共轭聚合物纳米结构作为DNA纳米技术中的潜在工具：与双螺旋结构的相互作用

《ACS Omega》：Conjugated Polymeric Nanostructures as Potential Tools in DNA Nanotechnology: Interactions with the Double Helix

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我们合成了两种类型的共轭聚合物纳米颗粒（CPNs），分别由MEH-PPV（聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-苯乙烯乙烯]）和PFD（聚(9,9-二-n-十二基芴-2,7-二基)）制成，这两种纳米颗粒能与双链DNA发生显著相互作用。通过光镊进行单分子力谱分析以及原子力显微镜成像直接观察，研究了这些纳米结构与生物聚合物之间的结合机制。结果表明，这两种类型的CPNs都能在双螺旋外部协同结合，导致双螺旋弯曲，其平衡结合常数非常高，约为10^6 M^-1。因此，我们证明了共轭聚合物纳米颗粒可以利用单分子力谱技术与双链DNA发生强而协同的相互作用。这类相互作用在DNA纳米技术和功能性纳米材料领域具有广阔的应用前景，例如设计基于DNA的纳米器件以及开发用于癌症化疗的功能化纳米颗粒药物载体等。

**引言**
核酸与各种类型的纳米结构形成的复合物可以展现出多种功能和应用，例如在医学诊断和成像、新型生物传感器和器件的设计（1-3），以及药物递送载体的构建（4-6）等方面。纳米生物学的发展加速了对功能性纳米材料与生物分子之间相互作用的研究。特别是量子点（qdots）和共轭聚合物纳米颗粒（CPNs）由于其独特的光学、电子和物理化学性质，在过去几年中催生了众多新应用（7-9）。尽管取得了这些进展，但在接近生理条件的情况下，以及单分子分辨率下，对共轭聚合物纳米颗粒与核酸之间相互作用的定量物理化学表征仍然相对较少。这类定量信息对于更好地理解结合机制、协同效应以及这些纳米颗粒在基于DNA的纳米器件和功能性超分子组装中的潜力至关重要（10,11）。

在这项工作中，我们研究了两种不同类型的CPNs与双链DNA单分子之间的超分子结构形成过程。双链DNA已被证明是我们的纳米颗粒的高亲和力底物，这里使用的共轭聚合物分别为MEH-PPV（聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-苯乙烯乙烯]和PFD（聚(9,9-二-n-十二基芴-2,7-二基)）。本研究不仅关注CPNs与DNA之间的相互作用是否存在，还旨在提供它们结合亲和力、协同性以及对双螺旋结构力学影响的定量单分子表征。

通过使用光镊对形成的DNA-CPN复合物进行单分子力谱分析，我们能够表征CPN结合后双螺旋力学性质的变化。结果显示，尽管CPNs没有改变双螺旋上连续碱基对之间的自然间距，但它们仍会导致双螺旋弯曲，显著改变了复合物的有效持久长度。这些发现表明，CPNs在双螺旋外部的结合方式类似于DNA沟槽结合剂，但由于CPNs的体积较大，无法适配DNA沟槽。此外，通过测量不同CPN浓度下复合物有效持久长度的变化，我们推导出了有效结合的物理化学性质，从而确定了平衡结合常数和相互作用的协同程度等关键参数。这种定量表征有助于更深入地理解涉及共轭聚合物纳米颗粒和核酸的纳米生物界面，这是设计功能性纳米材料和基于DNA的纳米技术系统的重要领域（10,11,13,14）。

DNA与这两种CPNs之间的相互作用还通过另一种独立技术得到了验证：原子力显微镜成像。这些实验能够可视化双螺旋上结合的纳米颗粒，从而确认了它们的结合。

总体而言，这项工作提供了关于共轭聚合物纳米颗粒与DNA相互作用的详细物理化学和单分子层面的见解。这些结果为使用CPNs构建与核酸的超分子组装体打开了大门，有助于弥合纳米生物学中这些材料日益广泛的应用与对其分子水平相互作用定量理解之间的差距。这类相互作用在未来的基于DNA的纳米器件设计以及基于功能化纳米颗粒的癌症化疗药物载体开发中具有重要意义（15-20）。

