氨基甲酰化作为分析土壤基质中索曼神经毒剂标志物——蒎醇的有效方法，通过EI-GC-MS和LC-HRMS技术实现

《ACS Omega》：Carbamoylation as an Effective Tool in the Analysis of the Soman Nerve Agent Marker Pinacolyl Alcohol in Soil Matrices by EI-GC-MS and LC-HRMS

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苯甲醇（PA）是一种二级管制化学品，由于它与神经毒剂梭曼（Soman）有直接和法医上的关联，因此在禁止化学武器组织（OPCW）进行的大多数能力测试（PTs）中经常被使用。因此，化学武器公约（CWC）检查团队在实地调查中检测到 PA 是环境中过去或潜在存在梭曼的一个强烈指标。其低分子量（102）、早期洗脱时间和较差的电离特性使得 PA 成为一种难以检测的分析物，尤其是在低浓度（约 1–10 μg/g）时。在这项工作中，首次使用 1,1′-羰基二咪唑（CDI）对两种不同的土壤基质（弗吉尼亚 A 型土壤和淤泥沉积物）中的 PA 进行修饰，以便随后通过 EI-GC-MS 和 LC-HRMS 方法进行检测。对于 EI-GC-MS 分析，PA 的氨基甲酸酯衍生物（PIC）在色谱图上表现更好，例如峰形更清晰、分子量增加（PIC 为 196，PA 为 102）以及保留时间延长（PIC 为 16.9 分钟，PA 为约 4.1 分钟）。此外，衍生化还提高了 LC-HRMS 对 PA 的检测能力，因为 PIC 产物具有质子化位点（即咪唑环），而 PA 则没有。更重要的是，氨基甲酰化反应在温和条件下（55 °C，无碱）快速进行（3 小时），这些特性使其成为在 OPCW 能力测试或实际案例中分析 PA 的理想方法，特别是在 PA 浓度较低的情况下。预计该协议可以应用于各种环境基质中这种重要的梭曼标志物的法医分析。

1. 引言
基于有机磷的神经毒剂（OPNAs）是日益增多的化学战剂（CWAs）中最令人担忧的成员之一，因为它们具有极高的毒性。在伊拉克-伊朗冲突期间对军事目标的故意使用，以及奥姆真理教对东京地铁的袭击，以及叙利亚古塔和汗谢赫恩的化学袭击，过去 40 年间一直引起全球关注。因此，许多研究工作增加了活动，包括开发防护材料、新型广谱解毒剂以及更有效的降解方法。与此同时，人们继续投入大量努力，通过各种分析手段直接检测和分析 OPNAs 及其在环境中的降解产物，以用于化学法医应用。在化学法医领域，高效检测这些有毒化学物质或其降解产物成为部署在特定地点调查和验证涉及 OPNAs 使用报告的 CWC 检查团队的关键能力。通常，OPNAs 的降解产物具有极性，如果不预先进行衍生化，很难用常规的 GC-MS 和 LC-MS 方法进行分析，尤其是在这些产物浓度较低的情况下。其中一种产物是苯甲醇（PA，3,3-二甲基-2-丁醇），它是神经毒剂梭曼（GD，1-甲基-2,2-二甲基丙基甲基膦氟酸酯）合成中的一个构建块，同时也是其自然降解产物（图 1a）。由于其低分子量（m/z = 102）、在 GC-MS 分析中的早期洗脱时间以及在电喷雾 LC-MS 方法中的较差电离特性，PA 成为一种难以通过常规 GC-MS 和 LC-MS 方法检测的分析物。因此，在禁止化学武器组织（OPCW）进行的能力测试中检测 PA 通常具有挑战性，特别是在故意引入更多共洗脱干扰物的基质中。

图 1
(a) 苯甲醇（PA）是神经毒剂梭曼（GD）的降解产物，还有甲基膦酸（MPA）。PA 可以通过衍生化生成可以通过 GC-MS 和 LC-MS 检测的类似物。
(b) PA 的衍生化策略包括使用硅氯烷进行硅基化，以及使用 BSTFA 和 MTBSTFA 等试剂生成三甲基硅基化、叔丁基二甲基硅基化和苯基二甲基硅基化衍生物；使用对甲苯异氰酸酯生成氨基甲酸酯；以及使用乙酸酐和苯甲酰氯进行酰化。

