针对宿主和病毒来源抗原的免疫磁分离方法：从有限量的血浆中分离HIV-1病毒

《Analytical Chemistry》：Immunomagnetic Sample Preparation Targeting Host- and Viral-Derived Antigens for HIV-1 Isolation from Limited Plasma Volumes

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快速准确的HIV检测对于接受抗逆转录病毒治疗（ART）的个体的早期诊断和病毒载量（VL）监测至关重要。为了解决样本量有限的挑战，我们开发了一种新型免疫磁分离样品制备方法，可以从25微升血浆中分离出HIV-1病毒颗粒——这大约只相当于一个小指针刺样本的十分之一。免疫磁结合物是通过将抗小鼠IgG磁珠与针对HIV表面宿主和病毒来源抗原的小鼠IgG抗体偶联而成的。在添加了HUT-78细胞系培养的灭活HIV-1的缓冲液中，这些结合物的捕获效率达到了45-97%。通过优化结合物浓度（0.71-5.71毫克/毫升），捕获效率提高了19%，并且15分钟被确定为最佳捕获时间。在添加了HIV-1的25微升血浆样本中，针对不同表面抗原的免疫结合物能够捕获148-53,145个RNA拷贝/25微升（5,920-2,125,800个RNA拷贝/毫升）的灭活HIV-1，捕获效率一致在41%到100%之间。在HIV感染者中，病毒载量从100,000到超过1百万拷贝/毫升的临床样本中，捕获效率根据所使用的结合物不同而有所变化，范围从5%到60%。值得注意的是，结合使用识别不同表面标记物的CD44和CD46结合物并没有增强病毒颗粒的捕获效果，这表明HIV-1上同时表达了这些目标抗原。总体而言，我们的结果证明了免疫磁分离是一种有前景的HIV-1样品制备方法，可以实现更易于获取、更敏感和更快速的病毒载量定量。

引言
2023年，全球约有3990万人感染了HIV（PLHIV），其中14%的人不知道自己的感染状态。(1) 在急性感染期间（感染后<3个月），当HIV抗体尚未产生，只能检测到RNA或p24抗原时，早期诊断至关重要，因为这一阶段的感染者由于未确诊和高病毒载量（VL），占新感染病例的10-50%。(2,3) 对于接受抗逆转录病毒治疗（ART）的PLHIV患者来说，定期监测病毒载量也是必要的，以便及时发现病毒反弹并调整治疗方案。(3,4) 然而，在许多地区，进行病毒载量检测的机会仍然有限。2013年，非洲只有不到20%的接受治疗的患者能够进行病毒载量检测，(5) 到2016年，非洲只有13-37%的患者以及全球不到50%的患者能够接受定期病毒载量监测。(6) 需要多天周转时间的集中实验室检测进一步导致了患者无法继续随访；例如，2015年，华盛顿特区的25%的确诊患者和南非约33%的患者因检测延迟而未能继续接受治疗。(7) 这些障碍凸显了迫切需要快速、便捷的病毒载量检测平台。

虽然快速和分散式的检测技术扩大了HIV筛查和监测的覆盖范围，但在样本量有限的情况下，现有的工作流程仍然面临显著的分析限制。(2,3,8) 第四代快速检测方法，如Alere Determine HIV-1/2 Ag/Ab Combo，可以检测到大约在感染后两周出现的p24抗原，但在急性感染期的检测效果较差，特异性较低（0.983）。(8) 这些抗原/抗体检测方法也不适合监测接受ART治疗的患者的病毒反弹。基于核酸扩增技术（NAAT）的设备，如GeneXpert HIV-1病毒载量检测仪，虽然集成了样品制备、扩增和检测功能，但成本较高，需要稳定的基础设施，并且通常需要约1毫升的血浆，因此需要进行抽血和离心操作。(9,10) 因此，检测灵敏度的提高往往是以牺牲样本量和操作复杂性为代价的。

尝试将NAAT技术适应于更小体积（<100微升）的样本也遇到了挑战。低体积样本中RNA拷贝数较少，且随着样本量的减少，提取效率会不成比例地下降，从而加剧了处理和纯化过程中的损失。(4,10?12) 例如，使用100微升全血进行的Xpert HIV检测的检测限（LoD）约为200-300个拷贝/毫升，(13,14) 而使用1毫升血浆时则为约5个拷贝/毫升。(15) LIAT Analyzer (IQuum) 通过引入基于磁珠的RNA富集技术提高了灵敏度，但仍需要150-200微升血浆或75微升全血才能达到57个拷贝/毫升的检测限。(4,12) 这些观察结果表明，在微量病毒载量检测中，RNA提取效率——而不仅仅是扩增化学过程——成为主要限制因素。

