柑橘园中镰刀菌（Fusarium spp.）的多样性容易导致根腐病和黄叶病，及其防控方法 阮国匡（Nguyen Quoc Khuong）、 赵丽安（Chau Ly An）、 阮德荣（Nguyen Duc Trong）、 黎清光（Le Thanh Quang）、 黎氏美 Thu（Le Thi My Thu）、 阮芳凡（Nguyen Phuong Van）和 杜氏玄（Do Thi Xuan）

《Applied Microbiology》：Diversity of Fusarium spp. in Pomelo (Citrus maxima (Burm.) Merr.) Orchards Riskily Caused Root Rot and Yellow Leaf Disease, and the Control Approach Nguyen Quoc Khuong, Chau Ly An, Nguyen Duc Trong, Le Thanh Quang, Le Thi My Thu, Nguyen Phuong Van and Do Thi Xuan

　　摘要：由镰刀菌属（Fusarium spp.）引起的疾病在全球范围内各不相同。确定这些病原体的致病因子及其天生的拮抗剂非常重要。因此，本研究旨在：（i）确定引起根腐病和黄叶病（RRYLD）的病原体；（ii）选择能够控制这些病原体的木霉菌（Trichoderma spp.）菌株；（iii）评估制备拮抗真菌的方法。研究从越南本 TRE 省的柚子果园中收集了患病土壤样本。实验中分离出了 8 株镰刀菌属菌株，其中 FP-C16、FP-B18、FP-B16 和 FP-B03 在培养第 4 天的生长速度最快（8.33–17.3 mm）。这些菌株被鉴定为 Fujikuroi 型镰刀菌 FP-C16、Verticillioides 型镰刀菌 FP-B18 和 Incarnatum 型镰刀菌 FP-B03。另一方面，从柚子根际中分离出了 25 株木霉菌菌株。其中 13 株木霉菌菌株在实验室条件下对两种镰刀菌属菌株表现出快速生长和强烈的拮抗作用。TP-C40 和 TP-G50 这两种木霉菌菌株对 FP-C16 和 FP-B16 的拮抗效率为 47.7–63.5%。这两种选定的木霉菌菌株被鉴定为 Asperellum 型木霉菌 TP-C40 和 Yunnan 型木霉菌 TP-G50。TP-C40 和 TP-G50 减少了受镰刀菌属感染的叶片和根部的数量。

1. 引言
湄公河三角洲的柚子种植面临多种疾病，如根腐病和黄叶病（RRYLD）、炭疽病、蓟马、黑枯病和茎端腐病 [1,2,3,4,5]。其中，由镰刀菌属引起的 RRYLD 对柑橘树造成了严重损害 [6]。镰刀菌属是一种在全球范围内对多种作物具有强烈危害的真菌，会破坏宿主植物，降低果实品质，并减少植物的产量和生长。镰刀菌属可在植物生长阶段引起幼苗、根部和茎部的腐烂等症状 [7]。此外，植株会从根部变褐、茎部变黑、叶片变黄，最终完全枯萎死亡。目前已确认有四种镰刀菌属菌株会导致柑橘病害，分别是 Fusarium solani (Martius)（70.6%）、F. oxysporum（17.6%）、F. equiseti（8.82%）和 F. brachygibbosum（2.94%）[8,9]。Kurt 等人 [10] 在土耳其检测到 Fusarium solani 是柑橘病的致病因子。Farhaoui 等人 [11] 认为 F. oxysporum 是最具致病性的物种，其次是 F. solani、F. equiseti、F. nygmai、F. brachygibbosum、F. proliferatum、F. culmorum 和 F. falciforme。记录显示镰刀菌属真菌的多样性有八种 [12]。然而，这些物种的影响各不相同。如今，使用微生物拮抗剂受到广泛关注，木霉菌因其通过拮抗、寄生和产生抗生素的机制而具有强大的生物控制能力而闻名 [13]。许多研究利用木霉菌来控制镰刀菌属真菌。例如，木霉菌降低了由 F. oxysporum f. sp. lycopersici 引起的番茄萎蔫病发生率 [14]。此外，本地的木霉菌菌株将 F. oxysporum F.28.1A 引起的芝麻萎蔫病减少了 35% [15]。另外，T. asperellum T-SP19 和 T-SP32 被发现可以控制引起柚子茎端腐病的 Lasiodiplodia theobromae S-P06 和 S-P07 [5]。T. asperellum IIPR Th-31 和 T. afroharzianum IIPR Th-33 将鹰嘴豆（Cajanus cajan L.）的萎蔫病减少了 78–85% [16]。