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为此，已经设计了多种 PA 的衍生化方法，以提高其检测和分析能力。这些化学修饰旨在通过大幅增加其分子量来改善其色谱图特征，从而将其在色谱柱中的保留时间与其他共洗脱干扰物分开（图 1b）。最常用的 PA 衍生化方法之一是硅基化，采用三甲基硅基（TMS）和叔丁基二甲基硅基（TBDMS）醚的形式。尽管这些方法能生成可通过 GC-MS 和 LC-MS 检测的衍生物，但它们在温和碱性或酸性条件下的稳定性较差，限制了其在样品制备技术中的广泛应用。Albo 等人开发了一种使用 N-甲基咪唑作为催化剂的苯基二甲基硅基化协议，使硅基化可以在室温下进行，并产生比 TMS 衍生物具有更长保留时间和更好稳定性的 PA 衍生物。另一种 PA 衍生化方法是使用对甲苯异氰酸酯（PTI），它生成的 PA 氨基甲酸酯相对于硅基团具有更好的稳定性和更长的 GC 柱保留时间。另一种 PA 衍生化方法是将其酰化和苯甲酰化，生成酯类，这被证明在甘油富集基质中显著改善了其低浓度下的检测能力。我们专注于开发适用于 GC-MS 和 LC-MS 的衍生化技术，但更侧重于前者，因为可以通过 GC-MS 检测的样品通常也能通过更灵敏的 LC-MS 技术成功检测到。此外，在 OPCW 能力测试和实际样品分析中，拥有两种正交检测技术可以提高我们对分析物化学鉴定的信心。然而，由于 CWC 检查团队使用便携式 GC-MS 设备在现场进行分析，因此分析人员需要掌握高效的衍生化技术，将极性分析物转化为适合 GC 检测的产物。这是因为 CWAs 具有高度反应性，因此在环境中不会长时间存在，会迅速降解为极性产物，而这些极性产物难以通过 GC-MS 检测。例如，如图 1a 所示，梭曼（GD）会完全降解为甲基膦酸（MPA）和苯甲醇（PA），这两种极性化合物通过 GC-MS 非常难以检测。GC-MS 分析的另一个便利之处在于可以将未知分析物的质谱与仪器的内置质谱库（如 NIST、OCAD）匹配，这成为初步现场鉴定的宝贵工具。在仪器内置库初步鉴定未知分析物后，下一步是获取或合成标准品以完全确认其身份。

在这项工作中，首次使用 1,1′-羰基二咪唑（CDI）作为有效试剂，对两种土壤基质中的 PA 进行修饰和分析。这种修饰使 PA 转化为一种衍生物（PIC），其结构特征使其更适合通过 GC-MS 和 LC-MS 检测，例如分子量增加（从 m/z = 102 增加到 m/z = 196），GC-MS 分析中的保留时间从 PA 的 4.1 分钟（宽峰）增加到 PIC 的 16.9 分钟（尖峰），并且含有咪唑基氨基甲酸酯结构，该结构本身在 LC-HRMS 分析中可作为 UV 检测标记和质子化位点（在咪唑基 N3）。使用 1,1′-羰基二咪唑（CDI）的另一个好处是生成的 PIC 氨基甲酸酯在 GC 分析中对水解（即湿度）和热降解具有更好的稳定性，相比常用的 PA 衍生物三甲基硅基苯甲醇（PA-TMS）更为优越。比较实验评估了 PIC 和 PA-TMS 的稳定性，并包含在支持信息中（第 S3–S6 页）。本研究中使用的两种土壤基质是弗吉尼亚 A 型（VA）土壤和淤泥沉积物，选择它们是因为它们具有不同的物理和化学性质。VA 土壤含有高有机质和水分，而淤泥沉积物含有二氧化硅基细颗粒和粘土，这导致了独特的提取和衍生化方法的发展。本工作中使用的协议如图 2 所示，与我们在 OPCW 能力测试中用于分析土壤基质的协议有一定相似性。该协议包括首先使用有机溶剂从每种土壤中提取 PA。在这第一步中，发现每种土壤基质需要不同的提取溶剂，二氯甲烷（DCM）最适合 VA 土壤，而 1-氯丁烷（1-CB）最有效地从淤泥沉积物中提取 PA（图 2）。然而，氯仿（CHCl3）是一种适用于两种基质的通用提取溶剂，其提取效率与 DCM 和 1-CB 相当。提取 PA 后（每种土壤进行三轮提取），将提取物蒸发，并使用 CDI 进行衍生化。最终，衍生化的样品通过电子撞击气相色谱-质谱（EI-GC-MS）和液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）进行分析，用于能力测试报告（图 2）。