比较研究表明，使用较大体积的血浆（如25微升）可以显著提高检测效果。使用25微升血浆时，Amplicor检测方法的检测限约为164个拷贝/毫升，而将样本量增加到500微升并使用QIAamp提取技术后，检测限降低到约15个拷贝/毫升。(16) 类似地，将样本量从25微升增加到250微升时，检测限从400个拷贝/毫升降低到50个拷贝/毫升。(17) 尽管某些专门设计的方法可以使用少至25-50微升的血浆进行检测，(18) 但由于目标拷贝数减少和处理过程中的损失增加，提取效率通常会下降。对于指尖采血和儿科样本来说，小体积检测仍然具有价值，改进从小体积血浆中分离病毒颗粒和回收RNA的方法可能有助于减轻体积依赖性的性能损失，并支持更可靠的病毒载量测量。

免疫磁分离病毒颗粒提供了一种有前景的解决方案。这种策略已成功应用于SARS-CoV-2和流感等病毒，能够提高RNA的完整性，减少抑制剂的影响，并提高NAAT工作流程的灵敏度。(19?22) 重要的是，同时靶向病毒表面抗原和在病毒出芽过程中结合到HIV包膜中的宿主来源抗原，可以提高捕获特异性并减少对大量血浆处理的依赖。(23?26) 在本研究中，我们将免疫磁分离病毒颗粒定义为一种模块化的、保持样本体积的样品处理步骤，专门适用于微量HIV病毒载量检测（≤25微升血浆），在这种条件下，传统的基于提取的工作流程会经历不成比例的RNA损失和降低的分析灵敏度。本研究的主要创新之处不在于引入新的磁珠化学物质或捕获结构，而在于系统地选择和验证结合到HIV包膜中的宿主来源抗原作为捕获目标，并建立一个分析上受限的操作框架，以实现可靠的病毒颗粒回收。通过使用标准化的、市售试剂和工作流程，我们独立于材料创新来评估捕获步骤的分析贡献，能够与现有的小体积工作流程直接比较，并促进实验室间的可重复性和应用。在这个框架内，我们评估了在不同病毒载量和样本体积条件下的捕获性能，从而确定了免疫磁分离病毒颗粒支持敏感和可扩展的微量HIV核酸检测的条件。

实验部分
材料
MagnaBind山羊抗小鼠IgG磁珠，产品编号21354，Thermo Scientific；Alexa Fluor 488荧光标记的全分子小鼠IgG，产品编号015540-003，Jackson ImmunoResearch Europe LTD；HIV-1培养液（热灭活，HUT 78细胞系来源，2.6 × 10^10拷贝/毫升），产品编号0801032CFHI；HIV RNA，产品编号VR-3351SD，ATCC；牛血清白蛋白，产品编号A2153，Sigma；RNA UltraSense一步定量RT-PCR系统，产品编号11732927，Thermo Scientific；人血浆（50毫升），Innovative Research, Inc.

小鼠IgG抗体：
CD8 (UCH-T4)，产品编号sc-1181，Santa Cruz Biotechnology, Inc.；
CD18 (整合素β-2)，克隆ID H52-s，DSHB（发育研究杂交瘤库）；
HIV1gp120，产品编号sc-57810，Santa Cruz Biotechnology, Inc.；
CD26，产品编号555435，BD Pharmingen；
整合素α-4，克隆ID P4G9，DSHB；
CD43 (DF-T1)，产品编号sc-6256，Santa Cruz Biotechnology, Inc.；
CD46 (1E3D1)，产品编号MA5-29113，Invitrogen；
β2-微球蛋白 (B2M-01)，产品编号MA1–19141，Invitrogen；
整合素α-L (CD11a)，克隆ID MHM.24，DSHB；
CD86 (B7-2)，克隆ID IT2.2，Invitrogen；
CD44，克隆ID H4C4，DSHB；
ICAM1，克隆ID P2A4，DSHB；
CD45，克隆ID H5A5，DSHB；
HLA-DR，克隆ID LN3，产品编号14-9956-82，Thermo Fisher Scientific；
Tim-4（人）：Fc（小鼠）（重组），产品编号CHI-HF-211T4-C100，AdipoGen Life Sciences；
IgG1，K型，产品编号555746，BD Pharmingen。

免疫磁结合物的制备
结合物的制备是通过按照制造商的改良方案（MagnaBind，Thermo Scientific）将小鼠IgG固定在抗小鼠IgG磁珠上完成的。MagnaBind山羊抗小鼠IgG磁珠是超顺磁性颗粒（直径1-4微米），用于抗体固定和基于免疫捕获的分离实验。(27,28) 这些磁珠能够实现高效的抗体固定和快速磁分离，从而在本研究中从少量血浆中有效分离病毒颗粒。具体步骤如下：1毫克磁珠（1毫克/毫升，108颗磁珠/毫克）用1毫升pH 7.4的PBS缓冲液洗涤三次，然后重新悬浮在含有0.1% BSA的250微升PBS中，最终磁珠浓度为1毫克/250微升。取200微升磁珠悬浮液（含0.8毫克磁珠），加入1-8微克小鼠IgG，使总反应体积达到300微升。在室温下用转子轻轻混合20分钟。孵育后，用含有0.1% BSA的无菌PBS洗涤磁珠三次。最终结合物重新悬浮在含有0.1% BSA的139微升无菌PBS中。对于Tim-4结合物的制备，使用TBS或含有0.1% BSA的TBS代替PBS。