可以看出，RRYLD 已成为柚子生产中的一个重要限制因素，但关于越南湄公河三角洲柚子果园中与该疾病相关的镰刀菌属物种多样性的信息仍然有限。此外，尚未充分研究从柚子根际土壤中分离出的本地木霉菌菌株作为这些病原体的潜在生物控制剂的作用。因此，本研究的新颖之处在于结合了鉴定与柚子 RRYLD 相关的镰刀菌属菌株以及筛选具有拮抗和抑制疾病潜力的本地木霉菌菌株。因此，本研究旨在：（i）确定柚子果园中 RRYLD 的致病因子多样性；（ii）选择能够在体外条件下拮抗镰刀菌属病原体的木霉菌菌株；（iii）评估在温室条件下应用选定的木霉菌菌株控制柚子幼苗中由镰刀菌引起的 RRYLD 的潜力。

2. 材料与方法
2.1 材料
实验时间：2022 年 10 月至 2023 年 4 月。
实验地点：土壤样本来自越南本 TRE 省的 Chau Thanh、Binh Dai 和 Giong Trom 地区。病原体和拮抗剂的分离与筛选在越南芹苴市芹苴大学农业学院作物科学系的食用与药用蘑菇实验室进行。
培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）——马铃薯提取物：200.0 g L?1，D-葡萄糖：20.0 g L?1（中国新疆西隆），氯霉素：25.0 g L?1（中国新疆西隆），琼脂：20.0 g L?1（越南胡志明市海龙），pH 6.5–6.8 [17]。
木霉菌选择性培养基（TSM）——NH4NO3：1.0 g L?1（中国新疆西隆），K2HPO4：0.90 g L?1（中国新疆西隆），KCl：0.15 g L?1（中国新疆西隆），MgSO4·7H2O：0.20 g L?1（中国新疆西隆），氯霉素：0.25 g L?1，琼脂：20.0 g L?1，葡萄糖：3 g L?1，pH 6.5–6.8 [18]。
用于生物控制实验的土壤：冲积土来自芹苴大学农业学院的实验区。土壤经过干燥、去除有机残留物、混合、研磨，并进行两次高压灭菌（每次 24 小时）。高压灭菌后的土壤被装入重 2.0 公斤的容器中。

2.2 方法
2.2.1 镰刀菌属的分离与致病性评估
从本 TRE 省的 Chau Thanh、Binh Dai 和 Giong Trom 地区收集了 10 个患病柚子树的根际和根部样本，深度为 5–20 厘米。将患病样本放入塑料袋中标记后带回实验室并立即进行分离。根据 Olszak-Przyby? 等人的方法 [19] 进行分离。将 1 克样本在灭菌蒸馏水（SDW）中分别以 1 × 10?1、1 × 10?2 和 1 × 10?3 的浓度进行稀释，轻轻摇晃 30 分钟，然后在室温（28–32 °C）下静置沉淀一天。将设备在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟后，将样本接种到 PDA 上。培养 2–4 天后，选择具有病原体特征的菌丝。根据菌丝特征对真菌进行鉴定。观察分离出的真菌是否具有镰刀菌属的特征。将分离出的真菌储存在 4 °C 的固体 PDA 中。

2.2.2 木霉菌属的分离与筛选
从越南本 TRE 省的 Chau Thanh、Binh Dai 和 Giong Trom 地区收集了 25 个健康柚子树的根际样本，深度为 5–15 厘米。将土壤样本在 4 °C 下保存并运回实验室。
根据 Alwadai 等人的方法 [22] 在 TSM 中分离木霉菌菌株。将土壤样本与 SDW 以 1:99 的比例稀释，摇晃 30 分钟，然后在室温（28–32 °C）下静置沉淀一天。将土壤溶液涂布在 TSM 上 [23]。48 小时后观察样本以选择和纯化真菌菌株。通过光显微镜（40×）观察菌丝（颜色和形状）和孢子特征来检测木霉菌菌株。将纯化的样本储存在含有 PDA 的 Eppendorf 和 Petri 盘中，温度为 4 °C。

