利用绿色辅助提取技术从印度尼西亚红树Sonneratia alba的树皮中提取抗氧化代谢物，并通过LC–HRMS和化学计量分析技术进行验证

《Current Research in Green and Sustainable Chemistry》：Green-Assisted Extraction Strategies for Antioxidant Metabolites from Indonesian Mangrove Sonneratia alba Stem Bark Supported by LC–HRMS and Chemometric Analysis

　　马赫米亚·马赫米亚 | 马尔迪·桑托索 | 阿里夫·法德兰
印度尼西亚苏拉巴亚十月十日技术学院科学与数据分析学院化学系

**摘要**
Sonneratia alba是一种研究不足的红树林物种，具有作为可持续抗氧化生物活性代谢物来源的巨大潜力。本研究旨在比较传统提取方法（浸渍法（ME）和索氏提取法（SE）与绿色技术（如超声波辅助提取法（UAE）和微波辅助提取法（MAE）对S. alba茎皮提取物的产量、总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）和抗氧化活性的影响。抗氧化潜力通过DPPH和ABTS测定法进行评估，提取物的化学多样性通过液相色谱-高分辨率质谱（LC–HRMS）谱图、衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR–FTIR）和多变量化学计量分析进行描述。不同提取方法之间存在显著差异（p < 0.05）。在所有方法中，MAE的提取产量最高（25.95% w/w），但在富含酚类的提取物中，UAE显示出最高的TPC（338.54 mg GAE/g），并且UAE提取物中的黄酮含量也显著较高（11.63 mg QE/g）。UAE还在DPPH和ABTS测定法中表现出最高的抗氧化活性，其IC50值最低。化学计量研究成功区分了不同提取物的化学特性，并强调了抗氧化活性、TPC、TFC和提取产量之间的高度相关性。根据LC–HRMS数据，主要的抗氧化代谢物包括生物碱、三萜类、黄酮类和酚酸。总体而言，40°C下加热30分钟的UAE方法被认为是从S. alba中回收抗氧化代谢物的有效且环保的方法，这突显了红树林生物资源在制药和营养保健品领域的潜在应用价值。

**1. 引言**
Sonneratia红树林主要分布在热带和亚热带地区。作为真正的红树林物种，Sonneratia既生长在沉积区，也生长在受盐度梯度影响的区域。这些极端的环境条件促使Sonneratia产生独特的次生代谢物。据Liu [1]报道，Sonneratia物种在中国被认定为传统医学和烹饪原料的宝贵来源。该属植物含有多种具有抗菌、抗糖尿病、保肝、抗氧化和抗肿瘤作用的生物活性化合物。在印度尼西亚，广阔的红树林生态系统是世界上主要的沿海生物多样性热点之一，Sonneratia物种广泛分布于沿海地区。赤道气候影响其代谢特征，表明不同生长区域的次生代谢物水平和组成可能存在差异。
S. alba是一种在印度尼西亚广泛栽培的红树林物种，其形态特征包括倒卵形叶片、苹果状果实和钝圆锥形气生根[2][3]。在东努沙登加拉的库庞，当地社区利用S. alba的果实（当地称为bo’ak）制作糖浆，其叶片和根茎则用于药用及作为槟榔的替代品[4]。传统上，印度尼西亚沿海居民用该物种治疗伤口和腹泻、驱蚊以及退烧[4][5]。在印度，S. alba的根、树皮、果实和叶片等多种部位被用于传统医学，用于治疗麻风病、疖子、象皮病和痢疾[6][7]。S. alba的治疗效果归因于其不同植物器官中广泛分布的次生代谢物。

**2. 方法**
**2.1. 植物材料**
2024年2月，在印度尼西亚东努沙登加拉马乌梅雷市的绿色红树林中采集了S. alba的茎皮（坐标：8°36'30.6"S 122°12'47.9"E，图1）。该物种由Airlangga大学渔业与海洋科学系的Veryl Hasan博士进行分类鉴定和验证。采集的标本编号为01/ULT/UA.FPK/01/2024。采集的茎皮在40°C下干燥后粉碎成细粉（100目），并在室温下保存以待进一步提取。