病毒RNA的提取和定量（使用RT-qPCR）
病毒RNA使用Qiagen病毒RNA提取和纯化试剂盒按照制造商的方案进行提取和纯化，但稍作修改。将结合在磁珠上的病毒颗粒从HIV阳性血浆或添加了HIV的缓冲液中分离出来，洗涤两次，然后重新悬浮在含有0.1% BSA的PBS中。将混合物与含有载体RNA的裂解缓冲液按1:4的比例混合，涡旋后室温（15-25°C）孵育10分钟以确保完全裂解。然后通过磁分离去除磁珠。向裂解后的样本中加入等体积的96-100%乙醇，涡旋后加入QIAamp Mini柱中，以6,000 × g离心1分钟。弃去上清液，保留柱子进行进一步洗涤。用Washing Buffer-1（Qiagen）洗涤结合的RNA两次，再用Washing Buffer-2洗涤两次。最后一次洗涤后，直接向柱膜中加入60微升预平衡的Elution Buffer（Qiagen）以洗脱纯化的RNA。纯化的RNA在-80°C下保存待进一步分析。使用针对HIV-1 LTR基因保守区域的内部RT-qPCR试剂盒进行RNA拷贝数测定，通过与已知RNA浓度（ATCC HIV-1 RNA）的标准曲线比较来确保准确和精确的定量。

灭活HIV-1病毒颗粒的免疫捕获
将灭活的HIV-1病毒颗粒（HIV-1 IIIB株，来源于HUT-78细胞系）以大约10^2至10^6个RNA拷贝的浓度加入含有0.1% BSA的PBS中。在2毫升Eppendorf管中进行免疫捕获实验，将0.8毫克免疫磁结合磁珠与140微升添加了HIV的缓冲液混合。除非另有说明，否则在室温下孵育1小时，并用转子轻轻混合。孵育后，用含有0.1% BSA的PBS洗涤磁珠三次以去除未结合的病毒颗粒。然后将磁珠重新悬浮在含有0.1% BSA的140微升PBS中，并使用病毒RNA提取试剂盒（RNA UltraSense一步定量RT-PCR系统，Thermo Scientific）按照制造商的方案进行RNA提取。RNA定量使用针对HIV-1 LTR基因保守区域的内部RT-qPCR试剂盒进行。捕获效率（%）计算为捕获的HIV RNA拷贝数与输入RNA拷贝数的比例，并将免疫磁结合磁珠与对照磁珠（未结合磁珠或同型对照）进行比较。还测量了对照磁珠的非特异性捕获情况，并在扣除非特异性RNA捕获值后确定特异性捕获效率。为了评估结合物数量对捕获效率的影响，使用不同量的HLA-DR免疫磁结合物（0.1、0.2和0.8毫克）与灭活的HIV-1孵育。对于Tim-4结合物的制备，使用TBS或含有0.1% BSA的TBS代替PBS。

最佳孵育时间的评估
使用添加了灭活HIV-1（约100,000个RNA拷贝/微升）的人血浆进行优化实验。每个分离实验使用25微升添加了HIV的血浆、115微升含有0.1% BSA和0.8毫克抗HLA-DR结合物的PBS。混合物在室温下用转子孵育15、30或60分钟。孵育后，用含有0.1% BSA的PBS洗涤磁珠三次以去除未结合的病毒颗粒。然后按照前述方法进行RNA提取和定量。同时处理对照磁珠（未结合或同型磁珠）以进行比较。每个时间点的捕获效率（%）计算为捕获的HIV RNA拷贝数与输入RNA拷贝数的比例。**不同病毒载量下捕获效率的评估**

使用添加了灭活HIV-1的人血浆来评估样本病毒载量（VL）对捕获效率的影响。低VL样本含有148–401个RNA拷贝/25 μL，高VL样本含有5221–53,145个RNA拷贝/25 μL。病毒颗粒的分离按照先前的方法进行（优化孵育时间），孵育时间为1小时。RNA提取和定量使用Qiagen病毒RNA提取和纯化试剂盒完成。评估使用了针对HLA-DR、CD44、β2-微球蛋白、CD26和Tim-4-mFc的结合物。同时处理了未结合或同型的对照珠子以进行比较。捕获效率（%）是通过捕获的HIV RNA拷贝数与输入RNA拷贝数的比例来计算的。

