使用Orbitrap质谱仪对植物脂质质谱碎片进行同位素分析的方法学开发与理论框架

《ACS Omega》：Methodological Development and Theoretical Framework for the Isotopic Analysis of Mass Spectral Fragments of Phytol Using Orbitrap Mass Spectrometry

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傅里叶变换轨道阱质谱技术的最新进展使得能够通过解析分子片段中的同位素异构体，对天然丰度下的有机分子进行精确的位置特异性同位素分析（PSIA）。在这里，我们介绍了一种基于轨道阱的新方法，用于在天然丰度下解析长链非极性脂质中的分子内13C同位素模式。该方法使用大气压化学电离（APCI）和更高能量的碰撞解离（HCD）进行碎片化，在45分钟内对同时测量的26个碎片离子实现约3‰的分析精度，分析时仅需<1.2 μg的样品。我们以植醇为例来演示这种方法，植醇是一种普遍存在的长链支链异戊二烯醇，主要来源于叶绿素分子的侧链，同时也是沉积物中普遍发现的化石脂质植烷的生物合成前体。我们的结果揭示了来自不同生物合成途径的植醇碎片离子在δ13C值上的系统差异，这表明植醇在分子内部存在13C异质性。这种方法为追踪植醇及其他异戊二烯脂质的代谢和环境历史提供了一种可靠的同位素指纹工具。

1. 引言
气相色谱-燃烧同位素比质谱（GC/C/IRMS）系统的发展使得能够进行化合物特异性同位素分析（CSIA），这是一种重要的方法学进步，因为它允许在复杂混合物中对单个有机化合物进行同位素表征。有机化合物的稳定同位素组成分析已成为多个科学领域的强大工具，为了解有机分子的起源和生物地球化学转化提供了关键见解。CSIA最初是为研究脂质生物标志物（即分子化石）而开发的，从而能够重建其沉积时的生物来源、环境条件及生物地球化学过程。

一种具有重大地球化学意义的生物标志物脂质是植烷，它在古老的沉积物中也有发现（年龄可达10亿年）。植烷主要来源于植醇，植醇是一种普遍存在的醇类，它可以与叶绿素色素形成酯类；不过植烷也可以来源于古菌特有的膜脂质古醇。植醇和其他异戊二烯类化合物通过两种不同的、进化上高度保守的途径合成：甲基赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径和甲瓦龙酸途径（MVA）。（4）古菌仅通过MVA途径合成异戊二烯类化合物，而细菌使用MEP途径，真核生物可能同时拥有这两种途径（5）（补充图I）。因此，植醇及其成岩衍生物植烷的稳定碳同位素组成被广泛用于推断生物来源和古环境条件。例如，Freeman等人（2）通过分析梅塞尔油母质中的植烷来推断其光合来源。此外，Witkowski等人（6）利用植烷的分子平均δ13C值重建了显生宙时期的海洋初级生产力和大气pCO2浓度。

然而，CSIA通常无法明确区分来自不同生物合成途径或来源生物的贡献，也无法解释与碳固定机制和环境因素相关的变异性。这一限制源于CSIA需要将分子转化为简单气体，从而平均了化合物中所有位置的同位素组成。然而，同位素分馏效应作用于分子内的特定碳位置。有机化合物的稳定碳同位素组成由三个关键因素决定：1）它们所来源的碳基底的同位素性质；2）与其合成相关的分馏效应；3）在可逆和不可逆生物合成步骤中碳库的相对分配。不同的生物合成途径利用不同的前体库和反应序列，导致分子内特定碳位置的13C同位素优先富集或耗尽。因此，有机化合物的分子内同位素结构编码了关于其生物合成起源和所经历的化学转化的宝贵信息。

位置特异性同位素分析（PSIA）旨在通过解析分子内各个位置的同位素变化来克服这一限制，从而提高稳定同位素测量的诊断能力。迄今为止，唯一关于植醇的PSIA研究是由Schouten等人（7）进行的。在那项研究中，使用化学降解技术表明，来自多种光合生物的植醇的两个末端（C1和C2）碳原子比其余碳原子的平均δ13C富集了超过20‰。这种富集主要归因于在形成植醇和其他异戊二烯类衍生物过程中C1和可能的C2碳原子的强烈分馏效应。由于使用化学降解技术分析的碳原子位置有限，因此未能明确观察到与MEP或MVA生物合成途径相关的同位素效应。

最近，利用傅里叶变换轨道阱质谱技术出现了新的分子内同位素比分析方法。（8,9）轨道阱出色的分辨能力使得能够在纳摩尔浓度的样品中检测到分子的独特同位素异构体。多项研究已经证明，轨道阱仪器能够以约1‰的精度量化天然丰度下氨基酸中的位置特异性同位素比（<10纳摩尔），并且对于不同有机和无机样品以及纳摩尔范围内的样品大小，轨道阱分析能够达到约1‰或更好的同位素精度。（8）例如，对默奇森陨石中丙氨酸的PSIA揭示了其星际合成机制，并构建了相关前生物重要有机化合物的相对同位素丰度预测模型。（13）

到目前为止，基于轨道阱的分子内同位素比质谱（Orbitrap-IRMS）分析技术主要应用于氨基酸和氧阴离子（14,15），这些是相对较小的功能性分子，由多种元素组成，产生具有诊断性的质谱碎片和独特的同位素异构体。据我们所知，这项技术很少用于研究非极性长链烷基化合物的分子内同位素比（例如（16,17））。最近，我们结合气相色谱和轨道阱质谱技术分析了植烷的一个85 m/z（C6H14）片段的稳定碳同位素组成（Tome?ková ?ztoprak等人，未发表结果）。（18）我们发现来自蓝细菌植醇（MEP途径）和古醇（MVA途径）的植烷85 m/z片段之间存在显著的碳同位素差异。这两种植烷分析物的85 m/z片段之间的同位素差异与其分子平均δ13C值相同，这表明85 m/z片段要么来源于所有碳原子的混合物（即通过多次电离过程中的碎片化和缩合导致碳位置重新排列），要么植醇的分子平均同位素信号主要反映了末端C1和C2碳原子的13C富集，正如Schouten等人（8）早先推测的那样。

在这里，我们开发了一种分析方法，通过测量通过大气压化学电离（APCI）与多级轨道阱质谱联用的诊断性质量片段的同位素比来解析植醇中的分子内同位素特征。选择由13C、2H或17O取代的单个植醇同位素异构体形成的质子化分子离子（“M+1”）作为四极杆中的前体离子，并随后通过更高能量的碰撞解离（HCD）进行碎片化。生成的碎片离子的同位素丰度被量化，用于确定来自不同生物合成途径的植醇分析物的位置特异性同位素特征。我们系统地测试和优化了电离源参数（气体流量、温度、电压）、溶剂组成、分析物浓度和注入时间，以确保信号的稳定性和重现性，并确定了包括检测限在内的分析限制。还优化了质谱仪的仪器参数，包括质量分辨率、自动增益控制（AGC）目标和HCD能量，以最大化离子产率和同位素精度。我们还开发了数据处理和质量控制方法，包括对采集过程中间歇性缺失的离子束进行校正。最后，我们证明了植醇中存在非随机的分子内同位素分布，并为植醇及其他长链生物标志物化合物的多片段同位素异构体的比较分析建立了参考框架。

2. 材料与方法
2.1. 样品
实验中使用的植醇为市售产品（“工业植醇”；CAS 7541–49–3；纯度≥97%；Sigma-Aldrich）。此外，还使用来自光合蓝细菌Anacystis nidulans（CAS 479–61–8；Sigma-Aldrich）的纯叶绿素a以及从当地超市购买的冷冻菠菜按以下方法制备植醇。