2.2.3 木霉菌属的形态描述
根据 Nikitin 等人的方法 [20] 描述镰刀菌属真菌的形态。将单孢子在光照条件下培养于 PDA 中。将 PDA 滴液放置在 Petri 盘（90 mm × 15 mm；Dinlab，摩洛哥卡萨布兰卡）的显微镜载玻片上。将真菌单孢子接种到 PDA 滴液中，覆盖一层显微镜盖片，并加入少量 SDW。在室温（25 °C）下培养 4 天。使用立体显微镜（Kruess，德国汉堡）和光学显微镜（Olympus，日本东京）观察菌丝表面、颜色、形状和孢子大小。根据采样位置、菌丝形状和颜色以及菌丝形态对真菌进行分类。

2.2.4 选定镰刀菌属的鉴定
从菌丝中提取镰刀菌属菌株的 DNA。将孢子在 PDA 中培养 7 天。然后将菌丝放入 2.2 mL 的 Eppendorf 中，在室温下培养 10 分钟。接着以 13,000 rpm 的速度离心 5 分钟。收集细胞沉淀物，用 500 μL 70% 乙醇（中国新疆西隆）冲洗，再以 13,000 rpm 的速度离心 5 分钟，然后真空干燥。将 DNA 溶解在 100 μL 的 TE 0.1X 缓冲液中（Merck，德国达姆施塔特）。使用 ITS1 和 ITS4 一对引物 [21] 进行 PCR，序列如下：ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR 总体积为 50 μL，步骤包括：变性（95 °C 5 分钟）、30 个循环（变性 95 °C 90 秒、退火 52 °C 60 秒、延伸 72 °C 90 秒），最后在室温下终止。PCR 扩增产物通过自动测序仪进行纯化和测序。将序列与 NCBI 的 GenBank 数据库进行 BLASTN 比对。

2.2.5 木霉菌属的分离与筛选
从越南本 TRE 省的 Chau Thanh、Binh Dai 和 Giong Trom 地区收集了 25 个健康柚子树的根际样本，深度为 5–15 厘米。将土壤样本在 4 °C 下保存并运回实验室。
根据 Alwadai 等人的方法 [22] 在 TSM 中分离木霉菌菌株。将土壤样本与 SDW 以 1:99 的比例稀释，摇晃 30 分钟，然后在室温（28–32 °C）下静置沉淀一天。将土壤溶液涂布在 TSM 上 [23]。48 小时后观察样本以选择和纯化真菌菌株。通过光显微镜（40×）观察菌丝（颜色和形状）和孢子特征来检测木霉菌菌株。将纯化的样本储存在含有 PDA 的 Eppendorf 和 Petri 盘中。

2.2.6 木霉菌属的生物控制能力评估
使用双重培养技术在 PDA 上评估木霉菌属对镰刀菌属的拮抗作用。将木霉菌菌株和镰刀菌菌株同时培养在同一 Petri 盘（φ = 9.5 mm）中，两个菌丝中心之间的距离为 3 cm（图 1）。每天测量每个菌丝的直径，以确定木霉菌菌株的菌丝生长抑制率（PIMG）。仅含镰刀菌菌株的培养盘作为对照。每个处理重复三次，每个处理包含一个 Petri 盘，实验独立进行。在接种后 24、48、72 和 96 小时记录菌落半径。
图 1. 来自柚子根部和根际的镰刀菌属菌株（a,b）FP-B03，(c,d) FP-B16，(e,f) FP-B18，(g,h) FP-C16 的菌丝形态；左列是顶部，右列是底部。PIMG 根据 Krutmuang 等人的方法 [26] 计算如下：
PIMG = {(R1 ? R2)/R1} × 100%
其中：
R1：阴性对照中的镰刀菌属菌株半径；
R2：与木霉菌共接种的镰刀菌属菌株半径。
抑制区是指木霉菌菌丝与病原菌丝重叠的部分。