**2.2. 化学品和试剂**
本研究中使用的所有化学品和溶剂均为分析级，无需进一步纯化。没食子酸（≥98%纯度）、乙醇（96%）、乙酸钠（CH3COONa）、Folin–Ciocalteu酚试剂、碳酸钠（Na2CO3）和抗坏血酸购自德国达姆施塔特的Merck公司。三氯化铝（AlCl3，≥99%纯度）、2,2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH）、硫酸亚铁（FeSO4）、2,2′-偶氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）、Trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸）和槲皮素购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。

**2.3. 提取实验**
S. alba的茎皮采用四种不同的技术进行提取：索氏提取法（SE）、浸渍法（ME）、微波辅助提取法（MAE）和超声波辅助提取法（UAE）。所有提取过程均使用乙醇（96%）作为溶剂，每个过程重复三次。

**2.3.1. 索氏提取法（SE）**
索氏提取法（SE）按照Bampouli [14]的方法进行，略有修改。5克干燥的S. alba茎皮粉末用96%乙醇以1:20（w/v）的比例进行提取，提取过程在50°C下进行6小时，重复两次以确保完全提取。合并后的提取物在低于50°C的旋转真空蒸发器中减压浓缩至获得粘稠残渣。

**2.3.2. 浸渍法（ME）**
浸渍法（ME）在室温（约30°C）下进行72小时，按照Rafi [15]的方法进行，略有修改。5克干燥的S. alba茎皮粉末用96%乙醇以1:20（w/v）的比例进行浸渍，期间偶尔搅拌以促进溶剂渗透和代谢物扩散。提取后，通过过滤分离溶剂和残渣，然后在低于50°C的旋转真空蒸发器中减压浓缩至获得粘稠提取物。

**2.3.3. 微波辅助提取法（MAE）**
微波辅助提取法（MAE）使用中国制造的Sanken MO-200 BK微波装置进行，操作参数为220 V和50 Hz。5克干燥的S. alba茎皮粉末用96%乙醇以1:20（w/v）的比例进行提取，提取时间为1分钟，温度保持在50°C。提取后的混合物在3500 rpm下离心10分钟以去除不溶性物质，然后过滤。滤液在低于50°C的旋转真空蒸发器中减压浓缩至获得粘稠提取物。

**2.3.4. 超声波辅助提取法（UAE）**
超声波辅助提取法（UAE）在带有固定频率40 kHz的超声波清洗器（Ultrasonic Cleaner，型号TH-20AXN，中国）中进行，略有修改。5克干燥的S. alba茎皮粉末用96%乙醇以1:20（w/v）的比例进行提取，提取时间为30分钟。提取后的混合物在3500 rpm下离心10分钟以去除固体残留物，然后过滤。滤液在低于50°C的旋转真空蒸发器中减压浓缩至获得粘稠提取物。

**2.4. 总酚含量（TPC）**
使用Sonar和Rathod [9]改进的Folin–Ciocalteu（FC）方法测定不同提取方法（ME、SE、MAE和UAE）获得的S. alba茎皮提取物的总酚含量（TPC）。具体步骤为：将0.5 mL提取物溶液（乙醇浓度1000 ppm）与0.5 mL Folin–Ciocalteu试剂混合，静置5分钟；然后加入2 mL 7.5%（w/v）碳酸钠溶液，室温下孵育1小时。使用UV–可见光分光光度计在765 nm处测量吸光度。以没食子酸为标准品，建立浓度范围为5至40 ppm的校准曲线。结果以每克提取物中的没食子酸当量毫克数（mg GAE/g提取物）表示。

**2.5. 总黄酮含量（TFC）**
使用Sonar和Rathod [9]改进的颜色测定法测定不同提取方法获得的S. alba茎皮提取物的总黄酮含量（TFC）。具体步骤为：将0.5 mL提取物溶液（乙醇浓度1000 ppm）与0.5 mL 2%（w/v）氯化铝（AlCl3）溶液混合，室温下孵育1小时，然后使用UV–可见光分光光度计在415 nm处测量吸光度。以槲皮素为标准品，建立浓度范围为2.5至20 ppm的校准曲线。TFC以每克提取物中的槲皮素当量毫克数（mg QE/g提取物）表示。

