小峰强度和0.7的最小空间混沌性加载。预处理后手动移除了由噪声引起的剩余图像。

感兴趣区域（ROIs）：
仅在评估了相邻的H&E染色后，手动在肿瘤组织周围绘制ROI（见补充图S1），以排除坏死或肌肉组织区域。ROI的强度经过去噪处理（分位数阈值=99.95%），然后以5 ppm的质量容忍度进行处理。所有分析都是基于原始离子强度进行的，以评估信号变化作为检测灵敏度的衡量标准。从覆盖广泛极性范围的已知内源性分子中提取了面积平均强度（log KOW范围从谷胱甘肽的-4.9到Cer(34:1)的13.7）。完整的靶标列表，包括加合物细节和FDR阈值，提供在表S3中。由于切片是连续的，因此不预期对照和清洗切片之间的组织成分会有很大变化。对于每张切片上的组织，平均倍数变化是根据各自的对照组织逐个组织计算得出的（每张切片上有三个重复的肿瘤样本，见图1）。图1：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。本研究中使用的工作流程：将三个PANC-1异种移植肿瘤嵌入在一起并作为一个整体切片处理。将三个连续的切片放置在一个显微镜玻璃载玻片上。中间的切片作为对照（未清洗），而外侧的两个切片分别用不同的溶剂清洗。经过MSI处理后，将每种清洗溶剂的分析物丰度标准化到3个肿瘤样本的对照组织切片上，并计算出各种代谢物的倍数变化值。图2显示了清洗后几种代谢物的单离子图像。使用BioRender软件制作。Matic, B. (2026) https://BioRender.com/kgl5pda

结果与讨论：为了提供一个社区参考数据集和指南，我们按照图1所示的方案系统地评估了12种常用的清洗溶剂。这些溶剂的选取基于先前的研究协议[9,10,11,12,13,14,15]，涵盖了常用的水基溶剂（PBS、醋酸铵、EDTA、4%（w/v）甲醛）和有机溶剂（70%（v/v）乙醇、DMSO、EtOAc、ACN、MTBE、丙酮、二甲苯、氯仿），其极性指数范围从7.2（DMSO）到2.5（二甲苯和MTBE）。所有选定溶剂的极性指数和对数KOW值总结在表S1中。

我们评估了（i）特定分子组（从初级代谢物到脂质）的敏感性增强情况，以及（ii）代谢物的迁移情况。其中（i）是通过在同一张切片上对应清洗后和对照组织切片之间计算倍数变化比率来进行的，而（ii）则是通过比较同一组织内的信号强度与组织外的信号强度来评估的。尽管所使用的肿瘤组织相对均匀，但在肿瘤样本#1和#3中发现了坏死组织区域，并在后续用于分析的ROI中排除了这些区域。有关所评估的代谢物和溶剂的更多信息，请参见补充表S1和S3。

所有测试溶剂的清洗时间都选择为30秒（4%（w/v）甲醛除外），因为这是成像协议中常用的预清洗时间[5, 14, 21]。在组织成像实验中，通常使用4%（w/v）甲醛溶液作为固定步骤。在这里，需要5分钟或更长时间的清洗才能达到足够的固定效果。

本研究分析的几种代谢物的MS图像显示在图2中。每种溶剂都与连续的对照切片进行了比较，并计算了倍数变化以评估相应代谢物的平均强度变化。肿瘤组织分析的结果显示在图3中。

图2：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。不同溶剂清洗后各种代谢物的代表性DESI-MS图像（±5 ppm）：(a) 氨基酸：脯氨酸 m/z 114.0459；(b) 有机酸：马兜铃酸 m/z 173.0085；(c) 糖类：己糖 m/z 215.0324；(d) 核酸化合物：鸟苷 m/z 282.0845；(e) 脂肪酸：C24:4 m/z 359.2960；(f) 神经酰胺：Cer(34:1;O2) m/z 572.4823；(g) 脂质：PG (36:2) m/z 773.5344。空间分辨率：150 μm。

图3：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。处理过的肿瘤与对照肿瘤中代谢物类别的平均强度倍数变化。溶剂按极性递减的顺序排列（从左到右）。0 = 完全去除，1 = 无变化，≥2 = 倍数增加。n.i.，未检测到。个别组织数据见补充图S2。