**HIV阳性血浆样本中捕获效率的评估**

为了评估免疫磁结合物在临床样本中的性能，我们从华盛顿大学（西雅图）的艾滋病研究中心（CFAR）获取了病毒载量不同的HIV阳性血浆样本。患者ID #1236、2048、1654、1087、1266和1364的VL分别为107,024、160,584、383,964、1,393,440、126,000和186,048拷贝/mL，这是通过我们内部的RT-qPCR测量的。每个病毒颗粒分离实验使用了25 μL血浆、115 μL含有0.1% BSA的PBS和0.8 mg的针对不同抗原的结合物。病毒颗粒的分离按照先前的方法进行（优化孵育时间），孵育时间为1小时。RNA提取和定量同样按照先前的方法进行。捕获效率（%）是通过捕获的HIV RNA拷贝数与输入RNA拷贝数的比例来计算的。同时处理了对照珠子以测量非特异性捕获。

**不同血浆体积下捕获效率的评估**

为了评估在不同输入病毒载量（VL）下捕获效率的一致性，我们将HIV阳性血浆（ID #1654，VL约384,000拷贝/mL）用PBS稀释至最终体积140 μL，每个样本使用2–50 μL血浆。这相当于输入RNA拷贝数在1,295到14,268之间，也是通过内部RT-qPCR测量的。将针对CD46的结合物（0.8 mg）与样本在室温下孵育1小时。病毒颗粒的分离、RNA提取和定量按照先前的方法进行。计算了每个血浆体积的捕获效率，并进行了Spearman相关性分析，以评估输入VL与捕获效率之间的关系。

**HIV-1捕获的结合物组合评估**

评估使用了HIV阳性血浆（ID #1654，VL约384,000拷贝/mL）。每个实验包括将25 μL血浆与115 μL含有0.1% BSA的PBS和0.8 mg的结合物混合。在室温下孵育1小时后，按照先前的方法进行病毒颗粒分离、RNA提取和定量。捕获效率（%）是通过捕获的HIV RNA拷贝数与输入RNA拷贝数的比例来计算的。测试了五个实验组：无捕获对照组（无结合物）、同型对照组（结合物与非特异性小鼠IgG）、针对CD44的结合物、针对CD46的结合物以及同时针对CD44和CD46的结合物。

**统计分析**

所有实验至少进行了三次独立重复。两组之间的统计比较使用非参数Mann–Whitney U检验进行，多组之间的比较使用Kruskal–Wallis检验进行。p值<0.05被认为具有统计学意义。

**结果**

**免疫磁结合物捕获添加到缓冲液和健康人血浆中的灭活HIV**

为了选择性地捕获HIV-1，我们开发了多种免疫磁结合物，通过将抗小鼠IgG包被的磁珠与特异性识别HIV-1病毒颗粒表面标记或宿主抗原的小鼠IgG抗体耦合。表1提供了HIV包膜上目标抗原的文献综述，按HIV获取这些抗原的细胞类型和它们主要表达的感染阶段进行分类。(29?43)

**表1. HIV包膜上目标抗原的概述**

| 目标抗原 | 主要涉及的宿主细胞 | 基于感染阶段的抗原在HIV上的相对可用性 |
|------------------|------------------|--------------------------------------|
| gp120 | 急性HIV感染 (30) | |
| gp41 | 急性HIV感染 (30) | |
| CD26 | T淋巴细胞和单核细胞 | HIV感染 (31) |
| CD43 | T淋巴细胞 | HIV感染 (32) |
| CD44 | T淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞 | 急性=慢性HIV感染 (34) |
| CD45 | T淋巴细胞和单核细胞 | HIV感染 (35) |
| CD46 | 树突状细胞 | HIV感染 (36) |
| CD86 | 巨噬细胞和树突状细胞 | HIV感染 (37) |
| CD54 (ICAM-1) | T淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞 | HIV感染 (41) |
| CD11a (LFA-1) | T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞 | HIV感染 (31,38,41) |
| 整合素α4 | 肠相关T淋巴细胞 | 急性感染 > 慢性感染 (40) |
| β2-微球蛋白 | 核细胞 | HIV感染 (42) |
| 磷脂酰丝氨酸 | 富集在宿主细胞膜中 | HIV感染 (43) |
| HLA-DR | 树突状细胞和巨噬细胞 | 慢性感染 |

这些抗原根据参与其存在的细胞类型和它们在HIV上主要表达的感染阶段（急性或慢性）进行分类。

免疫细胞是HIV-1感染的主要细胞。在感染后约10天的潜伏期，原始病毒能够更有效地感染CD4+ T细胞，而不是单核细胞和巨噬细胞（McMichael等人，2010年）。