图 2
本工作中描述的协议概述了在两种土壤中分析 PA 的过程：弗吉尼亚 A 型（VA）土壤和淤泥沉积物，分别添加了 1 和 10 μg/g 的浓度。从 VA 土壤中提取 PA 时使用二氯甲烷或氯仿，而从淤泥中提取 PA 时使用 1-氯丁烷（1-CB）或氯仿。每次提取包含三轮提取，收集所有提取物并蒸发后，将残留物分别用于 EI-GC-MS 直接分析和 CDI 衍生化，然后再进行 EI-GC-MS 和 LC-HRMS 分析。（土壤照片来自 iStock photo（版权：malerapaso）。版权 2025。）

2. 结果与讨论
2.1. 选择 PA 作为感兴趣的标志物
PA 被选中是因为它与基于有机磷的神经毒剂梭曼有直接关联。当梭曼在环境或生物条件下发生水解时，会生成 PA 以及其他重要标志物，如苯甲醇甲基膦酸和甲基膦酸（MPA）（图 1a）。因此，PA 可以作为基质中梭曼潜在或过去存在的指示物。禁止化学武器组织（OPCW）将 PA 分类为二级管制物质，定义为“在最终形成一级管制物质（即神经毒剂）的化学反应中的一个前体”。出于这些原因，PA 成为 OPCW 进行的能力测试中常见的分析物，通常以低浓度添加在更集中的、故意添加的共洗脱干扰物中。多年来，已经开发了多种分析方法来提高其通过 GC-MS 和 LC-MS 的检测能力。图 1b 中介绍的衍生化反应旨在改善 PA 的 GC-MS 图谱，不幸的是，并非所有这些方法都适用于后续的 LC-MS 分析，因此仍需要分析师对多个样品进行分析。因此，本文介绍的协议的主要目标之一是在一个样品中生成可以通过 GC-MS 和 LC-HRMS 检测的 PA 衍生物，从而避免在 OPCW 能力测试期间浪费宝贵的分析时间（这些测试需要在两周内完成）。

2.2. 土壤基质、提取溶剂和添加浓度的选择
CWC 检查团队的职责之一是在涉嫌使用 OPNAs 的附近或现场收集环境样品。收集的样本通常包含环境中的土壤和液体基质，但也可能包括其他基质，如衣物甚至植被。在我们的研究中，为了使用具有代表性的土壤基质，选择了弗吉尼亚A型（VA）土壤，因为它在分析实验室中常用于提取实验，因为它含有有机成分（总有机含量为2.6%）且粘土浓度较低（7.5%）。另一种用于研究的土壤基质是淤泥沉积物，因为它在物理和化学组成上与VA不同。淤泥具有自由流动的土壤质地，并且含有较高的粘土浓度（25%），这使得分析物的提取和后续衍生化变得具有挑战性。因此，这两种土壤基质在化学和物理性质上都有很大差异，VA由不同大小的颗粒组成，而淤泥则由均匀的颗粒组成。

为了从VA土壤中提取PA，筛选了五种溶剂，包括：二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EtOAc）、乙腈（ACN）、1-氯丁烷（1-CB）和氯仿（CHCl3）。选择二氯甲烷是因为它在GC-MS分析中常用，因为它具有极性和低沸点（39.6°C）。乙酸乙酯与DCM类似，也是一种用于GC-MS分析的溶剂，由于其中等极性（相对于水的相对极性为0.28）和低密度（d = 0.90 g/mL）以及较高的沸点（77°C）而被纳入我们的研究范围。乙腈也被用于LC-MS方法的分析，因为它具有高极性（相对于水的相对极性为0.46），有助于极性化合物的溶解。另一种选定的溶剂是1-氯丁烷，因为它能够以类似于DCM的方式提取有机化合物，但其密度较低（d = 0.88 g/mL），从而为提取过程提供了另一种方法。最后一种溶剂是氯仿（CHCl3），它比水密度大，但沸点更高（bp = 61.2°C），并且具有更高的亲脂性，这可能有助于从基质中提取PA。