2.2.7 温室条件下木霉菌属对柚子 RRYLD 的生物控制能力
实验完全随机化，每个处理重复三次，每组包含四棵树，每组对应四个盆栽。处理包括：
处理 1：无病原体；
处理 2：四种病原菌株；
处理 3：四种病原菌株 + 在感染的同时喷洒两种木霉菌菌株；
处理 4：四种病原菌株 + 在感染后 3 天喷洒两种木霉菌菌株；
处理 5：四种病原菌株 + 在感染后 6 天喷洒两种木霉菌菌株。
将选定的镰刀菌菌株悬浮液（2 × 10^6 孢子/幼苗）倒入柚子幼苗中。在感染后的第 7、14 和 28 天接种病原体。评估参数包括 RRYLD 的出现时间和受感染的叶片和根部的数量。在种植后的第40天，对疾病的发生程度进行了评估。选定的木霉菌（Trichoderma spp.）菌株的鉴定方法与镰刀菌（Fusarium spp.）的鉴定方法相同。2.3 统计分析数据使用SPSS 13.0版本进行了方差分析（ANOVA）。均值比较采用了Duncan多重范围检验，在5%的概率水平上进行。当p < 0.05时，差异被认为具有统计学意义。结果以平均值表示，同一列中带有相同字母的处理组之间没有显著差异。3. 结果 3.1 引起柚子根腐病和黄叶病的镰刀菌菌株的形态和生长 3.1.1 镰刀菌的形态从Chau Thanh、Binh Dai和Giong Trom三个地区的土壤样本中分离出了8种引起RRYLD的镰刀菌菌株。在培养的第9-10天，所有这些真菌都覆盖了整个培养皿。总体而言，这些真菌的颜色各异：FP-B06和FP-B10为白色，FP-B03为深棕色，FP-C110和FP-C16从黄色到白色不等，FP-B16和FP-B18从紫色到浅黄色不等，FP-C05为黄紫色。菌丝体的表面结构也有所不同。菌丝体呈同心圆状生长，边缘呈白色且波浪形。菌丝体的下侧为扁平的白色或浅黄色，中间部分则呈白色或深色（图1和图S1）。不同镰刀菌菌株的菌丝体中间部分最初为黄色，随后变为白色、紫色或浅黄色，这是各菌株的特征（表1）。表1. 在PDA培养基上接种后第10天，引起根腐病和黄叶病的镰刀菌菌株的菌丝体特征。3.1.2 镰刀菌在PDA上的生长接种后24小时，FP-B16和FP-B18两种菌株的直径生长最快，分别为17.3毫米和16.7毫米，而其他菌株的直径为5.33-10.7毫米（表2）。接种后48小时，FP-B16（28.3毫米）和FP-B18（27.3毫米）的直径生长明显大于其他菌株（12.3-17.7毫米）。接种后72小时，FP-B16和FP-B18的直径显著大于其他菌株，分别为45.7毫米和44.3毫米（表2）。接种后96小时，FP-B16的直径达到60.3毫米，远大于其他菌株（25.1-57.3毫米）。最终，选择FP-B03、FP-B16、FP-B18和FP-C16这三种菌株进行进一步鉴定和人工感染实验（表2）。3.1.3 识别引起柚子RRYLD的镰刀菌菌株FP-B03、FP-B16、FP-B18和FP-C16分别被鉴定为Fusarium fujikuroi、F. verticillioides和F. incarnatum，对应的编号分别为OQ928087、OQ928088、OQ928089和OQ928090，相似度为99%（图2）。图2. 引起柚子根腐病和黄叶病的镰刀菌菌株的系统发育树。3.2 木霉菌菌株的形态和生长 3.2.1 木霉菌的形态从Ben Tre省Chau Thanh、Binh Dai和Giong Trom地区的25个柚子果园的25个根际样本中收集了25种木霉菌菌株（图3和图S2）。接种后第5天，菌丝体就覆盖了培养皿表面，并呈现出浅绿色或深绿色（表3）。图3. 从柚子果园土壤中分离出的木霉菌菌株（a）TP-G50和（b）TP-C40在PDA上的形态。表3. 在PDA培养基上培养第7天时，木霉菌菌丝体的特征。3.2.2 木霉菌在PDA上的生长接种后24小时，TP-G47菌株的直径生长为36.0毫米，与其他菌株TP-B30、TP-C36和TP-G48（35.0-35.7毫米）相当。接种后48小时，这些菌株的菌丝体直径相同（67.0毫米）（表4）。接种后72小时，部分菌株的生长速度较慢，包括TP-B28、TP-B32、TP-C35、TP-C37、TP-C38、TP-C39、TP-C40、TP-C41、TP-C42、TP-C44、TP-G49和TP-G50（24.0-25.5毫米）（表4）。因此，选择了另外13种木霉菌菌株（包括TP-B26、TP-B28、TP-B30、TP-B32、TP-C34、TP-C36、TP-C38、TP-C40、TP-C42、TP-C44、TP-C46、TP-C48和TP-G50）进行对抗柚子RRYLD的实验（表4）。3.3 木霉菌在体外条件下对镰刀菌的生物控制能力 3.3.1 木霉菌在体外条件下对Fusarium incarnatum FP-C16的拮抗作用13种木霉菌菌株对Fusarium incarnatum FP-C16的拮抗作用见图4。