2.2. 提取
所有用于脂质提取的玻璃器和器具以及后续步骤均用二氯甲烷（DCM）和甲醇进行了预燃烧或溶剂清洗。所有提取及后续制备和分析步骤均使用LC-MS级或更高级别的溶剂（CHROMASOLV，Honeywell，Seelze，德国；或HiPerSolv Chromanorm，VWR International，Leuven，比利时）。

叶绿素通过DCM:MeOH [2:1 (v:v)]的重复超声溶剂提取法从菠菜中提取。菠菜中的干总脂质提取物（TLE）以及市售的蓝细菌叶绿素a通过与1 N KOH在甲醇（MeOH）中回流2小时（80 °C）进行皂化，释放出叶绿素中的植醇部分。皂化后，向每个样品中加入2 mL Milli-Q水，并用正己烷进行液-液提取以分离中性组分。含有植醇的水相用盐酸（pH < 2）酸化，然后用DCM反复提取。合并的DCM提取物经活化氧化铝柱分离成极性递增的三个组分，植醇收集在最终的DCM:MeOH [1:1 (v:v)]组分中。

2.3. 分离
菠菜中的含植醇组分进一步通过半制备高效液相色谱（HPLC）进行纯化，方法参考Smittenberg等人（2002）的方法。简要来说，使用配备XBridge BEH C18 OBD Prep柱（5 μm，130?，10 mm × 250 mm，Waters Corp）的Agilent 1260 Infinity II UHPLC系统进行分离。每次制备运行最多注入5 mg溶解在200 μl MeOH中的材料。使用溶剂A（H2O:MeOH [15:85 (v:v)])到溶剂B（异丙醇:MeOH [1:1 (v:v)])的梯度进行洗脱，流速为3 mL/min。洗脱梯度从5% B开始，持续3分钟；随后在3到12分钟之间将B的比例增加到60%，然后在12到32分钟之间增加到81%。柱子用100% B洗洗23分钟，并在20分钟内重新平衡到起始条件。洗脱液使用Foxy R1 Fraction Collector（Teledyne ISCO，Lincoln，NE，美国）以1分钟的时间间隔收集，随后通过流动注射分析（FIA）检测植醇含量。含有超过5 mg材料的样品多次注入并合并到相同的收集管中。

2.4. 流动注射分析
含植醇的组分通过配备Ion Max源（ThermoFisher Scientific，Bremen，德国）的Q Exactive plus四极杆-轨道阱HRMS进行FIA分析，该源连接到一个Agilent 1290 UHPLC上，为探针提供0.1 mL/min的100% MeOH总流量。轨道阱系统的设置详见第3.1节和第3.2节。将每个收集的10 μL组分注入连接到六通阀的不锈钢环路中。总共八个含植醇的组分通过MS（1）模式下质量295.3 m/z [M-2+H]+离子的存在被识别并合并浓缩。

2.5. 定量
植醇样品的纯度通过Witkowski等人（2018）描述的气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）方法进行检测和定量。简要来说，Agilent 6890N GC-FID配备了一个CP Sil-5熔融石英毛细管柱（50 m × 0.32 mm，0.12 μm膜厚度），以氦气作为载气。GC最初设定为70 °C，随后以20 °C/min的速率升温至200 °C，然后以4 °C/min的速率升温至320 °C并保持10分钟。目标植醇峰在约19分钟时流出。通过共注入使用N,O-双(三甲硅基)三氟乙酰胺（BSTFA）和吡啶硅化的样品子部分，并加入5 μg内标物，相对于内标物（2-壬酮）定量总植醇含量。

2.6. δ13C和δ2H分子平均同位素比测量
为了进行植醇的分子平均稳定同位素比分析，使用已知同位素组成的BSTFA和吡啶对样品进行硅化处理。硅化的植醇是通过Thermo Trace GC（1310）与Thermo Delta V IRMS连接使用的，中间通过Isolink II进行数据传输，该系统配备了燃烧或高温转化反应器以及ConFlo IV。GC配备了CP Sil-5熔融石英毛细管柱（50 m × 0.32 mm，膜厚0.12 μm），并使用与GC-FID相同的温度程序进行操作。硅化植醇样品的δ13C值是相对于V-PDB标准计算的，通过与CO2参考气体（根据NBS-19校准）进行比较得出的。GC-C-IRMS的色谱性能每天通过含有n-烷烃和脂肪酸的内部分析标准样品进行检测，同时注入两种氘代n-烷烃以监测稳定同位素结果的质量。对于使用高温转化反应器（GC-HTC-IRMS）的氢同位素分析，每天会分析Mix B（A. Schimmelmann，印第安纳大学）样品以监控系统性能。我们的测量标准偏差是通过多次注入植醇确定的，δ13C的标准偏差为±0.56‰，δ2H的标准偏差为±1.3‰。植醇的δ值已经校正了在硅化过程中由TMS基团引入的碳和氢的同位素影响。

2.7. Orbitrap分析
我们的分析方法是使用Q Exactive plus四极杆-Orbitrap HRMS开发的，该仪器配备了Ion Max源，并通过注射泵连接到Agilent 1290 Infinity II UHPLC系统，该系统包括二元泵、自动进样器、柱温箱、脱气器和不锈钢压力限制器柱（均为Agilent产品，德国瓦尔德布龙）。在每次样品分析之间，会清洁离子源前端模块的部件，如离子屏蔽层、腔室和电晕放电针（如果适用），并且每天用MeOH清洁离子传输管。此外，在每次样品测量之前，还会在相同的仪器条件下运行15分钟的MeOH分析空白样品。最后，在每次测量后运行加热清洁序列，期间Orbitrap设置为APCI模式，并从UHPLC提供100 μL/min的MeOH流速。Orbitrap在以下条件下运行60分钟：鞘气22、辅助气4、扫描气0、探针温度500°C、毛细管温度400°C、S透镜50、放电电流2.5 μA。之后，系统切换到待机模式并冷却。质量校准每48小时使用Thermo Scientific Pierce LTQ Velos ESI Positive Calibration Solution进行，采用加热电喷雾离子化（HESI）探针。

所有样品测量都是在两个独立的分析会话中完成的，这些会话跨越多个连续的日子，并在相同的仪器条件下进行。工业植醇样品（STD）在每个测量日都会被分析，而蓝藻叶绿素-a（CHLA）和菠菜来源的植醇（SP）则在不同的会话中进行分析。第一个分析会话的顺序是STD/STD/CHLA/CHLA，第二个会话的顺序是STD/SP、STD/SP和STD/SP。在每次测量之间都会运行分析空白样品，并在每次测量后进行加热清洁序列（见上文）。

3. 分析方法开发
我们的分析方法是基于工业植醇样品开发的，用于下面描述的所有实验。通过调整Agilent 1290 Infinity II HPLC系统的注射泵和洗脱液流量来调节分析物浓度和流速。植醇是通过一个500 μL的密封注射器（1750 RN，Hamilton，内华达州里诺）引入的，该注射器通过T分流器连接到HPLC洗脱液线上。我们评估了植醇浓度、溶剂组成、离子化模式以及源条件和质谱设置，以实现稳定的离子化状态并获得广泛的碎片范围，这些内容将在后续章节中详细讨论。除了第2.7节中描述的彻底清洁程序外，所有样品测量之前都会先运行MeOH空白样品和简短的清洁过程，其中离子源会被加热到400°C并冷却至操作温度。当分析物浓度至少比检测到的浓度低三个数量级时，溶剂空白样品被认为是可接受的。