为了模拟OPCW PT中的情况，将PA以两种浓度（1 μg/g和10 μg/g）添加到每种土壤基质中。

2.3. 在弗吉尼亚A型土壤中提取和衍生化PA
为了从VA土壤中提取PA，筛选了五种溶剂，包括：二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EtOAc）、乙腈（ACN）、1-氯丁烷（1-CB）和氯仿（CHCl3）。图3a显示，对于本研究中使用的两种浓度，DCM和CHCl3是比EtOAc、ACN和1-CB更有效的PA提取溶剂。从图3a的图表中可以看出，使用DCM提取的PA百分比在85%到95%之间（蓝色条形），而CHCl3的百分比也在相近范围内（85–90%，蓝色条形），使其成为另一种优秀的PA提取溶剂。尽管从图中看不到明显的峰值，但如图3b所示，使用DCM或CHCl3可以高效地提取PA，其早期洗脱时间和峰形的宽泛性可以明显看出。在从土壤基质中提取PA和其他有机物后（每次3 mL），将DCM合并并浓缩至约1 mL的总体积，然后用CDI处理并在55°C下加热3小时。随后通过EI-GC-MS分析所得混合物。观察到，在这两种浓度下，PA都成功转化为PIC（图3c–f）。虽然此时可以通过EI-GC-MS直接分析PIC，但实际上可以进一步浓缩混合物，以便注入更多可检测量的衍生化物质。在较高浓度的情况下（即10 μg/g），PIC可以通过其特征保留时间（RT = 16.9 min.）在气相色谱图中容易检测到（图3c和插图）。使用背景减除法对峰进行标准分析后，得到了PIC的清晰质谱（图3d）。相比之下，在较低浓度的PA样品中（即1 μg/g），由于PIC的量较低以及基质组分的干扰，PIC更难以定位（图3e）。然而，通过使用m/z = 85的单离子提取（SIE）分析模式，可以检测到PIC，如图3e的插图和收集的质谱（图3f）所示。选择的衍生化反应总时间（例如3小时）是基于一系列实验确定的，这些实验旨在确定PA在55°C下转化为PIC所需的时间。结果发现，在CHCl3提取物中，几乎所有的PA在2小时内都转化为了PIC衍生物（支持信息，第S2页）。

图3
(a) 使用五种溶剂分别以1 μg/g和10 μg/g的浓度添加PA时，从VA土壤中提取PA的效率：二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EtOAc）、乙腈（ACN）、1-氯丁烷（1-CB）和氯仿（CHCl3）。分别添加了1 μg/g和10 μg/g的标准样品，以评估每种溶剂从土壤中提取PA的效率（平均值（n = 6）峰面积（±标准偏差）。
(b) 使用DCM从添加了10 μg/g PA的VA土壤中提取PA。PA在4到5分钟之间洗脱（用蓝色箭头标示）。
(c) VA提取物（含有10 μg/g PA）与CDI反应，生成衍生化的PIC产物，其保留时间为16.96分钟（用浅蓝色突出显示并在插图中放大）。
(d) PIC的质谱显示了独特的峰以及相关片段的分子结构和公式。
(e) VA提取物（含有1 μg/g PA）与CDI反应，通过使用m/z = 85的单离子提取（SIE）分析模式可以检测到PIC，除了PIC产物外还产生了多个峰（插图）。
(f) PIC的质谱仍显示了可用于识别该产物的关键片段。