总体而言，所有木霉菌菌株在不同程度上抑制了Fusarium incarnatum FP-C16的生长（图4）。接种后48小时和72小时，TP-C40的拮抗作用最强（42.0%），TP-B26（59.5%）和TP-C38（56.5%）的拮抗效果与TP-C36（50.2%）相当，但高于其他菌株（22.1-47.0%）。弱拮抗作用的菌株包括TP-B30（28.3%）、TP-C34（22.1%）、TP-C42（22.1%）和TP-C44（37.7%）（表5）。接种后72小时，TP-SA10的拮抗作用最强，抑制率高达63.5%，显著高于TP-B26（58.6%）、TP-B28（58.6%）、TP-B32（61.1%）、TP-C36（61.1%）、TP-G48（61.1%）和TP-G50（58.6%）。具有中等拮抗作用的菌株包括TP-C38（51.3%）和TP-G46（53.8%）。在拮抗作用进行到第9天时，病原菌的菌丝体被完全消除（图4）。3.3.2 木霉菌在体外条件下对Fusarium verticillioides FP-B16的拮抗作用木霉菌菌株在PDA上对Fusarium verticillioides FP-B16表现出拮抗作用（图5）。接种后48小时，TP-G50的拮抗作用最强（44.1%）。具有中等拮抗作用的菌株包括TP-B26（36.1%）、TP-B30（30.1%）、TP-B32（36.2%）、TP-C38（36.1%）、TP-C40（30.1%）、TP-C42（30.1%）、TP-G46（32.1%）和TP-G48（38.1%）。拮抗作用较弱的菌株包括TP-C34（18.2%）、TP-C36（26.1%）和TP-C44（20.2%）（表6）。接种后72小时，TP-G50的拮抗作用最强（62.6%），显著高于TP-B26（55.2%）、TP-B28（53.7%）、TP-B32（56.6%）、TP-C36（44.7%）、TP-C38（47.7%）、TP-C40（47.7%）、TP-C42（43.2%）和TP-G48（53.7%）（表6）。图6. 木霉菌在体外条件下对Fusarium verticillioides FP-B16的拮抗作用。表6. 木霉菌对引起柚子根腐病和黄叶病的Fusarium verticillioides FP-B16的菌丝体生长抑制率。3.3.3 识别具有拮抗作用的木霉菌菌株在体外条件下表现出强拮抗作用的两种木霉菌菌株TP-C40和TP-G50被鉴定为Trichoderma asperellum FP-C16和T. yunnanense FP-B16，相似度为99%（图6）。图6. 具有拮抗作用的木霉菌菌株的系统发育树。3.4 木霉菌在温室条件下控制由镰刀菌引起的柚子RRYLD的效果四种病原菌引起的病害症状主要表现在叶片上（图7）。感染后第7天，症状尚未出现；感染后第14天，叶片上开始出现症状；感染后第28天，病害症状更加明显。其中，未使用木霉菌处理的病叶比例最高，其次是感染后6天使用木霉菌处理的处理组；感染后立即使用木霉菌处理的处理组和感染后3天使用木霉菌处理的处理组病叶比例最低（表7）。同时喷洒木霉菌和病原菌时，病叶数量也有所减少（表8）。这表明木霉菌抑制了这四种镰刀菌的致病性（图7）。表7. 喷洒木霉菌菌株对柚子病叶和病根的影响（a）阴性对照；（b）F. fujikuroi FPB03；（c）F. verticillioides FPB16；（d）F. verticillioides FPB18；（e）F. incarnatum FP-C16。表8. 木霉菌在控制由F. fujikuroi FPB03、F. verticillioides FPB16、F. verticillioides FPB18和F. incarnatum FP-C16引起的柚子根腐病和黄叶病中的作用。4. 讨论接种后72小时，FP-B16和FP-B18的直径分别生长到45.7毫米和44.3毫米，与其他菌株（19.3-31.7毫米）相比有显著差异（表2）。因此，选择来自两个不同地点的FP-B16和FP-B18菌株进行进一步研究（表2）。根据Uddin等人的研究[27]，F. oxysporum在PDA上的菌丝体直径在接种后72小时约为3.0厘米。此外，从腐烂的柑橘果实中分离出的镰刀菌菌株在PDA上形成白色菌丝体，并在第三天产生孢子[28]。由于病原菌生长迅速，应在柚子种植期间采取生物控制措施进行预防。先前研究表明，在柑橘类作物中，F. solani和F. oxysporum是导致干根腐病和衰退的主要原因[8,9,10]。然而，本研究发现与柚子RRYLD相关的病原菌还包括F. fujikuroi、F. verticillioides和F. incarnatum，表明Ben Tre省柚子果园中的病原体种类可能比之前认识到的更为多样。