3.1. 离子化模式
首先，我们评估了HESI探针与APCI探针对于植醇的适用性。之前描述的LC-Orbitrap MS的同位素比测量应用使用了HESI探针，据报道其对各种大小的极性分子具有有利的离子化效率。然而，植醇是一种相对非极性的分子，类似的非极性生物标志物脂质已经成功地使用APCI作为离子化方法进行了分析。最初，工业植醇是使用HESI或APCI探针进行离子化的（均为ThermoFisher Scientific，德国不来梅）。我们评估了总离子电流（TIC）强度、喷雾稳定性以及从分析物在MS（1）模式下形成的分子离子的分布。在Orbitrap中，通过监测TIC和注射时间（IT）来评估喷雾稳定性，这些参数在稳定的离子化条件下保持不变（即TIC < 5% SD）。不稳定条件的特征是IT突然且不规则地降至零，通常伴随着TIC的突然峰值或波动。在使用HESI探针的试验中，植醇溶解在己烷:异丙醇（IPA）[99:1 (v:v)]或MeOH:IPA [1:1 (v:v)]中，并通过注射泵注入，样品随后在包含不同量MeOH、IPA、甲酸、NH3和H2O的LC系统流出物中进一步稀释。在MeOH:IPA [1:1 (v:v)]溶液中，以5 μL/min的流速注入植醇时获得了最高的TIC，同时并流195 μL/min的MeOH/H2O/甲酸/14.8 M NH3aq [85:15:0.12:0.04 (v:v)]。MS（1）质谱显示了多个分子离子加合物，特别是295 m/z [M-2+H]+、296 m/z [M-H2O+NH4]+、312 m/z [M+NH4]+和319 m/z [M+Na+H]+（图1）。这些不同加合物的相对强度在不同实验中变化很大，主要取决于溶剂的选择，尽管[M+NH4]+、[M-H2O+NH4]+、[M+Na+H]+和[M-2+H]+离子始终存在。重要的是，[M-2+H]+离子296.303 m/z的单一取代同位素峰与主要离子峰296.331 m/z [M+NH4]+的洗脱位置非常接近。无论如何，在较长的时间窗口（>10分钟）内获得任何加合物的稳定信号都是具有挑战性的。由于准确分析同位素化合物需要数十分钟的采集时间才能获得足够的精度，因此目标离子信号的稳定性被认为是极其重要的。

图1
图1. 使用A) HESI（MeOH 1:1 + NH3）和B) APCI（MeOH）生成的25 ng/min工业植醇的MS（1）质谱比较。绿色突出显示的是由植醇形成的离子，黄色显示的是其脱水产物。表格显示了带有元素组成的注释离子的分子结构。请注意，额外的双键位置未知，仅用于说明目的。

使用APCI探针时，在MeOH中以>5 ng/min的浓度注入植醇时获得了最高的离子产率和稳定的喷雾条件，探针设置如下：鞘气（N2）22、辅助气（N2）4、扫描气（N2）0、探针温度300°C、毛细管温度200°C、S透镜45、放电电流2.5 μA。当探针的总流量为60 μL/min（注射泵5 μL/min，HPLC流量55 μL/min）时，获得了最稳定的喷雾条件，适用于0.5 μg/mL至500 μg/mL的植醇浓度。使用APCI获得的总离子强度（约1 × 10^6）低于HESI（约1.7e6），表明离子化效率较低。然而，通过APCI获得的MS（1）质谱主要由295 m/z [M-2+H]+离子主导，即带有额外双键的植醇的质子加合物，以及其脱水产物277 m/z [M-4-H2O]+，还有质量为293 m/z [M-4+H]+和291 m/z [M-6+H]+的其他质子加合物的次要峰。296.303 m/z [M-2+H]++1离子的绝对强度与使用HESI源测量的相同离子相当（见图1），表明APCI在M+1同位素分析中没有劣势。目前尚不清楚为什么离子化会导致额外的双键引入，但Smittenberg等人（2002）在APCI MS分析植醇时也描述了类似的现象。此外，在使用植醇的氢化衍生物植醇醇、异植醇的额外实验中也观察到了这一现象，以及当植醇和异植醇溶解在MeOH、己烷、IPA和乙酸乙酯的各种混合物中时也是如此（数据未显示）。因此，似乎双键的引入是APCI离子化植醇和结构相似化合物的固有特征。尽管如此，我们认为这种额外的不饱和对我们实验来说并不重要，因为我们的主要兴趣是比较稳定碳同位素的性质。因此，在相同的条件下进行离子化应该使来自不同来源的植醇分析结果具有可比性。由于长期信号稳定性高，295 m/z处单一分子离子的显著性，以及没有主要离子与其单一取代同位素峰重叠，因此选择APCI作为M+1同位素分析的首选离子化方法。

3.2. 优化Orbitrap的M+1实验设置
在确定[M-2+H]+为植醇的代表目标离子后，我们通过测量由“M+1”同位素衍生物（即296.3 m/z离子）生成的质量片段的同位素比来探索其同位素结构，这些同位素衍生物包含了分子中任何位置的1个质量增加的同位素取代。为了有效排除所有其他主要离子并减少噪声，我们将[M-2+H]+的M+1同位素衍生物（即[M-2+H]++1）的质谱窗口设置为296.3 ± 0.5 amu。这样只有13C、2H和17O取代的[M-2+H]+同位素衍生物会被传递到HCD细胞进行碎片化，同时还有一个未知的污染物，其相对强度在任何测量中从未超过M+1离子峰的6%（图2）。碎片化产生了13C、2H和17O取代的以及未取代的同位素衍生物，其碳链长度最多达到C14。Orbitrap质谱仪的质量分辨率与m/z值的平方根成反比，与采集时间成正比（Makarov, 2006）。为了在<1小时的测量时间内检测和区分质量非常接近的离子，我们需要平衡质量分辨率和采集时间，以便观察到足够数量的感兴趣的每个同位素衍生物。比较在70.000、140.000和280.000分辨率下运行的植醇分析样品显示，在45分钟内相对标准误差<2‰，其中大多数是由分辨率≥70.000的碎片化产生的（补充图II）。对于质量高达C14H25+（m/z 193.1956）的碎片，13C和2H同位素衍生物的离子束在70.000的分辨率下基线分离，即13C12C131H25和C142H1H24所需的分辨能力约为66.000。

图2
图2. 从四极杆传递到HCD细胞进行碎片化的296.3 ± 0.5 amu质量窗口的MS1质谱。注意296.302 m/z代表所有13C、2H和17O取代的[M-2+H]+目标离子。在这个质量窗口中也观察到一个未知的次要污染物。底部是296.3 m/z [M-2+H]+离子在25 eV能量下碎片化的MS2质谱。插图显示了在70.000分辨率下可观察到的C8H13、C8H15、C7H13O和C8H17质量片段的同位素衍生物。

另一个需要考虑的因素是，低丰度的离子束往往低于仪器的背景噪声水平，在许多单独的扫描中无法观察到。这些所谓的“缺失离子”扫描，即任何给定片段的一个或多个稀有同位素形式缺失，需要尽量减少，以降低我们的同位素比计算误差（参见（22））。为了提高低强度稀有同位素形式峰的信噪比，仪器被设置为将多次微扫描或瞬态观测结果平均到一个扫描周期中。比较在相同条件下使用1次、3次和5次微扫描/周期进行的30分钟植醇测量显示，任何片段离子的一个同位素形式缺失的扫描比例从每次周期1次微扫描时的20.4%下降到3次微扫描时的12.4%，再下降到5次微扫描时的8.8%。为了说明这一点，我们可以看看最丰富的片段C6H11到C8H15的2H同位素形式。虽然这些片段的2H同位素形式在3次和5次微扫描测量中经常被观察到，但在每次周期1次微扫描的测量中则完全缺失（见补充表I）。这些在每次周期1次微扫描中频繁缺失的低丰度稀有同位素形式会导致计算出的同位素比偏低。由于信噪比得到改善，且能够更可靠地检测到低丰度同位素形式，同时还在60分钟内的采集时间内获得了足够的扫描次数，我们选择将仪器设置为每次周期3次微扫描进行所有后续测量。