清洗溶剂对代谢物丰度的影响在不同化合物类别中差异显著，并受到溶剂极性的强烈影响。溶剂倾向于溶解并去除具有相似物理化学性质的化合物。因此，极性相反的代谢物会保留在组织内，从而通过减少竞争离子的干扰来更有效地离子化。因此，与先前的报告一致，非极性溶剂会去除亲脂性代谢物，增强极性代谢物的离子化，而极性的水基溶剂则会去除亲水性代谢物，从而增强非极性代谢物的离子化。对于每种测试的代谢物，都找到了能够增强其信号强度的清洗溶剂。增强范围从1.2倍到5倍不等，对于SMM来说是这样，而对于亲脂性代谢物则表现出2到20倍的增强。然而，溶剂的质量在不同代谢物类别（甚至在同一代谢物类别内）和个别代谢物之间也存在差异。EtOAc对亲水性SMM最有效，而EDTA和醋酸铵对亲脂性代谢物的增强效果最高。神经酰胺在PBS处理后有独特的增强效果。以下部分将基于化合物类别讨论极性和非极性代谢物的这些不同模式。

氨基酸：EtOAc是增强所有氨基酸离子强度最有效的清洗溶剂， histidine是唯一的例外。大多数其他有机溶剂（DMSO、ACN、MTBE、二甲苯）的增强效果较小，而氯仿和丙酮通常会降低氨基酸的信号强度。水基溶剂PBS、4%（w/v）甲醛、醋酸铵和EDTA则导致几乎所有氨基酸的强度降低。各亚类内的反应大致符合这一趋势，尽管ACN对较大非极性氨基酸的增强程度高于EtOAc。赖氨酸在EDTA、DMSO和乙醇清洗后显示出强烈的强度增加，但随后出现了代谢物的迁移现象。有关不同氨基酸亚类的详细讨论，请参见补充信息。

核酸成分：有机溶剂清洗增强了核碱基和核苷的强度，其中EtOAc、二甲苯和MTBE的增强效果最为一致。单磷酸化核苷酸的表现则更为复杂。丙酮和二甲苯对强度影响较小，而氯仿和MTBE则降低了强度。EtOAc对所有检测到的核苷酸产生了最显著的强度增加，而ACN则提供了中等程度的增强。水基清洗一致地去除了大多数核酸成分，而醋酸铵选择性地增强了鸟苷和鸟嘌呤的强度，但导致了迁移现象。DMSO和70%（v/v）乙醇的结果则混合。

糖类：通过溶剂清洗，单糖和二糖类的强度增加通常较为温和。二甲苯和EtOAc的效果最好。其他非极性或中等极性溶剂要么保持了分析物的强度，要么导致了轻微的去除。尽管甲醛选择性地增强了戊糖的强度，但水基清洗去除了大量的糖类，这与它们的亲水性特性一致。

有机酸：对于小分子有机酸，水基清洗去除了大多数化合物，而EtOAc则一致地增强了强度。其他有机溶剂对不同有机酸的影响各不相同。MTBE和二甲苯主要保持了或略微增强了强度，而氯仿则降低了大多数酸的信号强度。

脂质：水基清洗后，脂肪酸和脂质的强度有所提高。相比之下，有机溶剂清洗导致了脂肪酸和磷脂的一致性去除，其中极性越强的溶剂导致的强度降低越明显。氯仿在去除亲脂性代谢物方面最为有效。PBS清洗后神经酰胺得到了选择性增强，而所有其他极性和非极性溶剂都去除了这类脂质。溶血磷脂在水基清洗中并没有得到一致的增强，也没有被某些有机溶剂清洗一致地降低。

迁移现象：通过计算清洗组织区域周围的平均信号强度百分比与相应肿瘤组织中的平均信号强度的百分比来量化迁移现象。图4展示了不同溶剂导致的迁移程度。水基和有机溶剂在保留代谢物方面效果不同，后者在组织中更有效。70%（v/v）乙醇清洗后迁移程度最高，几乎所有代谢物在玻璃背景上都显示出高信号。此外，水基清洗（如醋酸铵）导致亲水性代谢物显著迁移到玻璃载玻片上，表明去除不完全。相比之下，有机溶剂清洗后极性代谢物的迁移现象较少，其中ACN、EtOAc和MTBE的迁移现象最小，与未处理（对照）组织相当（见图S3）。亲脂性分析物被选择性去除，玻璃背景上没有留下信号。

图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。溶剂清洗后的分子迁移程度。红色条形图标表示相对于肿瘤组织内的信号，组织外部检测到的代谢物信号的百分比（组织外部信号/组织内信号×100）。没有条形表示迁移程度<10%；逐渐增大的条形代表20%、40%、60%、80%和100%的阈值。