**确定磁珠与小鼠IgG的结合能力**

使用Alexa Fluor标记的小鼠IgG作为模型分析物。我们的结果表明，在1 mL缓冲系统中，每0.8 mg磁珠大约可以结合1 μg的小鼠IgG（图S1）。我们假设，当使用相同的标准化固定协议时，这种结合能力对于所有针对宿主或病毒抗原的小鼠IgG都是一致的。理论上，1 μg/mL的IgG抗体（约6.67 nM），假设解离常数（KD）为6.67 nM，可以在抗原浓度低于0.1 nM（约10^13分子/L）时识别≥50%的目标抗原。考虑到每个病毒颗粒表面约有30个gp120分子，(45?48) 平衡结合模型表明，当VL ≤10^9病毒颗粒/mL时，1 μg/mL的IgG抗体（0.8 mg/mL磁珠）可以结合≥50%的表面抗原。尽管这些计算基于特定假设，但它们为本研究中的高效HIV捕获所需的抗体量提供了合理的估计。

通过测量从140 μL添加了病毒颗粒的缓冲液或血浆中捕获并回收的HIV-1病毒颗粒的百分比来评估免疫磁结合物（通过RT-qPCR量化，见“材料与方法”中的“捕获缓冲液中的灭活HIV-1”部分）。当将HUT-78细胞系中培养的灭活HIV-1添加到缓冲液中时，针对HLA-DR、Tim-4:Fc（人Tim-4和小鼠Fc）、CD44、β2-微球蛋白和CD26的结合物表现出抗原特异性的病毒颗粒捕获，平均捕获效率在45%到97%之间（图1B）。相比之下，仅含珠子和同型对照物的非特异性捕获率低于30%。基于表面抗原目标的捕获效率顺序为：HLA-DR > Tim-4:Fc > β2-微球蛋白 > CD44 > CD26。针对gp120、gp41、CD18、CD11a、CD43、CD46、CD45和整合素α4的结合物的捕获效率与对照组观察到的非特异性背景捕获相似或更低。这表明这些标记在HUT-78细胞系中培养的灭活HIV-1病毒颗粒上要么极少存在，要么完全不存在。

**高分辨率图像**

我们选择了抗HLA-DR结合物（图1B中捕获效率最高的）来评估捕获效率随结合物数量的变化（图1C）。将结合物数量从0.1 mg（0.71 mg/mL）增加到0.2 mg（1.43 mg/mL）和0.8 mg（5.71 mg/mL）后，平均捕获效率从59%提高到90%。同样，增加仅含珠子和同型对照物的数量（对应相同的浓度）也导致非特异性捕获效率成比例增加（15–29%）。扣除同型对照组观察到的非特异性捕获后，HLA-DR免疫结合物的估计特异性捕获率在43–62%之间，表示当结合物数量从0.71 mg/mL增加到5.71 mg/mL时，捕获效率净增加了近20%。使用5.71 mg/mL的抗HLA-DR结合物时，平均捕获效率达到最大，从含有150,000个HIV-1 RNA拷贝的140 μL缓冲液中分离出高达90%的病毒颗粒。

**确定生物学相关基质中的最佳捕获时间**

为了确定最佳捕获时间，在25 μL的健康人血浆中添加了灭活HIV-1（约14,000个RNA拷贝），并与抗HLA-DR结合物（5.71 mg/mL）或对照珠子孵育15至60分钟。图1D显示了在不同时间点抗HLA-DR结合物和仅含珠子对照物的捕获效率。在所有测试的孵育时间，结合物的捕获效率显著更高（p < 0.05，范围为63%至82%），而仅含珠子对照物的捕获效率为15%至30%。然而，在比较15分钟、30分钟和60分钟的结合物捕获效率时，没有观察到显著差异（p > 0.05），这表明至少15分钟的捕获时间足以有效捕获HIV-1。为了确保实验的一致性，除非另有说明，所有后续实验都使用了1小时的捕获时间。

**评估免疫结合物从不同VL水平的少量样本中捕获病毒颗粒的能力**

我们将灭活HIV-1添加到25 μL的健康人血浆中，以创建低VL样本（148–401个RNA拷贝）和高VL样本（5,221–53,145个RNA拷贝），并基于它们在添加到缓冲液中的成功情况测试了针对HLA-DR、CD44、β2-微球蛋白、CD26和Tim-4:Fc的结合物（图1B）。图1E显示了在血浆中添加HIV-1时，仅含珠子对照物和免疫磁结合物的捕获效率。在低VL样本中，仅含珠子和同型对照物的平均捕获效率分别为9–14%和高VL样本中分别为19–30%，表明存在非特异性捕获。对于HLA-DR、CD44、β2-微球蛋白、CD26和Tim-4:Fc，各结合物的平均效率分别为100%、65%、53%、43%和74%。对于每种结合物，在低VL和高VL样本之间没有观察到平均捕获效率的显著差异，表明其在不同VL下的性能一致。