**2.6. DPPH自由基清除活性**
根据Darvishzadeh和Orsat [16]的方法，使用2,2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH；Sigma–Aldrich）测定S. alba提取物的抗氧化活性。将每种提取物溶解在乙醇中至浓度为100 μg/mL，取0.1 mL稀释后的提取物与3.9 mL DPPH溶液（6.08 × 10-5 M）混合，在室温下避光孵育15分钟。含有DPPH的乙醇作为对照组，槲皮素作为参考标准品。使用UV–可见光分光光度计（KLAB Double Beam Optizen Alpha）在517 nm处测量吸光度，计算自由基清除活性。

**2.7. ABTS自由基清除能力**
根据Pourshoaib [17]的方法，修改后测定S. alba提取物的ABTS+（2,2′-偶氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基清除能力。ABTS+储备液通过将7 mM ABTS与140 mM过硫酸钾（K2S2O8）混合制备，并在暗处放置12–16小时生成ABTS+自由基阳离子。工作液通过乙醇稀释至736 nm处吸光度为0.700 ± 0.020。1.0毫升的提取物与2.0毫升的ABTS+工作溶液混合，在6分钟孵育后于736纳米处测量吸光度。从浓度-响应曲线中确定IC50值（μg/mL），该值表示清除50% ABTS+自由基所需的提取物浓度。

2.8. 减衰全反射-傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱分析
使用带有钻石ATR附件的Cary 630 FTIR光谱仪对提取物进行FTIR分析。将2-3毫克的提取物放置在钻石ATR晶体上，以获得与ATR晶体表面的最佳接触。提取物的FTIR光谱在4000-650 cm-1的扫描范围内记录，分辨率为8 cm-1，每个光谱进行32次扫描。在每次测量之前使用干净的晶体收集背景光谱，并自动从样品光谱中减去该数据。所有分析均在室温（25 ± 2 °C）下进行，每次测量之间用乙醇清洗样品。所有光谱处理（包括基线校正）均使用MicroLab FTIR软件（Agilent Technologies）完成。

2.9. 液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）代谢物分析
所有分析均使用Orbitrap高分辨率质谱仪进行，具体为Thermo Scientific? Q Exactive? Hybrid Quadrupole-Orbitrap?高分辨率质谱仪。分离是在Thermo Scientific? Accucore? Phenyl-Hexyl柱（100 mm × 2.1 mm ID × 2.6 μm）上进行的。流速设定为0.3 mL/min，溶剂系统由洗脱液（A）含0.1%甲酸的MS级水（H2O）和（B）含0.1%甲酸的MS级甲醇（CH3OH）组成。开发了一个25分钟的液相色谱（LC）梯度洗脱程序，以有效分离大部分成分。洗脱程序包括以下步骤：0.01分钟（95% A，5% B）；16分钟（10% A，90% B）；20分钟（10% A，90% B）；25分钟（95% A，5% B）。进样量为3 μL，柱温保持在40 °C。高分辨率质谱（HRMS）数据在66.7-1000 m/z的质量范围内采集。电喷雾离子化（ESI）条件如下：模式 - 正/负；喷雾电压 - 3.30 kV；毛细管温度 - 320 °C；辅助气体加热器温度 - 30 °C。氮气（N2）用作鞘气（32任意单位）、辅助气体（8任意单位）和扫描气体（4任意单位）。全MS的分辨率为70,000，dd-MS2的分辨率为17,600。通过将获得的MS/MS光谱（如有）与包含超过20,000种化合物的mzCloud数据库中的光谱进行比较，并在数据过滤后（https://www.mzcloud.org/Stats），我们识别出潜在的化合物。如果收集到的光谱与数据库光谱的相似度超过80%，则认为这些化合物为阳性鉴定，并报告其相关的m/z值和保留时间。

2.10. 统计分析
实验数据的统计分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验，以在95%的置信水平（p < 0.05）确定不同提取方法之间的显著差异。所有统计计算均使用Minitab?版本18（Minitab Inc., State College, PA, USA）进行。主成分分析（PCA）用于评估通过不同提取技术获得的提取物的FTIR光谱特征，有助于可视化化学变异性和聚类模式。PCA使用OriginPro? 2025b软件（OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA）进行。