在单次瞬态中观察到的离子数量最重要的控制因素是AGC（自动增益控制）目标设置，它决定了在注入质谱分析器之前需要在C阱中积累的离子数量。虽然低AGC目标设置可以增加单位时间内可以观察到的瞬态数量，但丰富的离子束可能会迅速积累并填满C阱，从而对较少丰富的离子束产生偏差，降低同位素比。例如，在AGC目标设置为2e4（26.7%）和5e（82.6%）的采集中，C7H11片段的2H同位素形式观察到的扫描次数较少，而在所有其他AGC目标设置（100%）中则观察到。相反，当AGC目标设置过高时，可能会发生离子间的相互作用，即所谓的“空间电荷效应”。例如，凝聚是一种空间电荷效应，其中低丰度离子束的振荡频率可能会向附近更强的离子束转移，从而拓宽峰值并可能使计算出的同位素比产生偏差。这种效应对于在质谱分析器中相对丰富的离子束尤为明显，而对于同一瞬态中贡献的离子总数较少的相邻质量对来说，凝聚可能可以忽略不计。为了评估离子凝聚对质量准确性的潜在影响，我们检查了在不同AGC目标设置下所有感兴趣的质量片段的同位素形式的m/z值。没有同位素形式的m/z值显示出相对于理论质量的系统偏移超过±2毫质量单位（mmu），这表明凝聚可以忽略不计。

衡量采集稳定性和灵敏度的一个重要指标是总离子电流（TIC）和每次扫描周期的注入时间（IT）。如果仪器在AGC控制下运行，那么IT和TIC在整个测量过程中都应该保持稳定。我们测试了以25 ng/min浓度注入植醇时的AGC目标设置，其中最大IT设置为3000 ms，并观察到在AGC目标设置为1e6和3e6时，最大IT在达到3000 ms之前就已经满足。这导致每次扫描周期中C阱分别只填充了约73%和约26%的离子，从而减少了给定测量时间内观察到的有效离子计数。此外，对于AGC目标设置为2e4、2e5和5e6的情况，TIC和IT值的标准偏差（SD）和相对标准误差（RSE）显著更高（见补充图III），表明在离子负荷过低或过高时，信号稳定性以及计数统计会恶化。鉴于IT和TIC的低SD和RSE值以及2H同位素形式的持续观察结果，我们将仪器的AGC目标设置为1e5进行所有后续测量。

使用我们优化的质量分辨率、微扫描和AGC目标设置（表1），我们通过运行三次溶剂空白样品和工业植醇样品的重复测量来确定检测限（LoD）和定量限（LoQ），这些样品的注入浓度范围从0.25到5000 ng min–1。每次样品测量之间清洁离子源后都会运行一个溶剂空白样品（见第3.1节）。空白样品的MS（2）谱中[M-2+H]++1（296.3 m/z）仅包含少量（离子强度<3e2）的C6H9、C6H11、C7H11、C7H13、C8H13、C8H15和C9H15的13C同位素形式，这些也是分析的工业植醇样品中最丰富的13C含离子（见补充表II）。我们将空白的限值（LoB）定义为空白样品中片段平均离子计数的1.645倍标准差，LoD定义为0.25 ng min–1植醇注入时片段平均离子计数的LoB加上1.645倍标准差，LoQ定义为LoB的3倍（参见（23）。在测试的浓度中，25 ng min–1的注入浓度提供了最稳定的信号，并且在几乎所有检测到的片段离子中产生了最高的平均离子计数（见补充图VI）。在2.5–25 ng min–1的注入速率下，几乎所有片段的离子计数始终高于LoQ，而在250 ng min–1以上的浓度下，一些片段的离子计数开始趋于平稳或下降，表明发生了离子抑制，降低了重复性。

表1. APCI源参数设置和光谱仪设置
参数 值
极性 正
鞘气流量 22
微扫描次数 3
辅助气体流量 4
锁定质量 关闭
扫描气体流量 0
AGC目标 1e5
放电电流 [μA] 2.50
最大注入时间 3000
毛细管温度 [°C] 200
FT分辨率 70.000
S透镜RF水平 45
HCD能量 [eV] 25
蒸发器温度 [°C] 300

参数设置是为了最大化植醇[M-2+H]++1（296.3 m/z）离子的信号强度和稳定性而优化的。通过以25 ng min–1的浓度注入植醇并持续6小时来测试长期测量稳定性。结果显示，在6小时的测量过程中，任何时间段的同位素比值没有显著差异（见补充图IV）。通过比较在同一天、同一周内以及12个月内对25 ng min–1工业植醇（总共1.125 μg）进行的三次重复测量中13C替代与未替代同位素形式的离子束比率，来测试分析重复性。结果显示，不同月份重复测量之间的平均值没有显著差异（ANOVA p > 0.05），而在同一天对低丰度短链质量片段进行的三次重复测量中观察到了轻微但统计上显著的差异（C5H9，t(2)=-2.64, p = 0.037）。

4. 通过Orbitrap分析植醇获得的数据处理
从Orbitrap MS生成的原始数据文件中处理数据的第一步是使用专有软件IsoX提取所有用户定义的感兴趣的同位素形式的质谱（MS（2）谱。我们提取了未替代的（12Cx1Hy或12Cx1Hy16O；x和y分别表示碳和氢原子的数量）、单次13C替代的（13C12Cx–11Hy或13C12Cx–11Hy16O）、2H替代的（12Cx2H1Hy–1或12Cx2H1Hy–116O）以及17O替代的（12Cx1Hy17O）同位素形式，这些同位素形式的碳链长度范围从5到12，质量容忍窗口为2 mmu。对于每个定义的同位素形式，IsoX提取每次扫描周期（平均3次微扫描，见上文）的信号强度、峰分辨率、峰噪声、测量到的精确质量、基峰强度、总离子电流和注入时间等值。随后，我们使用自定义的R脚本（https://github.com/IsoTrace/IsoFrag.Phytol）处理数据，该脚本利用了IsoOrbi R包中的选定功能。下面描述了数据处理的步骤及其理由。

4.1. 筛选高质量扫描
通过IsoX导入原始数据后，进一步处理数据集，移除了异常扫描周期和同位素形式信号，这些被识别为：
1) 异常值，定义为TICxIT值是所有扫描中平均值标准差三倍的扫描。这些不规则的扫描可能代表与离子积累和C阱注入期间空间电荷效应相关的不频繁的高强度事件。这些扫描级别的非线性不代表仪器的稳态行为，可能会对平均同位素比估计产生不成比例的影响，因此被完全移除。
2) 卫星峰，即位于我们感兴趣的同位素形式理论准确质量2 mmu范围内的低丰度离子，但被错误地分配为目标离子。这些干扰的次要离子束可能是由于质谱分析器中的空间电荷效应（离子束衰减）引起的。我们的结果显示，对于大多数同位素形式（>95%），只检测到一个离子束。检查被分配到同一质量片段的多个离子束的扫描发现，次要离子信号大多出现在比主要离子束更高的m/z值处。这些伪影通过仅考虑相对于每个感兴趣的同位素形式理论准确质量具有最高信号强度和最小质量差异的峰，并从数据集中移除所有剩余的重复同位素形式来解决。
3) 低丰度同位素形式，定义为在超过10%的扫描中缺失的同位素形式，这些主要是一些低丰度质量片段的稀有同位素形式（见补充表II），主要是因为它们低于我们的测量噪声限。由于它们引入了较大的采集误差，因此需要从数据集中移除（参见Csernica和Eiler（22）的进一步讨论）。在我们工业植醇标准中可以测量的92个潜在同位素形式中有34个（37%）被识别为低丰度同位素形式。具有低丰度未替代同位素的片段，例如C12H23，被完全从数据集中移除，而缺失替代同位素的片段的校正方法将在下文讨论（见第4.3节）。