**从临床样本中捕获HIV-1的免疫磁结合物**

为了评估从临床样本中捕获病毒颗粒的效率，将结合物与25 μL的HIV阳性血浆孵育。测试了病毒载量范围为107,024至1,393,440 RNA拷贝/μL的血浆样本（n = 3–5）。不同表面抗原目标的平均捕获效率总结在图2A中：CD54（5%）、CD11a（5%）、整合素α4（16%）、β2-微球蛋白（14%）、Tim-4:Fc（18%）、HLA-DR（28%）、CD43（29%）、CD46（37%）和CD44（50%）。值得注意的是，针对HLA-DR、CD43、CD46和CD44的结合物表现出显著更高的平均捕获效率（p < 0.05），与同型或仅含珠子对照物观察到的非特异性捕获（3–4%）相比。相比之下，针对gp120、gp41、CD26、CD45和CD86的结合物的捕获效率与对照组观察到的非特异性背景相似。作为阴性对照的健康血浆未检测到HIV RNA。为了进一步评估捕获性能在临床样本中的可重复性，计算了四个最有效目标的变异性指标。在患者血浆样本中，平均捕获效率及其相关变异性如下：HLA-DR（平均28%，CV 31%，95% CI 22–33%），CD43（平均29%，CV 24%，95% CI 23–34%），CD46（平均37%，CV 36%，95% CI 27–47%），以及CD44（平均50%，CV 30%，95% CI 41–58%）。这些结果表明，使用免疫磁珠结合物可以从PLHIV的临床血浆中特异性捕获HIV-1，尤其是针对HLA-DR、CD43、CD46和CD44抗原的结合物。

图2. 免疫磁珠结合物从临床样本中捕获HIV-1的过程。使用了五种病毒载量在10^7,024到1,393,440拷贝/mL之间的样本。每个样本的技术重复次数为2-3次，每种结合物的临床样本使用次数为3-5次，除了gp120、gp41、CD45、CD86、ICAM-1和CD11a/CD18 LFA-1（每种样本使用1次）。A. 与HIV阳性血浆孵育的免疫磁珠结合物捕获的HIV-1百分比。健康人血浆作为阴性对照。珠子或同型对照显示非特异性捕获HIV-1。B. 与25 μL患者样本孵育的免疫磁珠结合物捕获的HIV-1 RNA拷贝数。C. 与逐渐增加体积的HIV阳性血浆（ID #1654，VL：384,000拷贝/mL）孵育的CD46免疫磁珠结合物捕获的HIV-1 RNA拷贝数，体积范围从2到50 μL（每个样本的技术重复次数为2-3次）。D. 与患者血浆（ID #1654，VL：384,000拷贝/mL）孵育的CD46和CD44免疫磁珠结合物组合捕获的HIV-1百分比。单独使用CD44（1.6 mg）和CD46（1.6 mg）或联合使用（各0.8 mg，总计1.6 mg）。无捕获对照显示了25 μL HIV阳性血浆中的输入拷贝数，通过RT-qPCR测量。同型对照显示IgG同型武装微珠的非特异性捕获。无捕获对照作为不同血浆体积中的HIV RNA拷贝基线（每个样本重复次数为1-3次）。

为了研究病毒载量（VL）对结合物捕获效率的影响，将患者样本分为低VL组（100,000–200,000拷贝/mL；4个样本，每个样本2–6次重复）和高VL组（>1,000,000拷贝/mL；1个样本，2次重复）。在低VL组（ID #1236、1266、2048和1227），对照（同型和珠子）的捕获率<1–7.2%（图2B）。在高VL组（ID #1087），非特异性捕获背景<2.5%。在低VL组中，针对整合素α4、β2-微球蛋白、Tim-4:Fc、HLA-DR、CD43和CD44的结合物的平均捕获效率分别为13–50%。在高VL组中，平均捕获效率分别为13–63%（图2B）。与这些发现一致，对四个独立HIV阳性患者样本（VL在107,000到186,000拷贝/mL之间）的分析显示，CD44靶向捕获的平均捕获效率为42%，CV为34%，95% CI为32–52%。这些结果证实了先前在人工样本中的发现（图1E），表明免疫磁珠结合物的捕获效率在不同VL的样本中保持一致。

为了进一步评估病毒颗粒分离的一致性，我们将CD46结合物与患者样本（VL约为384,000拷贝/mL）在2、10、25和50 μL的样本体积下孵育（每个体积3次重复），结果输入的HIV-1 RNA拷贝数从1,295增加到14,268（图2C）。对于2到50 μL的血浆体积，分离出的HIV RNA拷贝数的平均值分别从333增加到4,328。相对于同一样本的标准提取（无免疫捕获步骤）方法测量的总RNA输入，平均捕获效率范围为26–42%。这一范围对应于输入体积下RNA回收率大约2倍的变异性，以及在此评估的特定条件下由于免疫捕获过程导致的RNA信号损失58–74%。重要的是，平均捕获效率（%）与输入的HIV拷贝数之间没有显著相关性。