2.4. 在淤泥沉积物中提取和衍生化PA
在检查用于提取VA土壤的相同溶剂组合时，再次发现1-CB和CHCl3是比其他溶剂更有效的PA提取溶剂（图4a）。这一点在两种浓度下的PA提取中都得到了验证，提取效率几乎与图4a中用于比较的添加PA标准样品相当。1-CB被纳入我们的研究是因为它在生物应用中作为高效提取溶剂的使用，例如从血液、血浆和尿液样本中提取有机分子。然而，目前尚无明确证据表明为什么1-CB比CHCl3或DCM更适合作为提取淤泥沉积物中PA的溶剂。一种假设是1-CB比DCM更有效地穿透构成淤泥沉积物的粘土状物质，从而增加了PA进入溶液的能力。目前，我们正在评估1-CB从其他土壤基质中提取PA的能力以进行进一步比较。然而，由于CHCl3在提取PA方面表现出色，并且同样适用于从VA土壤中提取PA，出于便利考虑，它被选为这些土壤基质中提取PA的统一溶剂。从淤泥基质中提取PA后（图4b），使用氮气流或旋转蒸发器将CHCl3蒸发（沸点=61.2°C），然后将残留物溶解在DCM中，并在55°C下与CDI处理3小时。随后通过EI-GC-MS分析所得混合物（图4c–f）。观察到，在这两种浓度下，PA都成功转化为PIC。在较高浓度的情况下（即10 μg/g），PIC可以通过其特征保留时间（RT = 16.9 min.）在气相色谱图中容易检测到（图3c和插图）。使用背景减除法对峰进行标准分析后，得到了PIC的清晰质谱（图3d）。对于较低浓度的样品（即1 μg/g），由于PIC的量较低以及与产物共洗脱的基质组分较多，PIC更难以定位（图3e）。然而，通过使用m/z = 85的单离子提取（SIE）分析模式，可以明确检测到PIC，如图3e的插图和收集的质谱（图3f）所示。选择的衍生化反应总时间（例如3小时）是基于一系列实验确定的，这些实验旨在确定PA在55°C下转化为PIC所需的时间。结果发现，在CHCl3提取物中，几乎所有的PA在2小时内都转化为了PIC衍生物（支持信息，第S2页）。

图4
(a) 使用五种溶剂分别以1 μg/g和10 μg/g的浓度添加PA时，从淤泥沉积物中提取PA的效率：二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EtOAc）、乙腈（ACN）、1-氯丁烷（1-CB）和氯仿（CHCl3）。分别添加了1 μg/g和10 μg/g的标准样品，以评估每种溶剂从淤泥中提取PA的效率（平均值（n = 6）峰面积（±标准偏差）。
(b) 使用DCM从添加了10 μg/g PA的淤泥中提取PA。PA在4到5分钟之间洗脱（用蓝色箭头标示）。
(c) VA提取物（含有10 μg/g PA）与CDI反应，生成衍生化的PIC产物，其保留时间为16.96分钟（用浅蓝色突出显示并在插图中放大）。
(d) PIC的质谱显示了独特的峰以及相关片段的分子结构和公式。
(e) VA提取物（含有1 μg/g PA）与CDI反应，通过使用m/z = 85的单离子提取（SIE）分析模式可以检测到PIC，除了PIC产物外还产生了多个峰（插图）。
(f) PIC的质谱仍显示了可用于识别该产物的关键片段。

2.5. 通过LC-HRMS分析土壤样品中的PIC
参与OPCW PT的实验室的一个核心要求是包含次要和三级数据集，最好是来自正交分析方法的数据集，以便对预定物质进行明确和全面的表征。因此，通常情况下，从提取/衍生化步骤生成的样本不仅会提交给GC-MS分析，还会提交给互补的联用技术进行分析，如GC-MS-MS（CI）、GC-IR、GC-FPD和LC-HRMS。为此，之前衍生化的两种PA浓度的土壤样品都进行了LC-HRMS分析，以确认PIC的存在和身份。图5显示了所有四个样品（在VA和淤泥基质中分别添加了1 μg/g和10 μg/g的PA）的LC-HRMS分析（图5a），以及通过正电喷雾电离条件下的高分辨率质谱和特征碎片化来鉴定PIC（图5b）。观察到，即使在使用m/z范围进行质量提取分析后，其中PIC的确切质量为197.1284，且标准偏差窗口较小（m/z范围为197.1275–197.1295），在提取的色谱图中仍可以观察到多个具有该质量范围内的峰。然而，只有一个峰的质量在理论质量值范围内（误差在5 ppm以内），从而得到了涉及C、H、N和O原子的分子式。