4.2. 计算同位素形式的分数丰度及其相关误差
为了比较不同样品和采集中[M-2+H]++1母离子的多片段同位素形式的测量结果，每个替代同位素（13C、2H或17O）的丰度表示为该片段总同位素种群（包括替代和未替代物种）的一部分。这种分数丰度方法直接捕捉了由于位置特定的同位素差异和植醇分子平均同位素组成变化引起的有意义的同位素分布差异。为了计算实验观察到的同位素形式的分数丰度，我们首先根据测量的信号强度值计算每次扫描中的离子数量NIO：
NIO = SN × Cnz × (Rn/R) ^ 0.5 × μ ^ 0.5
其中NIO是每次扫描中观察到的离子数量，S是离子强度，N是峰噪声，Cn是Makarov和Denisov（26）测定的一个经验常数，用于将信噪比与离子计数相关联，这里取为4.4，z在所有情况下都是1，Rn是确定Cn时的参考分辨率120.000，R是使用的质量分辨率（70.000；见上文），μ是使用的微扫描次数（即3；见上文）。对于每个扫描j，片段f = CxHy同位素的分数丰度ρ计算如下：
ρ13Cf,j = NIO(C13Cx?112Hy1) / (NIO(CxHy1) + NIO(Cx13Cx?112Hy1) + NIO(CxHy2Hy?11))
ρ2Hf,j = NIO(Cx12Hy2Hy?11) / (NIO(CxHy1) + NIO(Cx13Cx?112Hy1) + NIO(CxHy2Hy?11))
然后通过平均所有扫描中的ρj来计算每次采集中片段i的同位素形式的观察值ρobs：
ρif,obs = 1/N × ∑j=1 ρif,j

4.3. 数据处理
4.3.1 过滤扫描以获得高质量数据
在通过IsoX导入我们的采集原始数据后，进一步处理数据集，移除了异常扫描周期和同位素形式信号，这些被识别为：
1) 异常值，定义为TICxIT值是所有扫描中平均值标准差三倍的扫描。这些不规则的扫描可能代表与离子积累和C阱注入期间空间电荷效应相关的不频繁的高强度事件。这些扫描级别的非线性不代表仪器的稳态行为，可能会对平均同位素比估计产生不成比例的影响，因此被完全移除。
2) 卫星峰，即位于我们感兴趣的同位素形式理论准确质量2 mmu范围内的低丰度离子，但被错误地分配为目标离子。这些干扰的次要离子束可能是由于质谱分析器中的空间电荷效应（离子束衰减）引起的。我们的结果显示，对于大多数同位素形式（>95%），只检测到一个离子束。检查被分配到同一质量片段的多个离子束的扫描发现，次要离子信号主要出现在比主要离子束更高的m/z值处。这些伪影通过仅考虑相对于每个感兴趣的同位素形式理论准确质量具有最高信号强度和最小质量差异的峰，并从数据集中移除所有剩余的重复同位素形式来解决。
3) 低丰度同位素形式，定义为在超过10%的扫描中缺失的同位素形式，这些主要是一些低丰度质量片段的稀有同位素形式（见补充表II），因为它们低于我们的测量噪声限。由于它们引入了较大的采集误差，因此需要从数据集中移除（参见Csernica和Eiler（22）的进一步讨论）。在我们工业植醇标准中可以测量的92个潜在同位素形式中有34个（37%）被识别为低丰度同位素形式。具有低丰度未替代同位素的片段，例如C12H23，被完全从数据集中移除，而缺失替代同位素的片段的校正方法将在下文讨论（见第4.3节）。获取误差（σAE）的计算方法如下：σAE = Stdev(ρif,j) / √N × 1ρif,obs(5)。对于每个样本，使用以下公式估算了shot噪声限制，如（27）中所述：σSN = NBNA + NB / √(NA + 1NB) (6)。其中，NA是替代同位素异构体的总离子计数（NIO），例如13C112Cx-11Hy，而NB是所有其他同位素异构体的总NIO，例如12Cx1Hy + 12Cx2H11Hy–1。σSN不是一个精确的估计值（详见M+1中的讨论），但它可以作为Orbitrap分析理论精度下限的指标。当σAE > σSN时，这些片段被排除在外，因为这可能表明测量存在问题（详见（27）中的讨论）。

4.3. 缺失离子束的处理
计算同位素异构体分数丰度的要求是，除了未替代的同位素异构体之外，还必须存在单个13C或2H替代的同位素异构体；对于含有氧的片段，还需要17O同位素异构体。这是因为分数丰度被定义为替代同位素异构体与所有替代和未替代同位素异构体的相对丰度（参见（22）。
对于含有氧的片段，我们注意到在70,000的测量分辨率下，无法区分13C同位素异构体和17O同位素异构体。例如，要分离C413CH9O和C5H917O，至少需要100,080的分辨率。严格来说，含有氧的片段的每次扫描的分数丰度（ρj）实际上包含了13C和17O同位素异构体（ρj = 13C + 17O）。然而，17O同位素异构体的实际贡献可以忽略不计，因为17O的自然丰度（0.0374原子%）仅为13C的3.4%（1.107原子%），并且在我们的任何片段中，氧的出现频率都低于碳。我们可以用C5H9O片段为例来说明这一点。假设13C、2H和17O的自然丰度分别为1.107%、0.0155%和0.0374%，并且未分辨的17O和13C离子束是叠加的，我们可以近似计算C5H9O的ρj（参见（22）：
ρ2HC5H9O ≈ 9 × 0.000155 + (5 × 0.01107 + 9 × 0.000155) + 1 × 0.000374) = 0.001320（≈0.13%）
ρ17OC5H9O ≈ 1 × 0.000374 + (5 × 0.01107 + 9 × 0.000155 + 1 × 0.000374) = 0.000354（≈0.04%）
因此，由于未分辨的17O导致的13C分数丰度相对增加仅为ρ17O / ρ13C ≈ 0.000354 / 0.052359 = 0.00676（≈0.68%），这对应于δ13C的增加小于0.05‰。此外，即使分析物之间的δ17O差异达到200‰（远超过自然生物变异范围<5‰），也只会导致表观δ13C值之间的误差约为1.4‰。因此，在后续的分数丰度计算中，我们可以忽略17O的潜在贡献。
相比之下，2H同位素异构体的贡献更大，这既是因为片段中氢原子的数量较多，也是因为2H的自然丰度相对较高。对于C5H9O片段，2H的分数丰度（约0.13%）大约是17O的3.7倍（约0.04%），从而对观察到的同位素分布产生更显著的偏差。特别是当样品之间分子平均δ2H值的差异较大时，比较分析中的误差也会相应增大，即δ2H值的差异200‰会导致δ13C值的误差约为1.7‰。因此，我们的分析需要明确考虑2H的替代情况，而17O的影响可以忽略不计。