为了进一步提高病毒颗粒捕获效率，我们研究了结合CD46和CD44靶向结合物的潜力。我们假设由于这些结合物针对病毒颗粒上的不同抗原，它们的组合可以提高捕获效率。图2D显示了单个和组合结合物捕获的HIV RNA拷贝数。每个实验使用了来自PLHIV的25 μL血浆，其中含有9,624个HIV RNA拷贝。同型对照组显示出<2%的非特异性捕获。与先前的结果（图2B）一致，抗CD44和抗CD46结合物的平均捕获效率分别为85%和40%（图2D）。然而，结合抗CD44和抗CD46结合物的平均捕获效率接近60%，这与单独使用抗CD44或抗CD46结合物没有显著差异（p > 0.05）。这表明这些抗原在同一病毒颗粒上共表达，组合使用并没有额外的好处。

在这项研究中，我们介绍了一种新的样本制备方法，该方法使用免疫磁珠结合物特异性地捕获病毒表面抗原和在病毒出芽过程中整合到病毒包膜中的宿主细胞来源的抗原。该方法旨在满足微量HIV检测的严格拷贝数和样本体积限制，并作为一个模块化的上游处理步骤，而不是一个完整的诊断测试。该方法使用25 μL的血浆样本，使其适用于指尖采血。结合物在室温下与病毒颗粒快速孵育15分钟，然后通过磁分离，确保了高效且干净的样本准备，适合后续的扩增过程。在定义的分析限制条件下优化了珠子浓度和孵育时间，包括每个珠子的抗体密度有限、血浆输入体积小（25 μL）、临床相关的病毒载量范围以及患者样本之间的生物学变异性。这些条件对质量平衡有严格限制，即使是轻微的病毒颗粒损失也会显著影响分析灵敏度。在这种受限条件下，优化的参数可以在不同的抗原目标、病毒载量和样本来源之间实现可重复的病毒颗粒捕获。通过选择性地通过宿主和病毒来源的表面标记物分离病毒颗粒，这种方法提高了检测特异性。通过对宿主和病毒来源的抗原进行系统的直接比较，我们确定HLA-DR、CD46和CD44是最有效的捕获目标，在广泛的临床病毒载量范围（10^3–10^6拷贝/mL）内表现出可重复的性能。重要的是，观察到的分析灵敏度约为每25 μL血浆148个拷贝（5,920拷贝/mL），支持了这种方法在低病毒载量检测中的可行性，因为在这些情况下拷贝数限制最为严格。

免疫磁珠结合物是通过将识别目标抗原的小鼠IgG固定在抗小鼠IgG包被的磁珠上来制备的。针对宿主抗原如HLA-DR、CD44、CD26、β2-微球蛋白和Tim-4的结合物在 spiked灭活病毒颗粒（在HUT-78细胞中生长）或临床血浆样本中的活病毒颗粒中显示出比病毒抗原gp120和gp41更高的捕获效率。Cantin等人也证明了针对HLA-DR的HUT-78细胞中生长的病毒颗粒的有效捕获。(49) gp120和gp41的低捕获效率可能归因于多种因素。首先，gp120和gp41在病毒颗粒表面的数量有限，而像HLA-DR和β2-微球蛋白这样的宿主来源蛋白质在出芽过程中更多地整合到病毒包膜中。(33,34,40,50,51) 其次，gp120的高糖基化形成了一个糖链屏障，降低了免疫磁珠结合物的可及性。(52?54) 此外，在PLHIV中，循环抗体可以与gp120和gp41结合，形成免疫复合物，掩盖病毒颗粒表面的这些抗原。(55) 最后，gp120和gp41在不同HIV菌株之间表现出高度的遗传和结构变异性，这可能限制了免疫磁珠结合物的结合效率。(56)

我们进一步评估了在微量病毒载量检测相关定义的边界条件下的捕获性能，包括结合物量、孵育时间和病毒载量。将结合物浓度从0.71–5.71 mg/mL增加，捕获效率提高了近20%，表明当样本体积和目标拷贝数受到限制时，增加免疫磁珠结合物的可用性可以提高与HIV病毒颗粒上目标抗原的结合。然而，当孵育时间在15到60分钟之间变化或在不同VL的样本之间变化时，捕获效率没有显著变化。这种一致性表明有效的抗原识别发生得很快，不需要长时间的孵育或高目标丰度。这在小体积检测中尤为重要，因为随机损失会不成比例地影响分析性能。

抗CD44结合物在HIV阳性血浆中的平均捕获效率最高，约为50%，与先前报道的26%到70%的捕获效率一致。(33,34) 然而，针对在HUT-78细胞系中生长并在缓冲液中添加的灭活病毒颗粒时，效率明显较低，为24%。有趣的是，CD46和CD43结合物在HIV阳性血浆样本中的捕获效率分别为29%和37%，尽管在对灭活病毒颗粒时没有明显的捕获效果。HLA-DR免疫磁珠结合物在HIV阳性血浆中的捕获效率为28%，而在灭活病毒颗粒中的捕获效率显著更高，为62%。同样，β2-微球蛋白在HIV阳性血浆中的捕获效率为14%，而在灭活病毒颗粒中的捕获效率为22%。这些发现表明，来自HUT-78细胞系的病毒颗粒和在PLHIV中循环的病毒颗粒上的抗原表达存在差异，可能反映了病毒颗粒来源于不同的宿主细胞类型（例如巨噬细胞和T淋巴细胞）。先前的研究已经确定，像CD44、HLA-DR和β2-微球蛋白这样的标记物同时存在于来自巨噬细胞和T淋巴细胞的病毒颗粒上。因此，针对这些双重标记物可以有效地捕获来自不同细胞类型的病毒颗粒。(33)