3. 结果与讨论
3.1. 提取收率
对S. alba茎皮的四种提取技术进行了比较评估，结果发现提取收率存在显著差异，如表1和图2A所示。在评估的四种提取方法中，MAE在1分钟、700瓦的条件下产生了最高的收率（25.95±0.05 %（w/w）和最高的效率。MAE的优异性能归因于微波辐射产生的快速均匀局部加热，这促进了细胞壁的破坏并增强了溶剂在植物组织中的渗透。这种机制有助于释放结合的植物成分，特别是酚类和黄酮类化合物。所有方法均使用乙醇（96%）作为提取溶剂，因为它已被证明能有效溶解极性和非极性化合物，如酚类和黄酮类。此外，乙醇因其低毒性、高安全性和环境友好性而被认为是绿色溶剂。

表1. 四种提取方法下S. alba茎皮的参数
方法 | 样品重量（g） | % 收率 | TPC（mg GAE/g） | TFC（mg QE/g） | SE
--- | --- | --- | --- | --- | ---
5.0 | 10.30±1.25 | c | 243.67±28.55 | ab |
11.6 | 3.63±0.01 | a | 158.42±25.77 | b | 6.63±0.17 | c |
5.0 | 12.97±0.11 | b | 260.54±25.41 | a | 7.16±0.05 | a |
5.0 | 12.95±0.05 | a | 338.54±59.60 | a | 11.66±0.15 | aa,b,c |
单因素方差分析，Tukey检验（p<0.05）。数据表示为三次平行测量的平均值±标准差（n=3）。统计显著性在p < 0.05时通过Tukey检验确定。

3.2. 总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）
使用Folin–Ciocalteu测定法定量确定了S. alba茎皮的总酚含量（TPC），并以每克干提取物中的没食子酸当量（mg GAE）表示。干提取物的TPC值从158.00到338.54 mg GAE/g不等，表明酚含量受所用提取方法的显著影响。如表1和图2B所示，采用环保技术的提取方法（如UAE和MAE）产生的酚浓度高于ME和SE。在所有方法中，UAE的TPC最高，与其他方法相比有统计学上的显著差异（p < 0.05）。UAE的优异效率归因于超声空化的机械效应，这促进了细胞壁的破坏并有助于酚类成分释放到溶剂中。如图2B所示，UAE对多酚类化合物的亲和力强于MAE和SE。尽管Folin–Ciocalteu测定法可能对非酚类还原物质也有响应，但本研究通过化学计量学区分和LC-HRMS分析对其进行了补充，以加强对抗氧化活性的解释。

3.3. 抗氧化活性
通过DPPH和ABTS测定法评估了四种提取方法获得的S. alba茎皮提取物的抗氧化活性。这两种测定方法均通过涉及氢原子转移（HAT）和单电子转移（SET）的混合模式反应机制进行，其特征是可观察到的颜色变化。在DPPH测定中，如表2和图3A所示，抗氧化化合物与稳定的DPPH自由基反应，导致颜色从紫色变为黄色（517 nm）。所有提取物均表现出强烈的自由基清除活性，IC50值介于21.66至59.36 μg/mL之间。在四种提取方法中，UAE提取物的抗氧化活性最强，这可能归因于其较高的TPC和TFC含量。值得注意的是，S. alba茎皮的抗氧化活性高于S. × urama茎皮，后者的活性据报道为48.38 μmol TE/g。

表2. 四种提取方法下S. alba茎皮的自由基清除能力
方法 | IC50 ABTS（μg/mL） | IC50 DPPH（μg/mL）
--- | --- | ---
SE | 5.70±0.58 | b | 48.29±0.48 |
ME | 12.50±0.02 | a | 48.25±1.07 |
MAE | 11.12±0.14 | d | 59.36±2.67 |
UAE | 10.87±0.41 | c | 21.66±2.57 |
槲皮素 | 23.24±1.78 | b | 9.76±1.76 |
Trolox | 36.42±0.39 | a-a,b,c,d |
单因素方差分析，Tukey检验（p<0.05）。数据表示为三次平行测量的平均值±标准差（n=3）。统计显著性在p < 0.05时通过Tukey检验确定。