组织完整性：MSI经常集成到多模式工作流程中，在MSI之后应用各种染色协议。在这种情况下，所选的清洗处理必须保持初始的组织形态。为了评估溶剂处理后的组织完整性，用H&E对组织进行了染色。结果图像显示，根据溶剂处理的不同，组织结构完整性有所差异（见图5）。对于EtOAc处理，细胞结构保持完整，没有分离或折叠现象；此外，颜色与未处理的对照组相当。在醋酸铵清洗的组织中，右侧（清洗时的下方）的细胞在相应的H&E图像中显示出位移迹象。总体而言，这些细胞的颜色比对照细胞更浅，但其结构仍然清晰可见，组织学质量也得到保持。用70%（v/v）乙醇清洗的组织也显示出结构完整性受损，包括部分从载玻片上分离、细胞形态不清晰以及组织学质量较差。此外，乙醇清洗导致严重的干燥、剥落以及在DESI-MSI分析过程中部分从玻璃载玻片上分离。

图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。不同清洗处理后的PANC-1异种移植肿瘤的H&E染色切片：(A) 整个肿瘤的概览，标出了用于高倍率图像的区域；(B) 未经清洗的高倍率对照切片；(C) 用乙酸乙酯清洗后的高倍率切片；(D) 用醋酸铵清洗后的高倍率切片；(E) 用乙醇（70% v/v）清洗后的高倍率切片。

实际建议：对于亲水性SMM的检测，推荐使用EtOAc，因为它在所有氨基酸（所有亚类）、核碱基、核苷、核苷酸、糖类和有机酸中都一致地增强了强度，同时迁移现象最小且没有可检测到的形态损伤。然而，由于其疏水性，EtOAc降低了脂肪酸和磷脂的强度。最近的研究发现EtOAc能够增强PET示踪剂UCB-J的信号，这归因于其能够去除更广泛的极性和中性脂质[22]。然而，本研究没有将氯仿作为替代清洗溶剂进行评估。我们的结果显示，氯仿是去除脂肪酸和磷脂最有效的溶剂；然而，这并不自动转化为对较小代谢物检测能力的提高。SMM的强度也大幅降低。尽管氯仿的极性指数略低于乙酸乙酯（4.1 vs 4.4），但它能够形成（弱）氢键，这有助于其与多种有机分子的结合，使其成为提取广泛化合物的有效溶剂。大多数SMM的去除可能归因于这一能力[23]。乙醇（70%，v/v）显著增强了某些代谢物的强度（例如腺嘌呤），但经常导致代谢物的迁移和组织完整性问题（见图4和5），限制了其整体实用性。MTBE和二甲苯对非极性氨基酸、糖类和某些有机酸有轻微的增强效果，但对极性代谢物的影响有限，并且强烈去除了脂肪酸和磷脂。相比之下，当需要增强亲脂性代谢物的检测时，推荐使用水基清洗（PBS、4%（w/v）甲醛、醋酸铵、EDTA），因为它们在增强脂肪酸和磷脂强度的同时去除了极性代谢物（氨基酸、核酸、糖类、有机酸）。PBS独特地增强了神经酰胺的强度，与其他脂质类别不同，神经酰胺在这里以[M + Cl]?加合物的形式被检测到，而其他清洗干预措施则导致所评估的神经酰胺脂质强度损失。这些发现总结在图6的清洗溶剂选择指南中。

图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。基于代谢物类别选择清洗溶剂以增强DESI-MSI中代谢物检测的决策树指南。使用BioRender软件制作。Matic, B. (2026) https://BioRender.com/16jvm7y
结论：洗涤步骤是一种提高检测灵敏度的有效方法，因为使用合适的溶剂系统可以增强所有被检测代谢物的信号强度。由于缺乏针对多种分析物的溶剂系统的系统比较研究，我们对比研究了12种有机和水基洗涤溶剂对肿瘤组织中各种小分子代谢物的影响。该研究结果以公共数据集的形式存储在Metaspace仓库中，可供质谱成像领域的研究人员用于数据驱动地选择合适的洗涤溶剂。此外，这些数据还可以为选择适合DESI-MSI分析的溶剂组合和改性剂提供参考，从而提高分析物的提取和检测效率。同时，还评估了每种溶剂对组织完整性的影响。为了便于快速、明智地选择针对特定目标代谢物的洗涤溶剂，本文还提供了一个实用的决策树工具。

本研究仅采用了负离子模式的DESI-MSI技术；不过我们预期这些结果在MALDI或LA-REIMS等其他成像模式以及正极性条件下也具有普遍适用性。此外，本研究仅针对肿瘤组织进行。尽管肿瘤组织是目前MSI研究中最常用的样本类型，但由于不同组织在化学和机械性质上的差异，溶剂渗透性和化合物提取效果可能存在差异，因此在其他组织中也可能观察到不同的结果。