尽管我们没有评估不同感染阶段（急性或慢性）的捕获效率变化，但我们的结果以及现有文献表明，病毒颗粒上的抗原表达取决于它们在不同感染阶段来源的细胞类型，这可能会影响捕获效率。先前的研究表明，基于CD44的捕获效率在急性感染和慢性感染阶段之间相对一致，而基于HLA-DR的捕获效率在慢性感染期间增加。(33) 同样，Guzzo等人报告说，像整合素-α4β7这样的抗原在急性阶段更多地整合到病毒颗粒中，但在慢性阶段减少，导致捕获效率变化。(40) 这些发现强调了宿主抗原在病毒颗粒上的表达的动态性质，并进一步强调了选择在多种生物学背景下保持一致表达的宿主来源目标的重要性，特别是在目标是从有限样本体积中可重复回收的情况下。

我们没有观察到当同时使用CD44和CD46免疫磁珠结合物时，与单独使用任一结合物相比，病毒颗粒捕获效率有任何改善。这表明这两种表位可能同时存在于同一病毒颗粒上，并且可以使用单独的结合物有效捕获，它们的组合没有额外的好处。然而，结合针对不同细胞类型（如巨噬细胞和T淋巴细胞）的宿主抗原的免疫磁珠结合物，可能会提高捕获效率并提高检测病毒载量的灵敏度。尽管这项研究没有评估在完全集成的样本到结果工作流程中的免疫捕获，但从25 μL血浆中观察到的回收率表明，免疫磁珠富集可以增加来自小样本的有效分析输入，并有可能提高相对于直接提取的实际检测限（LoD）。因此，本研究评估了免疫磁珠病毒颗粒捕获的分析优势，相对于已知在微量检测中主导灵敏度的提取损失。先前在多个病毒平台上的研究表明，RNA提取效率强烈影响低输入体积和拷贝数下的下游检测性能，提取效率低下会导致信号损失和假阴性结果。(57?59) 例如，Guan等人报告说，尽管优化的提取工作流程（约80%的效率）能够检测到每个反应5个拷贝，但在处理含有约10^3拷贝/mL的40 μL血浆时，RNA回收率降低到30–50%。(60) 相比之下，我们的结果显示从含有约6,000–16,000拷贝/mL的25 μL血浆中几乎定量回收（约100%），证明了免疫磁珠病毒颗粒捕获可以在低体积条件下保留更多的目标。虽然这项研究没有声称与完全集成的平台相比有更好的检测限，(61?63) 但观察到的回收率表明，免疫磁珠富集可以在低体积条件下显著增加下游扩增分析的有效输入。然而，我们承认，当前的数据并没有确定观察到的捕获效率是否足以降低完全集成小体积检测中的实际LoD。这里使用了台式RT-qPCR来严格评估捕获步骤，使其效率、特异性和可重复性独立于下游扩增偏差，同时定义了可以转移到集成格式中的操作条件。总之，本研究明确了免疫磁捕获技术在微量血浆样本中检测HIV病毒颗粒的分析行为和操作范围。该方法能够在15分钟内实现快速捕获，在25微升HIV阳性血浆中检测到少至约148个HIV RNA拷贝。值得注意的是，捕获效率在所有测试的患者样本中均保持一致，且不受病毒载量（VL）从10万到超过100万拷贝/毫升变化的影响。宿主来源的标记物，如CD44、HLA-DR和β2-微球蛋白，是特别有效的捕获目标，即使在细胞系来源与患者来源的病毒颗粒之间存在抗原结合差异的情况下，也能实现选择性的病毒颗粒回收。这些结果表明，即使样本体积较小，通过可重复的病毒颗粒回收方法仍能保证有效的分析数据输入，这是实现敏感病毒载量测量的前提条件。作为一种即插即用的样本处理模块，这种免疫磁捕获技术可以集成到多种扩增和检测技术之前，支持未来开发无需大量血浆样本或复杂预处理步骤的低体积HIV检测流程，并将其分析应用范围扩展到本研究评估的具体目标和流程之外。此外，使用标准化、市售的试剂和试剂盒，可以直接与现有的低体积检测流程进行比较，有助于独立于材料创新来评估捕获步骤的分析贡献，并提高其他实验室的可重复性和采用率。这些特性对于分析方法的发展至关重要。