图5
(a) 在两种土壤基质中，两种浓度下PIC的LC-HRMS分析。PIC产物在每个色谱图中的保留时间为2.62分钟（用浅蓝色突出显示）。色谱图是通过使用精确的质量m/z范围（197.1275–197.1295）进行单离子提取得到的。(b) PIC的质谱图，其中一些碎片的部分归属显示了m/z = 197.1284的精确质量（理论m/z = 197.1285）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

此外，还对分子离子（m/z = 197.1284）进行了MS-MS分析，生成了三个有助于确认PIC结构的诊断性碎片（图6）。第一个碎片是m/z = 113.0343（计算m/z = 113.0346，质量误差为2.65 ppm），其分子式为[C4H5N2O2]+，可以认为是通过类似McLafferty碎裂机制从PIC中产生的（图6）。第二个可识别的碎片是m/z = 85.1010（计算m/z = 85.1012，质量误差为2.35 ppm），其分子式为[C6H13]+。这个碎片可以认为是由连接咪唑基氨基甲酸酯和蒎醇部分的C–O键发生异裂产生的（图6）。这种碎裂最初会产生一个二级C6H13+碳正离子，然后通过甲基迁移或转换生成一个具有相同分子式的更稳定的三级碳正离子（图6）。最后一个碎片是m/z = 69.0446（计算m/z = 69.0447，质量误差为1.45 ppm），其分子式为[C3H5N2]+，可以认为是通过将氢转移到咪唑环并伴随CO2释放的过程从[C4H5N2O2]+碎片中产生的（图6）。总体而言，LC-HRMS和MS-MS数据证实了PIC的结构，并将其与其他具有相似精确质量的潜在产物区分开来。这两种分析技术（EI-GC-MS和LC-MS）都能检测到PIC，这使得这种特定的衍生化方法成为分析和检测PA（特别是在进行OPCW现场检测时）的有效工具。我们预计这种衍生化方法将在分析这种Soman标记物时得到广泛应用，因为在其他已建立的技术（如硅基化或酰基化）无法有效产生可观察到的衍生物的复杂基质中。

图6 使用HCD碎裂技术对m/z = 197.1284离子进行MS-MS分析，得到了三个用于阐明咪唑基氨基甲酸酯结构的诊断性碎片。所有三个主要碎片的可能形成机制用蓝色箭头表示。具有观察到的精确质量的碎片用虚线框标出，其计算出的理论质量及其质量误差在结构下方提供。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

2.6. 确定两种土壤中PIC的LOD和LOQ值
通过制备两种PIC（100 μg/mL）的储备溶液（分别来自VA土壤和淤泥沉积物中的DCM提取物）来确定PIC产品的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。将这些溶液用相应的土壤提取物稀释，直到信噪比介于5到20之间。信噪比是使用m/z = 85离子（PIC的基峰）计算的。在Virginia Type A提取物中，PIC的LOD和LOQ值分别为4.9 ng/mL和16.5 ng/mL；而在淤泥沉积物中，这些值分别为8.3 ng/mL和27.8 ng/mL（支持信息，第S18–S19页）。

2.7. 氨基甲酰化和硅基化的比较研究
对添加了PA（20 μg/mL）的沙质壤土DCM提取物进行了额外的比较研究。这些研究的目的是评估与其它成熟的硅基化方法（如使用BSTFA的trimethylsilylation或使用phenyldimethylsilyl chloride和N-methylimidazole的phenyldimethylsilylation）相比，氨基甲酰化衍生化方法的优势，分别生成PA-TMS和PA-PDMS。所有三种衍生化反应都是单独进行的，并通过EI-GC-MS和LC-HRMS进行分析。研究发现，PA的氨基甲酰化产物PIC可以通过EI-GC-MS和LC-HRMS检测到，而在该浓度下，PA-TMS衍生物无法通过任一方法检测到，而PA-PDMS衍生物只能通过EI-GC-MS检测到。值得注意的是，当PA浓度较低时，PA-TMS衍生物特别难以检测，而且需要在其存在的基质中进行原位衍生化（即，不是像我们的稳定性研究中那样将纯形式的PA-TMS标准品添加到基质中）。考虑到trimethylsilylation的标准条件（65 °C，3小时），PA-TMS可能会迅速降解，而在LC-HRMS分析使用的酸性条件下这种降解会进一步加速。至于第二种硅基化衍生物PA-PDMS，由于其是在较温和的反应条件下生成的更稳定的PA硅基衍生物，因此预期可以通过EI-GC-MS检测到。然而，在LC-HRMS分析使用的酸性条件下，PA-PDMS衍生物无法被检测到。所有与这些比较研究相关的数据都提供在支持信息中（第S20–S25页），这些数据强调了在OPCW现场检测和其他常规分析中将氨基甲酰化作为这种重要神经毒剂标记物的首选衍生化方法的重要性。