导致RRYLD的四种最强致病菌株为F. fujikuroi FP-B03、F. verticillioides FP-B16、F. verticillioides FP-B18和F. incarnatum FP-C16（表2）。Harish等人[29]在玉米中发现了10种引起茎腐病的镰刀菌菌株，属于F. acutatum、F. verticillioides和F. andiyazi。在向日葵中，F. oxysporum、F. culmorum、F. graminearum、F. avenaceum和F. solani等镰刀菌菌株可引起根腐病、花腐病和叶枯病，其中F. solani造成的危害最为严重[30]。Piasai等人[31]指出，榴莲果实腐烂的病原体包括L. theobromae、Phomopsis sp.和F. solani。总之，镰刀菌会对多种作物造成损害，其中F. solani是导致柚子RRYLD的主要病原体。本研究表明，这些病原菌的致病性很强。在当前研究中，F. fujikuroi FP-B03、F. verticillioides FP-B16、F. verticillioides FP-B18和F. incarnatum FP-C16是导致柚子RRYLD的主要风险因素。接种后72小时，TP-G50菌株的拮抗作用最强（62.6%）（表6）。T. asperellum对F. oxysporum的拮抗作用在25°C条件下可将疾病严重程度指数降低50%[32]。木霉菌的拮抗作用与先前的研究结果一致，表明它们通过多种机制有效抑制镰刀菌。例如，Ferreira和Musumeci[33]指出，木霉菌通过寄生、竞争以及产生抗生素和降解酶来控制病原菌。Boat等人[34]指出，木霉菌产生的挥发性和非挥发性代谢物（如水解酶、几丁质酶、纤维素酶和脂肪酶）可以降解病原菌的细胞壁。其他由木霉菌产生的细胞壁降解酶还可以分解小分子聚合物，如蛋白质、β-1,6-葡聚糖和α-1,3-葡聚糖，从而消除病原菌的菌丝和孢子[35]。在Modrzewska等人的研究[36]中，根据病原体和拮抗菌的种类不同，Trichoderma属菌株可以抑制Fusarium属菌产生的毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol）73–98%、雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol）87–100%和玉米赤霉烯酮（zearalenone）12–100%。本研究观察到的高抑制效果表明，来自柚子根际土壤的本地Trichoderma菌株可能特别适应当地环境条件，这对未来的实际应用具有优势。此外，使用本地拮抗菌相比非本地菌株，可能有助于在果园土壤中更好地建立和持续存在。在温室条件下，通过喷洒Trichoderma属菌株来抑制柚子幼苗中的病原真菌（表7）。这与先前的研究结果一致，即Trichoderma属菌株可以减少枯萎病。根据Awad-Allah等人的研究[37]，在受导致枯萎病的Fusarium属菌污染的土壤上施用Trichoderma属菌株可以显著降低番茄的病害发生率。特别是T. viride和T. harzianum分别将病害发生率降低了57.1%和42.3%。此外，根据Innocenti等人的研究[38]，T. harzianum T22在干燥和湿润季节对F. oxysporum f. sp. lactucae 365.07的拮抗效率分别为57%和78%。另外，使用来自柑橘废弃物发酵的T. harzianum T-78可以降低黄瓜中F. oxysporum的感染率[39]。在辣椒上，使用Trichoderma sp. MHT1134将由Fusarium属菌引起的枯萎病发生率降低到了50.0%，与阴性对照相比[40]。根据Awad-Allah等人的研究[37]，Trichoderma属菌株可以通过单独或混合施用来拮抗F. solani。因此，使用Trichoderma属菌株在控制作物病原体方面是有效的。值得注意的是，当在病原体接种时施用Trichoderma属菌株时，获得了最佳的抑制效果，这表明早期建立拮抗菌对于有效预防疾病非常重要。本研究中观察到的保护效果不仅归因于对Fusarium属菌的直接拮抗作用，还可能归因于早期在根际的定殖以及可能诱导的宿主抗性。从实际角度来看，这些结果表明，选定的Trichoderma菌株可以作为苗圃幼苗或果园早期应用的预防性生物控制剂，而不仅仅是在疾病症状严重出现后才使用。总体而言，该研究展示了病原体鉴定与生物控制选择之间的明确关系：多种Fusarium属菌与柚子RRYLD有关，而本地Trichoderma属菌株在体外和温室条件下对代表性病原体分离株表现出有希望的拮抗活性。然而，还需要进一步的田间规模研究来确认在果园条件下病害抑制的一致性，因为土壤特性、微生物竞争和环境波动可能会影响生物控制的效果。