3.4. S. alba茎皮的FTIR光谱特征
ATR-FTIR数据在图4和表3中呈现。叠加光谱显示四种提取方法之间的峰锐度和强度存在显著差异。绿色提取技术产生的光谱具有更明显的吸收带，尽管这些差异在较宽的光谱范围内有所减弱。在3332 cm-1处观察到的宽吸收带对应于O–H伸缩振动，这是酚类、醇类和羧酸中常见的羟基特征。2931 cm-1和2845 cm-1处的峰归因于烷基的C–H伸缩振动。1716 cm-1处的显著吸收带位于光谱的第三区域，是醛类、酮类和羧酸中C=O伸缩振动的特征。此外，1606 cm-1处的峰对应于芳香族的C=C伸缩振动。在指纹区域，1203 cm-1和1022 cm-1处的吸收带分别对应于C–O–C醚键和烯烃的C–H弯曲。这些官能团特征共同表明提取物中含有黄酮类、生物碱、萜类、甾醇和多酚等次级代谢物。**ATR-FTIR光谱分析S. alba树皮提取物**

- **频率范围（cm-1）**
- **收集样品的FTIR光谱**
- **相关活性位点**
- **疑似官能团**

| 波段 | 值 |
|---------------|-----------------|
| 3600-3200 | 332 | 3.70 |
| 331.88 | 330 | 9.98 |
| 327 | 3.67 |
| H键连接的O-H | |
| 醇类、酚类（酚酸、黄酮类和醇基） | 3200-3000 | 319 | 1.01 |
| 323 | 3.33 | 319 | 9.28 |
| 323 | 3.77 |
| sp2 C-H | |
| 烯烃、芳香环 | 3000-2850 | 292 | 6.82 |
| 292 | 3.18 | 329 | 2.56 |
| 292 | 3.18 | 323 |
| 不对称sp3 C-H | |
| 烃（CH3、CH2、多酚、萜类、黄酮类） | 1750-1650 | 171 | 7.08 |
| C=O | |
| 醛类、酮类、羧酸、酯类、酰胺 | 1600-1400 | 160 | 3.94 |
| 160 | 3.61 |
| C=C | |
| 烯烃、芳香环 | 1300-1180 | 119 | 9.34 |
| 118 | 9.06 |
| 119 | 2.37 |
| C-O | |
| 醇类、酯类、羧酸 | 1100-700 | 103 | 6.53 |
| 103 | 3.51 |
| 103 | 1.97 |
| 103 | 1.23 |
| C-H平面外弯曲 | |
| 烯烃、芳香环 | 3.4 |

**基于PCA和FTIR的化学计量分析**

对采用四种提取技术（浸出（ME）、索氏提取（SE）、超声波辅助提取（UAE）和微波辅助提取（MAE）获得的S. alba树皮提取物的FTIR光谱进行了主成分分析（PCA），以评估其化学成分的变化（图5）。在化学计量分析之前，对FTIR光谱进行了基线校正和向量归一化处理。PCA使用了自动缩放方法，前两个主成分（PC1和PC2）解释了超过85%的总方差，用于样品区分。通过UAE和MAE获得的提取物聚类紧密，反映了它们化学成分的相似性，这可能是由于能量辅助提取增强了质量传递和细胞破坏效果。相比之下，ME形成了一个独立的簇，与其较低的极性生物活性代谢物提取效率和较慢的提取动力学一致。SE位于ME和MAE之间，表明其提取效率介于传统方法和绿色提取方法之间。