3. 结论
总之，介绍了一种使用EI-GC-MS和LC-HRMS分析蒎醇的新方法。由于PA的分子量较低（m/z = 102）且在色谱分析中洗脱时间较早，当其在基质中以低浓度存在时，检测和正确识别它特别具有挑战性。在这项工作中，使用1,1′-carbonyldimidazole（CDI）在两种不同的土壤基质中以符合化学武器公约（CWC）标准的浓度修改PA。PA与CDI之间的反应生成了蒎基咪唑基氨基甲酸酯（PIC），这是一种在EI-GC-MS分析中具有更好的色谱特征并且在LC-HRMS中也能被检测到的氨基甲酸酯产物。当在每种土壤基质中分别添加1 μg/g和10 μg/g的PA时，PA有效地转化为PIC并通过EI-GC-MS和LC-HRMS检测到。该协议包括两个部分：提取步骤和提取后的PA衍生化步骤。对于VA土壤，发现DCM是提取PA的最佳溶剂；而对于淤泥沉积物，1-CB是最佳提取剂。然而，另一种高效的提取PA的溶剂是CHCl3。因此，在处理土壤基质中的PA分析时，CHCl3可以与DCM或1-CB互换使用。在每种提取物蒸发后得到残留物后，通过将其重新溶解在DCM中，用CDI处理并将混合物加热到55 °C持续3小时来进行衍生化。尽管建议在分析分析物浓度非常低的样品时尽可能浓缩反应混合物，但在我们的案例中，直接用EI-GC-MS分析这种混合物在3小时内就能成功检测到PIC，这代表了所有PA转化为PIC的最佳时间。同时，同样的样品也通过LC-HRMS和MS-MS进行了分析，无需更换溶剂，得到了类似的结果，并且明确检测到了PIC，提供了一种可以使用两种正交分析技术进行分析的样品。这些结果突显了CDI作为CWC检查团队在涉嫌使用化学武器的环境中进行法医分析时分析检测PA的有效性。

4. 材料与方法
4.1. 化学品、试剂和设备
所有化学品均从商业供应商处购买并按原样使用。蒎醇（3,3-dimethyl-2-butanol, PA）、1,1′-carbonyldimiidazole（CDI）、二氯甲烷、1-氯丁烷、氯仿-d3、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、碘以及干净的沙质壤土均从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。无水碳酸钠、无水硫酸钠和乙腈从Acros Organics（美国宾夕法尼亚州韦斯特切斯特）购买。自动进样瓶和玻璃插件从Agilent Technologies（美国加利福尼亚州圣克拉拉）购买。Acrodisc PTFE硅胶过滤器（0.45 μm）从Pall laboratories（美国纽约州波特华盛顿）购买。标准PIC是在实验室合成的。Virginia Type A土壤和淤泥沉积物来自法医科学中心（FSC）的土壤样本收集。在合成标准品时，使用Agela Technologies的玻璃Back MF254 TLC板（pH ～ 5）进行薄层色谱（TLC）来监测酰基化过程，并使用紫外光（λ = 254 nm）结合铈铵钼酸盐（CAM）（51）和碘蒸气（52,53）来检测产物和中间体。Wheaton玻璃闪烁瓶（20 mL容量）、玻璃瓶（4 mL容量）和40 mL琥珀色玻璃瓶从VWR（美国宾夕法尼亚州拉德诺）购买。纯化是通过使用Biotage Isolera纯化系统和Biotage Sf?r硅胶高容量双筒（10 G）在DCM → 10% MeOH/DCM的梯度下进行的闪蒸柱色谱完成的。