缺失2H同位素的扫描百分比相对于未替代的同位素异构体来说变化很大（见补充表II）。对于分析的工业植物油样本，大多数片段在超过10%的扫描中都缺失了2H同位素异构体。由于缺少2H离子，无法计算13C同位素异构体的真实分数丰度（见上文），Csernica和Eiler（22）提出了一些纠正离子束缺失的方法，我们将在下面详细讨论。对于所有同位素异构体都被观测到的片段，可以直接从测量到的扫描数据中计算ρobs；而对于缺失了替代（13C、2H、17O）同位素异构体的片段，ρj值被错误地设置为0（ρobs,missing）。为了纠正这一点，我们测试了两种方法：1）从实验数据中估算ρ2H值；2）从理论估计中估算。
在实验方法中，对于在超过10%的扫描中缺失2H同位素的片段，我们根据在其他片段中2H同位素被检测到的比例（超过90%的扫描）来推导ρ2H值。这种方法假设所有片段的氢和碳的替代概率相同，这是不正确的（见下文），但由于片段中2H同位素的丰度相对较低，因此我们需要对ρobs13C值进行的校正也很小，这种方法可以用来粗略预测每个片段的ρ2H值。我们通过原子数（nH）对丰度较高的片段的ρobs2H值进行了归一化，并对所有片段的值进行了平均。例如，ρexperimental2H的计算公式为：
ρexperimental2H = ∑F1ρ2H1 / nH1 + ρ2H2 / nH2 + ... + ρ2HFnH / F (7)
其中F是具有可靠（超过90%的扫描存在）ρobs2H值的片段数量。然而，这种方法的应用显示，能够获得可靠ρobs2H的片段数量（即2H同位素峰在超过90%的扫描中被检测到的片段）在不同样本之间变化很大，有些样本甚至没有任何片段满足这个条件。这会导致ρ13C值的调整不一致（有时基于六个可靠的ρobs2H值，有时仅基于一个，具体取决于样本和测量质量），从而增加实验误差。
因此，我们决定使用Csernica和Eiler（22）提出的基于同位素组学的理论重建方法，并参考他们的术语和理论基础。在这个框架中，特定片段的同位素异构体分数丰度（ρf,obsi）被视为所选前体离子（C20H39O）的同位素异构体群体中的竞争性量。由于MS（2）实验中的所有片段都采样相同的前体同位素群体（即M+1离子），只要这个前体群体能够得到充分约束，就可以重建缺失的同位素异构体的贡献。
对于在超过10%的扫描中缺失NIO2Hf值的片段（见公式2），测量的ρf13C值被校正为：
ρ13Cf,corr = (1 ? ρ2Hf,theory) × ρ13Cf,noH2 (8)
其中ρf,no2H13C是从缺失2H同位素的扫描中计算出的13C分数丰度，而ρf,theory2H是基于分子平均同位素测量理论重建的片段真实2H分数丰度估计值。
为了推导ρf,theory2H，我们首先考虑忽略17O贡献的片段f = CxHy(O)z中的氢同位素异构体ρ2H的分数丰度：
ρ2Hf = (nH ? 2) [C12H2] + [H2]APC / [C13H1] + (nH ? 2) [C12H2] + [H2]APCI (9)
其中例如[C12H2]是片段中单个替代氢原子的同位素浓度，nC和nH是片段中的碳和氢原子数量，[2H]是APCI过程中添加的氢原子的浓度。
为了将分子平均同位素测量结果与Orbitrap中测量的分数丰度联系起来，需要两个步骤。首先，我们计算U2H值，即Orbitrap中2H替代片段与未替代片段的浓度比。U2H是传统同位素测量中使用的2H/1H比率（R2H）的“同位素异构体替代”概念，因为这个比率在本质上是不同的，它是同位素异构体的比率，而不是氢的元素浓度比率。如果我们假设替代原子在所有同位素异构体中随机分布（随机假设；参见Csernica和Eiler（22）），那么U2H ≈ R2H。片段的同位素比率包括HTC-IRMS测量的C-键合氢的R2H值和APCI引入的氢的R2H值：
U2H = [Cx12Hy]2 / [Cx12Hy]1 ≈ R2HIRMS + R2HAPCI (10)
对于含有氧的片段，ROH2H也应包含在U2H中。此外：
R2HIRMS = [H2] / [H1] = R2HVSMOW (1 + δ2HIRMS) / 1000 (11)
其中VSMOW（维也纳标准平均海水）的值为0.0001557530。由于未测量植物油羟基的氢和APCI引入的氢，我们假设δ2H为0‰。此外，我们还假设MS（2）裂解过程中没有同位素分馏，因此替代和未替代的2H同位素异构体从整个分子按比例传输到片段中。
最后一步是将片段级别的Uf2H与每个片段中2H同位素异构体的分数丰度ρf2H联系起来。这是使用UM+1值来完成的，该参数将所有单个替代的同位素异构体与所有未替代的同位素异构体联系起来：
UM+1 = [Cx13Hy1O16] + [Cx12Hy2O16] + [Cx12Hy1O17] / [CxHy1O16]12 = U2Hfρ2Hf,theory (12)
这个参数可以通过测量单替代[M-2+H]++1离子（m/z 296.3）和未替代[M-2+H]+（m/z 295.3）的前体分子C20H39O来实验确定：
UM+1obs = NIOM + 1 / (296.3m/zNIOM295.3m/z) (13)
作为参考，UM+1值也可以使用从独立测量的分子平均值导出的同位素比率来计算：
UM+1 = IRMS / (nC + nH ? 2)U2HIRMS + U2H,OH + U2H,APCI + U17O (14)
其中nC、nH和nO是前体离子C20H39O中的碳、氢和氧的数量。从nH中减去两个氢计数，以考虑在测量分子平均δ2H值之前通过硅烷化丢失的植物油羟基上的氢，以及在APCI过程中添加的氢。U13C使用0.011113的值（即维也纳Pee Dee Belemnite的值）计算，U17O使用0.0003799的值（即VSMOW的值）计算（29）。UobsM+1和UIRMSM+1值之间的差异主要反映了与植物油[M-2+H]+离子形成相关的质量分馏效应（“仪器分馏”，参见（22）），以及在较小程度上反映了我们对APCI引入的氢的δ2H = 0‰和植物油羟基中的氢的δ17O = 0‰的假设误差。
最后，对于在超过10%的扫描中缺失2H同位素的片段，使用理论ρf,theory2H值来重建不完整的同位素群体。对于片段f = CxHyOz，使用公式11中的UIRMS2H计算ρf,theory2H：
ρ2Hf,theory = (nH ? 2)U2HIRMS + U2H,OH + U2H,APCI / UM+1 (15)
对于片段CxHy，计算为：
ρ2Hf,theory = (nH ? 1)U2HIRMS + U2H,APCI / UM+1 (16)
由于重建的ρf,theory2H值的不确定性相对于观测到的ρf13C值的分析不确定性较小，因此没有传播ρf,corr13C值的相对分析误差（σAE）。