**材料与方法**
**CPNs的合成与表征**
共轭聚合物纳米颗粒（CPNs）采用沉淀法（7）从共轭聚合物MEH-PPV（聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-苯乙烯乙烯]和PFD（聚(9,9-二-n-十二基芴-2,7-二基)）合成。首先将聚合物溶解在四氢呋喃（THF）中，浓度为1.0 g/L，然后迅速将1.0 mL聚合物溶液注入10 mL去离子水中，并在恒定磁力搅拌下反应5分钟。随后对所得分散液进行10分钟超声处理。最后，使用孔径为2.5 μm的纸过滤器真空过滤，以分离MEH-PPV和PFD纳米颗粒。

光学表征（紫外-可见吸收光谱和荧光光谱）使用HORIBA Fluoromax-plusC光谱仪进行，所有样品均置于室温下的石英比色皿中。CPNs的形态通过场发射扫描电子显微镜（FEG-SEM，Tescan Mira）进行观察。每种纳米颗粒溶液取20 μL样品，沉积在硅基底上并完全干燥后，再在其表面溅射一层铜，以便用FEG-SEM观察。纳米颗粒的流体动力学平均直径通过动态光散射（DLS，Zetasizer Nano S设备，Malvern Instruments）测定。测量在聚苯乙烯比色皿中进行，控制温度为（25.0 ± 0.1）°C，检测角度为173°，使用波长为632.8 nm的4 mW He/Ne激光束。仪器软件内置的CONTIN算法用于分析强度自相关函数并确定粒径分布。每个报告的值是90秒内五组各十次测量的平均值。此过程重复五次以确保准确性，并计算出平均值和标准偏差。

**光镊实验的样品制备与程序**
用于单分子力谱分析的样品包括生物素标记的λ-DNA（48,502个碱基对，New England Biolabs），其两端分别连接在streptavidin包覆的直径为3 μm的聚苯乙烯珠子上以及streptavidin包覆的玻璃盖片上（作为样品室的底部）。样品在磷酸盐缓冲液（PBS，[Na+] = 150 mM）中制备，不含纳米颗粒。在加入任何CPNs之前，先选择一根裸DNA分子并用镊子拉伸5到10次以测试其完整性。收集每次拉伸的力-延伸曲线，并将其拟合到Marko-Siggia蠕虫状链（WLC）模型（22）中，以确定两个基本力学参数：轮廓长度和持久长度。如果这些参数的平均值与接近生理条件下的裸λ-DNA分子预期值相符（轮廓长度L ～ 16.5 μm，持久长度A ～ 50 nm），则使用该分子进行实验，并将纳米颗粒引入样品中。

按所需浓度将CPNs加入样品室中，重复进行力谱分析，逐渐增加CPN浓度，并在每个固定浓度下收集力学参数的值，始终使用相同的DNA分子以确保结果的准确性。对于每种CPN浓度，至少进行5次独立测量。下一节中报告的力学参数平均值是基于相同条件下使用相同DNA分子进行的多次拉伸实验（5到10次独立测量）得到的，误差条为这些独立测量的平均标准误差。

**确定结合模式的物理化学参数**
DNA-配体复合物的持久长度A作为样品中配体浓度的函数，可以使用我们小组先前开发的淬火-无序统计模型进行建模（24）。对于简单情况（持久长度单调增加或减少），模型可表示为：
\[A = \frac{1 - r}{r_{\max}}A_0 + \frac{r}{r_{\max}}A_1\]
其中r是结合配体的比例，r_{\max}是其饱和值，A_0是裸DNA的持久长度，A_1是结合配体饱和时的持久长度。结合配体的比例r可以与描述结合的适当结合等温线关联。对于非协同结合过程，可以使用McGhee–von Hippel经典模型（21,25）。对于协同结合过程，Hill等温线已被证明是描述这种相互作用物理化学性质的良好选择（21,25）。该等温线表示为：
\[r = \frac{[K(CT - rCbp)]^n}{[K(CT - rCbp)]^n}\]
其中K是结合平衡常数，CT是样品中的配体总浓度，Cbp是样品中的DNA碱基对浓度，n是Hill指数，表示结合反应中的协同程度。如果n > 1，则结合具有正协同性，结合的配体会促进后续配体的结合；如果n < 1，则结合具有负协同性，结合的配体会阻碍后续配体的结合；如果n = 1，则结合是非协同的，配体沿双螺旋独立结合。

