伊斯坦布尔安纳托利亚地区狗体内首次严格意义上的棘球绦虫（Echinococcus granulosus sensu stricto）的分子检测：一种多方法学研究途径

《Acta Parasitologica》：First Molecular Detection of Echinococcus granulosus Sensu Stricto in Dogs from Istanbul’s Anatolian Side: A Multi-methodological Approach

　　摘要
目的
囊性包虫病（CE）是一种由广义棘球绦虫（Echinococcus granulosus sensu lato，简称s.l.）的幼虫阶段引起的动物源性疾病。伊斯坦布尔庞大的流浪狗数量对人类囊性包虫病的传播构成了重大风险。然而，关于犬类中广义棘球绦虫的流行率和基因型研究仍然有限。本研究旨在通过显微镜检查、粪便酶联免疫吸附测定（Copro-ELISA）和分子诊断方法，确定伊斯坦布尔安纳托利亚地区流浪狗体内广义棘球绦虫的存在及其基因型。

方法
从七个地区的流浪狗中收集了110份粪便样本。样本使用改良的福尔马林-乙酸乙酯沉淀法（mFEAS）进行检测。通过商业ELISA试剂盒检测粪便抗原。提取基因组DNA，针对线粒体CO1基因进行PCR扩增，并对阳性扩增子进行测序和系统发育分析。

结果
显微镜检查在2份样本（1.8%）中发现了绦虫卵，这些结果通过分子方法得到了确认。Copro-ELISA检测出7份阳性样本（6.4%），但这些样本均未通过分子和显微镜方法得到证实。测序分析显示，在Sultanbeyli和Beykoz地区的2只狗体内发现了狭义棘球绦虫（Echinococcus granulosus sensu stricto，简称s.s.，基因型G1）。系统发育分析表明，这两种分离株都属于狭义棘球绦虫（G1–G3）支系。

结论
本研究首次在伊斯坦布尔安纳托利亚地区的流浪狗中分子水平上确认了狭义棘球绦虫的存在，表明该地区存在活跃的动物源性疾病传播潜力。Copro-ELISA与分子/显微镜检测结果之间的差异强调了采用多方法学研究的必要性。为了降低囊性包虫病对公共卫生的威胁，继续开展流行率研究和在“同一健康”框架下的分子监测至关重要。

引言
囊性包虫病（CE）是一种由广义棘球绦虫（Echinococcus granulosus sensu lato，简称s.l.）的幼虫阶段引起的动物源性疾病。伊斯坦布尔庞大的流浪狗数量对人类囊性包虫病的传播构成了重大风险。然而，关于犬类中广义棘球绦虫的流行率和基因型研究仍然有限。本研究旨在通过显微镜检查、粪便酶联免疫吸附测定（Copro-ELISA）和分子诊断方法，确定伊斯坦布尔安纳托利亚地区流浪狗体内广义棘球绦虫的存在及其基因型。

研究区域
本研究在伊斯坦布尔省（北纬40°58′53″，东经29°05′41″）进行，该地区位于亚洲和欧洲大陆的交界处，是土耳其人口最多的城市。据2018年估计，约有13万只流浪狗生活在该市。根据样本采集地点的不同，这些狗来自Umraniye（68只）、Beykoz（12只）、Cekmekoy（9只）、Sancaktepe（8只）、Sultanbeyli（6只）、Atasehir（4只）和Uskudar（3只）等7个地区（图1）。

样本收集
2022年4月至11月期间，从被带到市政收容所或私人兽医诊所接受常规抗寄生虫治疗和绝育程序的流浪狗中收集了110份粪便样本。由于现场条件和可及性限制，采用了基于便利性的机会性采样方法，导致不同研究区域的样本数量不平衡。所有纳入研究的狗年龄均超过一岁，以便更好地评估公共卫生风险和潜在感染情况。样本在首次排便后24小时内采集，收集在无菌、防漏容器中，并贴上唯一标识号，随后在冷链条件下送往实验室。样本最初在-80°C下保存至少7天以灭活潜在的感染性虫卵，之后在-20°C下保存直至进一步检测和分析。

显微镜检查
所有样本均使用改良的福尔马林-乙酸乙酯沉淀法（mFEAS）检测绦虫卵的存在，以提高诊断敏感性。该技术遵循标准寄生虫学协议进行（补充图1）。

Copro-ELISA
为了检测棘球绦虫特异性粪便抗原，使用了Canine Echinococcus Antigen ELISA试剂盒（Elabscience，中国）。具体操作是将约1克粪便样本稀释在试剂盒提供的1毫升样本溶液中，剧烈混合5分钟，然后以3000转/分钟的速度离心10分钟，收集上清液。每个样本及其阳性和阴性对照各加入100微升到ELISA孔中。在37°C下避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液清洗孔洞5次，每次间隔30秒。接着加入100微升HRP酶结合物，再次在37°C下避光孵育30分钟，重复洗涤步骤。最后加入100微升底物试剂，在37°C下孵育10分钟，然后用终止溶液完成反应。使用微孔光谱仪在450纳米处测量光密度（OD）值。根据制造商的标准，OD值超过阴性对照平均值+2.1×标准差（mean OD of negative controls + 2.1×SD）的样本被认为是棘球绦虫抗原阳性。