5. 结果与讨论
5.1. MS1中的同位素模式
在进行M+1实验之前，首先在MS中表征了植物油前体离子（UobsM+1）的同位素组成。具体来说，在70,000的分辨率下，量化了单个替代[M-2+H]++1离子（m/z 296.3）与未替代[M-2+H]+（m/z 295.3）的相对丰度。在这种分辨率下，M+1峰代表了包含单个替代的13C、2H或17O的同位素异构体的共同贡献。对于所有样本，观测到的前体级别UobsM+1值都超过了通过GC-C/HTC-IRMS独立测量的植物油分子平均同位素比率计算出的相应理论UIRMSM+1值（表2，公式14）。这可能反映了与电离和离子形成相关的同位素效应，因为在APCI电离过程中形成的额外脱水和质子加合物（m/z 277、291、293、297）分割了植物油分析物的总碳池（图1）。
表2. 通过IRMS测量的分子平均碳和氢同位素组成（δ13CVPDB, δ2HSMOW），通过Orbitrap MS1观测到的前体级别UobsM+1值，以及从IRMS计算出的UtheoryM+1值（见第4.3节）
a 植物油来源 δ13C（‰） δ2H（‰） UobsM+1 ± σAE UIRMSM+1 Δobserved-theory
工业植物油 –30.18 –60.03 0.2085 ± 1.79e–4 0.2230 –0.0145
Anacystis nidulans –36.43 –31 4.72 0.2070 ± 1.70e–4 0.2201 –0.0131
Spinach –35.65 –25 2.69 0.2100 ± 1.98e–4 0.2206 –0.0106
a 报告的UobsM+1值是带有分析不确定性（σAE）的均值，来源于重复的MS1扫描。Δ表示UobsM+1 – UIRMSM+1。
5.2. 植物油质谱片段的ρobs13C值模式
M+1实验是通过连续注入（25 ng/min，共45分钟，总量1.125 μg）工业植物油标准品、A. nidulans植物油和菠菜衍生物植物油样本进行的。在MS2谱图中，我们的植物油分析物的[M-2+H]++1离子识别出33个不同的质量片段。一些片段，特别是C8H17、C9H19、C9H17O、C11H21和C12H23，在超过10%的扫描中缺失了未替代和/或13C替代的同位素异构体，因此完全从我们的数据集中移除（见工业植物油的代表性示例，补充表II），留下二十六个质量片段进行分析。将获取误差与shot噪声限制进行比较（补充表II和补充图VII）显示，对于所有剩余的片段，σAE < σSN，其值范围从1.49到1.70。这表明我们的测量结果在M+1分析的实验限制下非常接近理论上可实现的最佳测量精度，并且与先前报道的ESI-Orbitrap-IRMS测量结果一致。(21) 对于这二十六个片段，如果在超过10%的扫描中缺少2H同位素异构体，则根据第4.3节描述的方法对ρf,obs13C值进行了校正。将ρf,corr13C值按照链长递增的顺序绘制在图中（图4顶部），可以看出所有片段的ρf,corr13C值都随着碳链长度的增加而增加。这在M+1实验中是预期的，因为片段的碳链长度越长，包含13C原子的可能性就越高。然而，含有三个不饱和键的片段（通用公式CxHx–5）、含有两个不饱和键的片段（CxHx–3）和含有一个不饱和键的片段（CxHx–1）之间存在显著差异。双键可能1) 来自前体离子[M-2+H]++1，它本身已经含有2个双键；2) 由HCD碎裂引起的重排产生，包括脱氢（例如，从烷基链形成烷烃）；或者3) 来自远离功能化末端电荷的碳氢链的顺序断裂。(30) 我们观察到，在具有相同碳链长度的片段中，随着不饱和程度的增加，ρf,corr13C值会降低。此外，不同不饱和程度片段之间的相对差异随着碳链长度的增加而变得更加明显。少数含氧片段（CxHx–3O）的ρf,corr13C值通常位于CxHx–3和CxHx–5片段之间，且倾向于更接近三不饱和片段。5.3. 通过ρf,corr13C值建模植醇的分子内同位素结构为了评估ρf,corr13C值是否表明植醇内部存在异质性，我们将观察到的值与植醇碳同位素结构的理论模型预测的值进行了比较。这项分析的目的不是为了得出绝对的位点特异性δ13C值，而是为了判断观察到的特定片段的ρf,corr13C值是否与异质或均匀的分子内同位素分布一致。我们使用了一个理论模型，该模型基于分子平均同位素值和第4.3节描述的理论框架，假设整个植醇分子中的13C同位素分布是均匀的。根据这个模型，所有碳和氢原子具有相同的替代概率。对于片段f = CxHy，预期的ρf,homo13C计算公式为ρ13Cf,homo=nCU13CfUM+1(17)，其中nC是片段中的碳原子数。然后，我们通过从ρf,corr13C值估计位点特异性的13C富集来构建一个异质模型（ρf,het13C）。这需要根据合理的碎裂途径为每个片段分配碳位置。然而，确切的碎裂模式只能通过分析具有已知13C标记的合成植醇来确定，而这在本研究中是不可用的。因此，这里的分配必然是推测性的。对于含氧的双不饱和片段，可以最直接地进行分配，这些片段必定来源于含有羟基的碳位置C1和双键的碳位置C2的植醇分子部分（见图3中的植醇碳编号）。同样，单不饱和片段很可能主要来源于植醇分子的饱和尾部，从碳位置C16开始。三不饱和和不含氧的双不饱和片段的来源更为模糊；然而，三不饱和片段和含氧片段之间的ρf,corr13C值的相似性表明它们可能来源于功能化末端，而双不饱和不含氧片段的不同同位素模式则表明它们可能来源于尾部。图3图3. 以六碳片段为例，提出了单不饱和、双不饱和和三不饱和片段离子以及含氧片段的起源。离子化植醇衍生物[M-2+H]+ + 1中的碳位置被编号。在离子化过程中引入的双键用红色星号标出；任何双键的确切位置在此仅用于说明目的。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片随后，我们使用基于位点特异性的质量同位素分布分析（MIDA）扩展方法重建了工业植醇标准的潜在同位素结构。(25) 在一个“继承矩阵”中制定了线性回归系统，其中每个片段的ρf,corr13C值被建模为片段内各个碳位置的13C掺入量之和（见补充表III中的片段碳位置分配）。解决这个线性系统可以得到相对位点特异性的13C富集估计值。利用继承矩阵，我们通过汇总每个片段中所有碳位置的位点特异性富集来重建每个片段的模型ρ13C值（ρf,het13C）。这允许直接比较模型ρf,het13C和实验ρf,corr13C值，其中的差异（即残差ε）可以迭代调整，以修正潜在的错误片段来源分配，或者碎片过程中的系统偏差，例如分子区域的差异性碎裂和电离效率。由于片段大小的限制，一些碳位置（例如C1–C3）无法确定，因此被视为同位素均匀的。将观察到的ρf,corr13C值与均匀和异质预测进行比较（图4）显示，含氧的双不饱和和三不饱和片段可以被两种模型很好地近似，这与功能化末端的有限同位素异质性一致。相比之下，单不饱和和不含氧的双不饱和片段随着片段大小的增加而逐渐偏离均匀模型，而异质模型显著减少了残差。这种模式表明植醇的烷基尾部存在明显的分子内13C异质性。从继承矩阵推断出的单个碳原子的13Cρ值揭示了植醇结构中的不同同位素模式（图5；补充表III），但由于其推测性质，我们没有对此进行深入讨论。然而，我们确实发现植醇功能化（头部）端的碳原子相对于分子其余碳位置的均值有13C富集，这与Schouten等人的观察结果一致，这是本研究之前唯一关于植醇同位素异质性的实验证据。重要的是，尽管我们模型中的片段-位置分配不确定性排除了确定位点特异性碳同位素富集的可能性，但这里应用的建模方法确实表明，一旦能够严格量化碎裂途径，就可以从MS (2) 同位素异构体数据中解析出非随机的分子内13C结构。图4图4. 对于工业植醇标准的单次测量，ρf,corr13C和模型ρ13C值按照链长递增的顺序绘制在图中。误差条表示工业植醇参考标准的代表性采集的σAE。颜色表示质量片段的饱和程度，其中蓝色=三不饱和，绿色=双不饱和，橙色=单不饱和片段。符号代表▲ ρf,homo13C，■ ρf,het13C，● ρf,corr13C值。底部 – 模型值与观测值的绝对偏移。浅色条是ρf,homo13C；深色阴影条是ρf,het13C。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片图5图5. 从继承矩阵计算出的代表性工业植醇标准采集的13Cρ值（以‰为单位）。13Cρ值是通过计算继承矩阵协方差的平方根来估计的。不确定性反映了条件模型不确定性，而不是单个碳位置的独立测量误差。颜色刻度表示相对于所有20个碳位置的13Cρ值的相对偏差。蓝色阴影表示13C贫乏的位置（例如C13、C12），而红色阴影表示富集（例如C1、C5、C11），相对于模型分子平均值（13Cρ = 0.00471或47.1‰）。在离子化过程中引入的不饱和用红色星号标出，其位置在植醇分子内无法确定。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片5.4. 植醇分子内片段的比较分析参考框架尽管上述分析显示了片段间观察到的分数同位素丰度的差异揭示了植醇中的异质13C特征，但将这些发现与更常用的δ尺度联系起来较为困难，因为后者与公认的同位素标准相关联。为了实现不同来源植醇之间的有意义比较，我们建立了一个分子内参考框架，将ρf,corr13C值表示在相对的δ尺度上。为此，我们首先需要计算Uf13C，它来自方程式12，对于片段f = CxHy有Uf13C=ρ13Cf,corr×UM+1obs(18)。假设每个片段内13C的分布是随机的，片段f = CxHy的平均碳同位素组成可以计算为ˉU13Cf=U13CfnC(19)，其中nC表示片段中的碳原子数。模型计算表明，只有当聚集的13C同位素的过量丰度超过30‰时，ˉU13Cf的误差才会超过1‰，这对天然样本来说极不可能。为了构建分子内同位素参考框架，我们采用了相对于在相同条件下测量的参考材料的同位素比率来表示样本的同位素比率的方法。片段特定的δ13C值是相对于工业植醇样本（STD）的相应片段计算的：δ13Csample?STD=(ˉU13Cf,sampleˉU13Cf,STD?1)×1000(20)。每次样本采集都与彼此之间时间间隔小于6小时的最近一次STD采集配对，而不是严格的时间限制（见2.7），因为长期稳定性测试表明在这个时间窗口内日内漂移可以忽略不计（补充图IV）。δ13Csample?STD的分析不确定性是从样本和STD的σAE值传播的，假设两次测量是独立的，即σsample?STD=ˉU13Cf,sampleˉU13Cf,STD√σ2AE,sample+σ2AE,STD×1000(21)。大多数片段的个别采集误差在约1–3‰之间（补充表IV）。通过分析日内和跨日的重复采集来评估片段特定δ13Csample?STD值的可重复性。对于CHLA，片段特定的标准差（SD）值通常在1到3‰之间（中位数约为3‰；图6），单不饱和片段的变异性较高（高达约12‰；图6）。CHLA采集的重复标准差通常与采集误差相当或略高，表明分析精度占总变异性的很大一部分。相比之下，几个片段的重复标准差较大，SD值在5到15‰之间，有些片段的SD值超过20‰（图6）。不同片段组之间的可重复性也存在显著差异，其中三不饱和片段在两个样本中都表现出一致的较低SD值（<3‰），而单不饱和片段的SD值较高（高达12‰ CHLA，30‰ SP）。这可能反映了来自不同碎裂途径的片段对离子源条件变化的敏感性不同。(22) 此外，我们观察到日间变异性大于日内变异性，这表明δ13Csample?STD值受到仪器漂移的影响（27），尽管进行了样本-标准参考。使用线性混合效应模型对方差进行划分，发现总方差的13%归因于日间变异性，59%归因于片段特定效应，28%归因于残余分析误差，比例贡献计算为σx2/(σdate2 + σfragment2 + σresidual2)。相比之下，对于CHLA，只有4%的总方差可以归因于日间变异性，65%的变异性与片段特定效应相关，31%与残余分析误差相关。这证实了尽管我们模型中的片段-位置分配不确定性排除了确定位点特异性碳同位素富集的可能性，但一旦能够严格量化碎裂途径，就可以从MS (2) 同位素异构体数据中解析出非随机的分子内13C结构。图6图6. 植醇样品Anacystis nidulans（红色）和菠菜（绿色）衍生的MS2片段的相对δ13C值，相对于工业植醇标准。单个采集的值显示为菱形；所有样本采集的平均值用圆圈表示，单个采集的误差条显示σAE，平均值的标准差显示为重复测量的标准偏差。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片一般来说，A.nidulans衍生的植醇片段在13C上相对贫乏，δ13Csample?STD值大多在10‰到?20‰之间，中位数为?1.8‰。菠菜衍生的植醇片段的值大多在?4‰到67‰之间，中位数为21‰，其中C4H9和C4H7的值较低，约为?35‰和?20‰。在同位素比率趋势上，特别是在添加或丢失一个碳原子的片段对中，A.nidulans和菠菜衍生分析物之间的同位素模式相反。例如，A.nidulans衍生的C6H11O到C8H15O片段的δ13Csample?STD值随链长增加而增加，而菠菜衍生的片段则随链长减少。同样，像C5H7和C6H9、C5H9和C6H11、C9H17和C10H19、C9H15、C10H17和C11H19、C12H21以及C13H23这样的片段在A.nidulans和菠菜来源的植醇之间的同位素值存在差异。无论这些片段同位素差异的确切来源如何，不同片段之间的偏移幅度和方向在分析物之间都存在系统性和显著的差异。因此，这些对比鲜明的相对同位素比值模式表明A.nidulans和菠菜来源的植醇分析物之间存在潜在的同位素结构差异。由于MEP和MVA途径具有不同的酶促步骤和前体池，特定碳位点的同位素分馏不同，从而导致植醇中具有特征的分子内δ13C特征，这可能是我们A.nidulans（MEP）和菠菜来源（MEP/MVA）植醇分析物中片段同位素模式不同的原因。因此，这些特征最终可以作为我们分析物生物合成来源的特异性标记。