对于在持久长度上表现出非单调行为的复杂DNA配体，可以修改方程式（1），考虑第一邻居相互作用，表示为：
\[A = \frac{1 - A_0 + (2A_1 - 2A_0) \cdot r}{r_{\max} + (1 - A_0 - 2A_1 + 1A_2) \cdot r_{\max}^2}\]
r也可以用适当的结合等温线表示。

无论如何，通过使用这种模型拟合样品中配体浓度的持久长度实验数据，可以确定表征相互作用的结合参数。

**DNA-CPN复合物的原子力显微镜观察**
还使用原子力显微镜对与两种CPNs形成的DNA复合物进行了成像，以确认这些纳米颗粒与双螺旋的结合。实验中使用的是NT-MDT NTEGRA PRIMA设备，操作模式为敲击模式，探针为TAP300 Al-G（Budget Sensors）。样品使用3 kbp的DNA分子（ThermoFisher Sci.）在10 mM Tris-HCl缓冲液中制备，并加入100 mM MgCl2（pH 8.0），以便DNA分子附着在云母基底上。然后将CPNs加入溶液中，使其与DNA平衡约30分钟。之后，在室温（约25 °C）下用氮气将20 μL溶液完全干燥在基底上。所有实验均在空气中进行，环境温度约为50%。使用Gwyddion软件选择至少10个裸DNA和DNA复合物图像，获得其平均直径及其标准偏差。这种实验方法已被证明能够可靠地可视化沉积的裸DNA分子以及生物聚合物与配体之间形成的复合物（27-31）。

**结果与讨论**
**CPN表征**
图1显示了两种聚合物所得共轭聚合物纳米颗粒的典型归一化吸收光谱和荧光光谱。在图(a)中，展示了MEH-PPV CPNs的结果，而在图(b)中，则展示了PFD CPNs的结果。正如预期的那样，由于用于合成纳米颗粒的两种聚合物具有不同的光学性质，这些光谱之间的差异非常显著。图1显示了典型的归一化吸收光谱和荧光光谱：(a) MEH-PPV CPNs和(b) PFD CPNs。激发波长为401纳米。高分辨率图像。下载MS PowerPoint幻灯片。

图2展示了使用前一节描述的程序沉积在硅基底上的两种类型CPNs的典型场发射扫描电子显微镜（FEG-SEM）图像。从这些图像中可以清楚地看到，两种类型的CPNs在干燥基底上的平均尺寸有很大差异：MEH-PPV CPNs（图(a)）的平均直径约为100纳米，而PFD CPNs的平均直径通常是其三倍或更多。高分辨率图像。下载MS PowerPoint幻灯片。

有趣的是，动态光散射（DLS）测量结果显示，两种类型CNPs在水中的平均水动力直径相似，根据聚合物浓度的不同，范围在100到150纳米之间。(12) FEG-SEM结果与DLS结果之间的平均直径差异之前已经基于每种情况下纳米颗粒周围的水化层进行了解释。(12)

在图3中，我们展示了所研究的两种复合物（DNA–MEH-PPV和DNA–PFD）的平均轮廓长度（图(a)和(b)）以及持久长度（图(c)和(d)，这些长度是随着样品中CPN浓度的变化而变化的。图3显示了溶液中DNA与两种类型CPN形成的复合物的机械参数，作为样品中CPN浓度的函数：(a) DNA–MEH-PPV复合物的轮廓长度。(b) DNA–PFD复合物的轮廓长度。(c) DNA–MEH-PPV复合物的持久长度。(d) DNA–PFD复合物的持久长度。图(c)和(d)中的红线是对持久长度的“淬火-无序”模型的拟合，由此可以确定结合参数。高分辨率图像。下载MS PowerPoint幻灯片。

请注意，没有任何一种CPN在结合后改变了DNA的轮廓长度，这意味着这些相互作用并没有改变双螺旋中连续碱基对之间的平均间距。形成的复合物的持久长度随着纳米颗粒浓度的变化而发生显著变化，这证实了这两种类型的CPN确实与DNA双螺旋之间存在有效的相互作用。