**下载：** 下载高分辨率图像（560KB）
**下载：** 下载全尺寸图像

**图5. 使用ATR-FTIR对S. alba树皮提取物进行的化学计量分析**
- （a）加载图
- （b）得分图
- （c）参考光谱加载图

**3.4.3. 热图和树状图分析**

基于提取参数（%产量、TPC、TFC、DPPH和ABTS）的热图和树状图分析（图6）显示了两个不同的组：**组1**包括UAE、MAE和SE，**组2**仅由ME组成。在所有提取方法中，UAE表现出最佳的整体性能，产出了最高的总酚含量（>322 mg GAE/g干提取物），并在DPPH和ABTS测定中显示出优异的抗氧化能力（IC50 < 50 μg/mL）。提取物中的TPC和TFC差异与抗氧化活性一致。此外，红树林中的氧化应激导致次生代谢物的产生，受遗传多样性、位置、土壤类型和气候因素等多种因素的影响[38]。这些发现证实UAE是从S. alba树皮中提取抗氧化代谢物的最有效技术，与PCA结果和先前支持超声波辅助绿色提取效率的研究一致。此外，热图强调了UAE相对于ME和SE的优越提取效率，体现在生物活性化合物的更高回收率上。MAE也表现出较高的提取性能，尽管略低于UAE，可能是由于在微波处理过程中部分热不稳定化合物的降解。

**下载：** 下载高分辨率图像（175KB）
**下载：** 下载全尺寸图像

**图6. 各种S. alba树皮提取方法的热图和树状图**

**3.4.4. 确定最佳提取方法**

结合PCA结果、热图聚类和FTIR光谱分析，确认UAE是S. alba树皮最有效且环境可持续的绿色提取技术。UAE产生的提取物具有最高的总酚含量和最强的抗氧化活性，这一点通过FTIR光谱特征中的酚类O–H和芳香C=C官能团得到证实。UAE的优越效率可归因于超声波空化现象，该现象诱导微泡形成和破裂，导致植物细胞壁的广泛破坏，溶剂渗透增强，以及细胞内代谢物的有效释放，同时热降解最小。相比之下，ME的提取物回收率和抗氧化活性最低，在PCA和热图分析中形成了一个独立的簇，反映了其有限的提取效率。SE和MAE表现出中等性能；然而，UAE在重现性、选择性和抗氧化植物化学物质的回收率方面超过了所有方法。这些发现验证了UAE是进行代谢组学分析和以生物活性为导向的红树林代谢物提取的最有效和可持续方法。

尽管微波辅助提取提供了更高的产量，但与介电加热相关的局部温度升高可能导致热不稳定抗氧化代谢物的部分降解[17]。相比之下，超声波辅助提取在较低的整体温度下操作，使得负责自由基清除的酚类化合物的选择性回收更加有效。这种机制上的差异解释了为什么UAE提取物的抗氧化性能更好，尽管其提取产量相对较低。

**3.5. 使用LC-HRMST对UAE最佳提取方法中的代谢物进行表征**

使用液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMST）对S. alba树皮提取物的化学成分进行了分析。分析采用非靶向MS/MS模式，全面分析了提取物中的次生代谢物。图7展示了使用最有效提取方法UAE获得的S. alba树皮提取物的总离子色谱图（TIC）。LC-HRMMS结果共检测到183种化合物，其中35种的相似度指数大于80%，表明光谱置信度很高。表4总结了这些化合物的保留时间、准确质量（m/z）值和MS/MS碎片模式。这些发现证明了S. alba中代谢物的化学多样性，进一步支持了UAE方法的优越提取效率。