6. 结论
我们开发了一种分析方法，通过Orbitrap质谱仪对M+1同位素体的多片段分析来研究植醇中13C的分子内分布。该方法能够产生来自植醇M+1同位素体的稳定离子束，并且对于大多数片段而言，测量精度优于3‰，每次测量仅需少于1.2微克的分析物，并且在45分钟的采集时间内即可完成。我们的数据处理工作流程可以校正缺失的低丰度氢同位素体，从而测量13C取代同位素体的丰度（ρf,corr13C）。将观察到的ρf,corr13C值与均匀和非均匀同位素模型进行比较，表明植醇分子内部存在显著的同位素异质性。为了便于样本之间的比较，我们引入了一个参考框架，将质量片段中的13C分数丰度转换为相对于在相同条件下测量的植醇标准的δ值。尽管某些片段的日间重复测量变异性远大于测量误差，但片段间的相对同位素模式仍然具有重复性，从而能够比较来自不同生物来源的植醇的同位素模式。利用这种方法，我们观察到在A.nidulans和菠菜来源的植醇分析物中，相差一个碳原子的片段对显示出相反的δ13C样本?STD值，这可能反映了它们不同来源导致的潜在分子内同位素差异。因此，这项研究表明基于Orbitrap的多片段13C分析能够解析天然丰度下长链非极性脂质中的特征性同位素指纹，为追踪植醇及相关化合物的生物合成来源和环境背景提供了一种有前景的工具，即使是在环境中发现的纳摩尔（约4纳米摩尔植醇）丰度水平下也是如此。