对于MEH-PPV CPN（图(c)），持久长度表现出更复杂的非单调行为：在低浓度（<0.5 μM）时首先减小，然后增加到饱和。对于PFD CPN（图(d)），其行为更为简单：随着CPN浓度的增加而单调减小，直至饱和。这种差异可以基于两种类型CPN之间的尺寸差异来解释：两者都倾向于使双螺旋发生弯曲，从而首先减小持久长度。然而，由于MEH-PPV CPN的尺寸明显更大，预计在较高浓度下会诱导体积排斥效应，从而增加持久长度——这正是在图3(c)中所显示的。图3(c)和(d)中的红线符合前一节中介绍的“淬火-无序”模型，该模型预测了复合物的有效持久长度随样品中配体浓度的变化而变化的行为。

在MEH-PPV的情况下，使用了该模型的两点版本，因为持久长度的行为是非单调的。模型中采用了Hill结合等温线来确定相互作用的有效物理化学参数，从而可以获得关于结合亲和力和协同性的信息。对于PFD CPN，则使用了更简单的单点版本模型，因为持久长度是单调减小的，同时应用了Hill结合等温线来准确比较两种配体的结合参数。

在表1中，我们展示了从持久长度拟合得到的两种CPNs的结果。请注意，两者与DNA的平衡结合亲和常数（K）都约为10^6 M^-1，表明结合力非常强，这与许多DNA沟槽结合剂（通常约为10^6到10^8 M^-1）和插入剂（通常约为10^4到10^6 M^-1）的亲和力相当。(21,32) 此外，两种纳米颗粒的Hill指数都显著大于1，表明结合时具有正协同性。(21,32) 作为比较，协同性沟槽结合剂的Hill指数通常在2到4之间，而插入剂在与DNA结合时通常不表现出协同性（Hill指数约为1。(21,32) 最后，得到的局部持久长度A1和A2反映了CPN结合后双螺旋弯曲刚度的局部变化。

在图4中，我们展示了使用两种类型的CPN在云母基底上形成的DNA复合物的典型原子力显微镜（AFM）图像，如前一节所讨论的那样进行了扫描。这些图像确认了这两种纳米颗粒（图像中的亮点）确实与双螺旋结合。此外，我们还测量了双螺旋和结合纳米颗粒的平均直径，以确认这些样品的性质。由于AFM成像是在空气中干燥的样品上进行的，因此可能会发生结构重排和聚集效应。因此，AFM结果应被视为结合的定性确认，而不是定量结构证据。相比之下，光镊测量提供了基于溶液的定量表征。结果显示在表2中。

表2显示了从AFM图像获得的DNA和结合的MEH-PPV及PFD CPNs的平均直径和标准偏差。DNAMEH-PPVPFDDiameter (nm)2.7 ± 0.2106 ± 26.9 ± 0.6

请注意，测得的双螺旋直径在预期的范围内，约为2纳米。结合的MEH-PPV和PFD CPNs的直径也与从FEG-SEM图像（即没有DNA的情况）获得的值一致，这证实了与双螺旋结合的亮点确实是这些CPNs。因此，我们的AFM实验补充并确认了光镊实验的结果，表明我们的CPNs确实能够与DNA结合。

总之，我们首次报告了共轭聚合物纳米结构与DNA双螺旋结合亲和力和协同性的单分子机械量化，为这类结构在DNA纳米技术中的应用打开了大门。特别是由于DNA是细胞内抗癌药物的重要靶点，而纳米颗粒如今被广泛用于药物载体的设计，我们的CPNs在构建药物载体方面显示出强大的潜力。

结论

我们合成了两种类型的共轭聚合物纳米颗粒（MEH-PPV和PFD），它们在生理条件下表现出与DNA双螺旋强烈相互作用的潜力。确定了双螺旋的机械变化和相互作用的物理化学性质，表明CPNs在双螺旋外部以类似于DNA沟槽结合剂的方式协同结合，尽管在目前的情况下，由于纳米颗粒的尺寸较大，无法适应沟槽结构——这一结果应通过未来的互补技术加以验证。有效的相互作用导致生物聚合物发生弯曲，并表现出大约10^6 M^-1的强平衡结合常数。通过原子力显微镜直接成像形成的DNA-CPN复合物也证实了这两种CPN的结合。这些结果表明，共轭聚合物纳米结构可以与双链DNA强烈且协同地相互作用，这一点通过单分子力谱得到了定量验证。虽然本研究侧重于基础物理化学特性，但这种相互作用可能为DNA纳米技术和功能性纳米材料的应用带来长期的前景。