**下载：** 下载高分辨率图像（914KB）
**下载：** 下载全尺寸图像

**图7. 使用UAE提取的S. alba树皮提取物的LC-HRMS总离子色谱图（TIC）**

**表4. 使用LC-HRMS在正离子和负离子模式下鉴定的S. alba树皮中的代谢物**

| 编号 | 化合物名称 | 公式 | 计算分子量 | 注释 | DeltaMass [ppm] | MS 1和MS 2 [M+H]+1 | 最佳匹配类别 |
|------|-----------------|-----------------|-------------|-------------|----------------|------------------------|
| S1 | (-)-threo-Propylphenidate | C16H23NO2 | 261.17 | 217-2.73 | 262.17 | 499.5 |
| S2 | Bis(2-ethylhexyl) phthalate | C24H38O4 | 390.27 | 2-2.55 | 391.28 | 42; 227.83 |
| S3 | Ethylphenidate | C15H21NO2 | 247.15 | 248.16 | 12; 198.55 | 309; 128.10 |
| S4 | 9-Oxo-10(E).12(E)-octadecadienoic acid | C18H30O3 | 294.21 | 189.6 | 295.22 | 757; 277.21 |
| S5 | Betaine | C5H11NO2 | 117.07 | 96-0.17 | 118.08 | 592; 72.08 |
| S6 | 1-Stearoylglycerol | C21H42O4 | 358.30 | 244.24 | 359.27 | 341.30 |
| S7 | Choline | C5H13NO2 | 103.09 | 979.07 | 104.10 | 126; 60.08 |
| S8 | Methyl palmitate | C17H34O2 | 270.25 | 63-0.92 | 271.26 | 909; 135 |
| S9 | cis-12-Octadecenoic acid methyl ester | C19H36O2 | 296.27 | 297.27 | 265.25 | 229; 184 |
| S10 | NP-00369 | C29H46O4 | 458.33 | 9-1.56 | 459.34 | 650; 395.32 |
| S11 | Mono(2-ethylhexyl) phthalate (MEHP) | C16H22O4 | 278.15 | 13-1.82 | 279.15 | 190.04 |
| S12 | Ethyl palmitoleate | C18H34O2 | 282.25 | 72-0.58 | 283.28 | 247.24 |
| S13 | NP-00159 | C16H30O4 | 286.21 | 16-0.86 | 287.22 | 137; 223.20 |
| S14 | Ellagic acid | C14H6O8 | 302.00 | -0.89 | 303.01 | 309; 275.01 |
| S15 | Ferulic acid | C10H10O4 | 194.05 | 194.05 | 195.10 |
| S16 | 6-Tetramethyl-1-piperidinol (TEMPO) | C9H19NO1 | 157.14 | 5-0.74 | 158.15 | 159 |
| S17 | N, N-Diethyldodecanamide | C16H33NO2 | 55.25 | 88-1.32 | 256.26 | 253; 279 |
| S18 | α-Eleostearic acid | C18H30O2 | 278.22 | 1.37 | 279.23 | 166 |
| S19 | L (-)-Carnitine | C7H15NO3 | 161.10 | 5-1.21 | 162.11 | 183 |
| S20 | NP-00035 | C15H14O7 | 306.07 | 353-1.37 | 307.08 | 81; 295.66 |
| S21 | Quinine | C20H24N2O2 | 232.18 | 15-1.93 | 251.17 | 133 |
| S22 | Vanillin | C8H8O3 | 152.04 | 72-0.97 | 153.05 | 446 |
| S23 | Methyl isonicotinate | C7H7NO2 | 137.04 | 74-1.62 | 138.05 | 149 |
| S24 | Ursolic acid | C22H43NO3 | 283.28 | 2.02 | 284.29 | 243.23 |
| S25 | Stearamide | C18H37NO2 | 286.27 | 2.02 | 284.29 | 243.23 |
| S26 | Hydroxybenzaldehyde | C7H6O2 | 122.03 | 678-0.03 | 123.04 | 95.04 |
| S27 | Quinine | C20H24N2O2 | 232.18 | 15-1.93 | 251.17 | 133 |
| S28 | Vanillin | C8H8O3 | 152.04 | 72-0.97 | 153.05 | 446 |
| S29 | Methyl isonicotinate | C7H7NO2 | 137.04 | 74-1.62 | 138.05 | 149 |
| S30 | Erucamide | C22H43NO3 | 286.27 | 2.28 | 284.29 | 243.23 |
| S31 | Stearamide | C18H37NO2 | 286.27 | 2.02 | 284.29 | 243.23 |
| S32 | 4-Hydroxybenzaldehyde | C7H6O2 | 122.03 | 678-0.03 | 123.04 | 95.04 |
| S33 | Ferulic acid | C10H10O4 | 194.05 | 194.05 | 195.10 |
| S34 | 6-Tetramethyl-1-piperidinol (TEMPO) | C9H19NO1 | 157.14 | 5-0.74 | 158.15 | 159 |
| S35 | N, N-Diethyldodecanamide | C16H33NO2 | 55.25 | 88-1.32 | 256.26 | 238 |
| S36 | α-Eleostearic acid | C18H30O2 | 278.22 | 1.37 | 279.23 | 166 |
| S37 | Betaine | C5H11NO2 | 117.07 | 96-0.17 | 118.08 | 592; 84.08 |
| S38 | Methyl palmitate | C17H34O2 | 270.25 | 63