分子分析
使用Quick-DNA? Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit（Zymo Research，美国）根据制造商的方案从每个粪便样本中提取总基因组DNA。提取前，使用Qiagen TissueLyser LT以高频率进行ZR BashingBead Lysis系统处理10分钟，以破坏可能的虫卵外壳并释放DNA。提取的DNA在-20°C下保存，待PCR扩增使用。

PCR反应
PCR反应使用12.5微升Xpert Fast HotStart Master Mix（GRISP，葡萄牙）、2微升每种引物（10 pmol）、3.5微升无核酸酶水和5微升模板DNA进行。引物对为JB3（5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′）和JB4.5（5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′），它们可以扩增线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（CO1）基因约450 bp的片段[30]。PCR扩增在热循环仪中进行，具体程序如下：首先在95°C下变性5分钟，然后进行40个循环，每个循环包括95°C变性15秒、50°C退火15秒和72°C延伸5秒，最后在72°C下延伸5分钟。我们实验室中一个先前确认的E. granulosus s.s.（基因型1）DNA样本被用作阳性对照，而无核酸酶的水被用作阴性对照。为了可视化DNA，使用了Xpert Green DNA Stain direct（GRiSP，葡萄牙）作为溴化乙锭的安全、非突变替代品。PCR产物与染料以10:1的比例混合（10 μL样品对1 μL染料），然后直接加载到凝胶上，无需额外的加载缓冲液。PCR产物在1× TAE缓冲液中于1.5%琼脂糖凝胶上以120 V电压电泳1小时，并在紫外光下观察。显示约450 bp条带的扩增子被纯化后提交给商业公司（Medsantek，伊斯坦布尔，土耳其）进行双向Sanger测序。原始色谱图经过编辑和组装。使用BLASTn算法将一致序列与GenBank中的参考序列进行比较以确认物种身份。使用MEGA X软件中的Neighbor-Joining方法和Kimura 2参数模型构建了系统发育树，其中包括本研究中获得的E. granulosus s.l.基因型序列以及从GenBank数据库中检索的参考序列[31]。系统发育树的可靠性通过1000次自助法复制进行评估。作为外群使用了Taenia multiceps的序列（GenBank登录号：AB792725）。

伦理批准
本研究的伦理批准来自伊斯坦布尔-Cerrahpa?a地方动物实验伦理委员会（决定编号E-74555795-050.01.04-379648），该委员会指出，根据机构和国家规定，从狗身上收集粪便样本不需要正式的伦理批准，因为收集过程是非侵入性的，不会对动物造成痛苦。

统计分析
所有数据均使用Microsoft Excel输入和组织。计算了描述性统计量，分类变量以频率和百分比表示，连续变量以平均值±标准差表示。使用精确二项式（Clopper-Pearson）方法计算了流行率的95%置信区间（CIs）。使用卡方检验分析Echinococcus阳性与各组之间的关联，并应用Z检验比较亚组之间的感染百分比。使用Cohen’s kappa评估诊断方法（显微镜检查、Copro-ELISA和PCR）之间的一致性。p < 0.05的水平被认为是统计学上显著的。所有统计分析均使用IBM SPSS Statistics版本22进行。

结果
在采样的110只狗中，60只是雄性（54.5%），50只是雌性（45.5%）（表1）。估计的平均年龄为3.34 ± 2.51岁（范围1至≥5岁）。年龄分布如下：1岁，21只（19.1%）；2岁，40只（36.4%）；3岁，6只（5.5%）；4岁，9只（8.2%）；≥5岁，34只（30.9%）。Echinococcus阳性与性别或年龄组之间没有统计学上的显著关联（p > 0.05）。

表1 狗的性别和估计年龄分布

显微镜检查
在使用显微镜检查的110份粪便样本中，通过mFEAS方法在2份样本中检测到绦虫型卵（1.8%；95% CI：0.2%–6.4%）。由于绦虫型卵的形态相似性，仅凭显微镜无法进行物种级别的鉴定。绦虫型卵和伪影显示在补充图2中。显微镜阳性样本通过分子方法被确认为E. granulosus s.s.，显微镜和PCR的结果完全一致。

Copro-ELISA
Copro-ELISA在110份样本中的7份中检测到Echinococcus特异性抗原，对应于6.4%的流行率（95% CI：2.6–12.8%）。此外，雌性（4/50，8.0%）和雄性（3/60，5.0%）之间的Copro-ELISA阳性率没有统计学上的显著差异（双比例Z检验，Z = 0.64，p = 0.52）。值得注意的是，通过显微镜检测到绦虫型卵的两个样本在Copro-ELISA中呈阴性。

ELISA阳性样本的地理分布显示在表2中。根据ELISA结果，阳性样本出现在Umraniye（n = 3）、Sancaktepe（n = 1）、Sultanbeyli（n = 2）和Uskudar（n = 1）。ELISA阳性与地点之间没有显著关联（p > 0.05）。