5. 结论
导致最严重RRYLD的四种Fusarium属菌株是Fusarium fujikuroi FP-B03、F. verticillioides FP-B16、F. verticillioides FP-B18和F. incarnatum FP-C16。从13种Trichoderma属菌株中选择了两种菌株Trichoderma asperellum TP-C40和T. yunnanense TP-G50，它们能够很好地生长并有效拮抗F. verticillioides FP-B16和F. incarnatum FP-C16，相应的PIMG分别为59.6–63.9%和51.4–62.4%。这些发现基本上提高了对与柚子衰退相关的Fusarium属菌多样性的认识，并强调了本地根际相关Trichoderma属菌作为有前景的生物拮抗剂的价值。从实际应用的角度来看，结果表明选定的Trichoderma菌株具有开发成柚子幼苗生产和果园疾病管理预防性生物控制剂的潜力。在大规模推荐之前，应进一步研究其配方方法、保质期、施用时间和田间表现。

补充材料
以下支持信息可在此下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/applmicrobiol6050058/s1
图S1：Fusarium属菌的菌丝形态 (a,b) FP-B06, (c,d) FP-B10, (e,f) FP-C05, (g,h) FP-C10。左列是顶部，右列是底部。
图S2：Trichoderma属菌的形态 (a) TP-B26, (b) TP-B27, (c) TP-B28, (d) TP-B29, (e) TP-B30, (f) TP-B31, (g) TP-B32, (h) TP-C33, (i) TP-C34, (j) TP-C35, (k) TP-C36, (l) TP-C37, (m) TP-C38, (n) TP-C39, (o) TP-C41, (p) TP-C42, (q) TP-C43, (r) TP-C44, (s) TP-G45, (t) TP-G47, (u) TP-G48, (v) TP-G49 在PDA上的表现。