4.2. EI-GC-MS分析
使用配备有split/splitless注射器的6890 Agilent GC和5975 MS检测器进行EI-GC-MS分析。用于分析的GC柱是Agilent DB-5MS UI毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。作为载气使用超纯氦气，流速为0.8 mL/min。注射器温度为250 °C，注射体积为1 μL。烤箱温度程序如下：40 °C保持3分钟，然后以8 °C/min的速度升温至300 °C，再保持3分钟。MS离子源和四极杆的温度分别为230 °C和150 °C。电子电离能量为70 eV。MS的操作范围是从m/z = 29到m/z = 600，扫描时间为0.4秒。

4.3. LC-HRMS分析
LC-HRMS分析是在Thermo Scientific Vanquish Flex HPLC和Thermo Scientific Q Exactive HF-X上进行。用于分析的LC柱是Waters Acquity HSS T3，直径1.8 μm。作为碰撞气使用超纯氮气。流动相为A = 水/0.1%甲酸和B = 乙腈/0.1%甲酸。溶剂梯度持续25分钟，具体如下：初始1%，保持2分钟；然后线性增加到10% B，持续6分钟；再增加到95% B，保持2分钟；最后在1% B下再平衡8分钟。样品（体积为10 μL）被注入LC-HRMS进行分析。LC柱温度设置为40 °C，MS的操作范围是从m/z = 75到750。MS采集是在Thermo Scientific Q Exactive HF-X质谱仪上进行的，采用加热电喷雾电离（HESI）模式，正离子模式，分辨率准确质量精度达到≤3 ppm。MS实验包括完整的MS谱（m/z = 75–750），分辨率为30000（半高宽（fwhm）在m/z = 200），随后是数据依赖的MS–MS，具有30%的HCD能量（分辨率为30000，fwhm在m/z = 200）。

4.4. 添加了PA的土壤基质的制备
制备了PA的储备溶液（1 mg/mL，1000 ppm）在DCM中，用于制备用于添加到两种土壤基质（即VA土壤和淤泥沉积物）中的储备溶液（1 ppm和0.1 ppm）。1 ppm溶液是通过取3 mL的1000 ppm储备溶液并用DCM稀释至30 mL在40 mL琥珀色玻璃瓶中制备的。0.1 ppm溶液是通过取1 mL的1 ppm储备溶液并用DCM稀释至10 mL制备的。为了制备10 ppm的添加土壤样品，将VA土壤或淤泥沉积物（300毫克）用3毫升1 ppm的PA溶液处理；而1 ppm的添加土壤样品则是通过将每种基质（300毫克）用3毫升0.1 ppm的PA溶液处理来制备的。这两种土壤悬浮液都置于DCM中，然后使用旋转蒸发器或低流速氮气小心蒸发。

4.5 从弗吉尼亚A型土壤和淤泥沉积物中提取和衍生PA
含有两种浓度PA（1 μg/g和10 μg/g）的VA土壤（300毫克）分别用DCM或CHCl3（每次3毫升，共三次）进行提取，收集到的提取液通过0.45 μm Acrodisc过滤器进行过滤，随后用氮气流将溶剂缓慢蒸发至干燥。蒸发后得到深棕色残留物，将其用DCM（500毫升）复溶，放入装有微搅拌棒的2毫升自动采样瓶中，并加入CDI（10毫克）进行处理。所得混合物在55°C下加热3小时，冷却至室温后，直接通过EI-GC-MS和LC-HRMS进行分析。同样地，含有两种浓度PA（1 μg/g和10 μg/g）的淤泥沉积物（300毫克）也分别用1-CB或CHCl3（每次3毫升，共三次）进行提取，收集到的提取液通过0.45 μm Acrodisc过滤器进行过滤，然后用氮气流将溶剂缓慢蒸发至干燥。蒸发后得到深黄色残留物，将其用DCM（500毫升）复溶，放入装有微搅拌棒的2毫升自动采样瓶中，并加入CDI（10毫克）进行处理。所得混合物在55°C下加热3小时，冷却至室温后，同样直接通过EI-GC-MS和LC-HRMS进行分析。