表2 伊斯坦布尔安纳托利亚侧各区Copro-ELISA阳性样本的分布

分子分析
使用JB3/JB4.5引物对所有110份粪便样本进行了针对线粒体CO1基因约450 bp片段的PCR扩增。通过对显示约450 bp条带的扩增子进行Sanger测序（Medsantek，伊斯坦布尔，土耳其）后，未检测到其他绦虫DNA。序列分析显示，只有来自Sultanbeyli和Beykoz区的两个样本与GenBank中的E. granulosus s.s.（G1基因型）序列的相似度超过99%（例如MF544126，MN732801）。这些序列被存入GenBank，登录号为PX482526（Beykoz）和PX482527（Sultanbeyli）。获得的序列的系统发育分析显示，在E. granulosus s.l.复合体内存在遗传聚类，确认这两份来自本研究的狗分离株属于E. granulosus s.s.（G1–G3）（图2）。分子结果支持显微镜检测到的绦虫型卵，证实伊斯坦布尔安纳托利亚侧的110只狗中有2只（1.8%）感染了E. granulosus s.s.。

图2
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

系统发育树使用MEGA X软件和Neighbor-Joining方法构建。自助分析进行了1000次复制。红色圆圈表示在本研究中获得的序列。

诊断方法的比较
由于PCR和显微镜的结果100%一致，因此两种测试的结果都被接受为参考标准。根据这些测试结果评估了Copro-ELISA的诊断性能。因为两个通过显微镜和PCR确认为阳性的样本在Copro-ELISA中呈阴性，且七个ELISA阳性样本无法通过分子方法确认，所以Copro-ELISA的敏感性为0%，特异性为93.5%（95% CI：87.0–97.3%）。阳性预测值为0%，阴性预测值为98.1%（95% CI：93.2–99.8%）。因此，Cohen’s Kappa分析表明在本研究中Copro-ELISA和显微镜/PCR方法之间没有一致性（? < 0）。

讨论
E. granulosus s.l.是引起包虫病（CE）的最常见的人畜共患病之一，在全球和土耳其都是如此，狗作为最终宿主，通过排出寄生虫卵不断污染环境。流浪狗在维持传播循环中起着关键作用，导致牲畜和人类感染。因此，了解犬群中的流行率和基因型对于有效的CE监测和控制至关重要[7, 32]。尽管土耳其的多种研究使用不同的诊断工具调查了犬类包虫病，其流行率从0%到29.3%不等[14, 15, 28, 33, 34, 35, 36]，但伊斯坦布尔的数据非常有限。Oter等人仅通过粪便检查（成虫显微镜检查）报告了0.8%的流浪狗感染E. granulosus；然而，没有进行分子确认或基因分型[21]。因此，本研究提供了第一个分子证据，证实伊斯坦布尔安纳托利亚侧的流浪狗中存在E. granulosus s.s.（G1基因型）。

据报道，全球有超过一百万人感染了CE[37]，土耳其的几个农村地区仍然高度流行这种疾病。根据一项流行病学研究，人类CE的年发病率估计在每10万人中约有0.8到6.4例[32]。在2003年至2004年间进行的法医尸检研究中，伊斯坦布尔在1687例尸检中有56例宏观检测到细胞（3.3%），其中60.7%的病例通过血清学测试得到确认[38]。此外，在2018年至2023年间，伊斯坦布尔的一家三级医院中发现了30例CE患者[39]。这些报告表明CE在伊斯坦布尔仍然存在，并且持续的传播——很可能是来自受感染的狗——继续影响人类病例。

在本研究中，使用分子和显微镜方法在110只狗中有1.8%检测到E. granulosus s.s. DNA。这一低比率与其他大城市的发现一致，这些城市的狗接触受感染牲畜内脏的机会有限。类似的研究结果也来自伊朗北部的Mazandaran（1.09%）[40]；巴西的Acre（1.53%）[41]；爱沙尼亚的Tartu（2.2%）[42]；阿尔巴尼亚的Tirana（2.7%）[43]；伊朗东南部的Kerman（6.8%）[44]。我们研究中观察到的低流行率可能与城市化、流浪狗的管理以及市政收容所中的常规抗寄生虫治疗等因素有关。值得注意的是，阳性狗来自Sultanbeyli和Beykoz这些半农村地区，在这些地区，宗教献祭性屠宰很常见。在这些地区，流浪狗可能在屠宰后仍然能够接触到囊性器官。

本研究采用的多方法学方法突显了不同诊断工具之间的重要差异。虽然显微镜和分子方法仅在2份样本（1.8%）中检测到E. granulosus s.s.，但Copro-ELISA在7份样本（6.4%）中检测到Echinococcus特异性抗原，阳性率高于其他两种方法。然而，尽管ELISA产生的反应性样本数量更多，但有两个样本同时通过显微镜和分子方法确认为阴性。这表明这些额外的反应性结果可能是假阳性，质疑了ELISA相对于分子工具的所谓更高敏感性。

在哈萨克斯坦[45]、突尼斯[18]和罗马尼亚[46]也有类似的报道，其中ELISA检测到的流行率高于Copro-DNA检测。这种差异通常归因于抗原的持久性、早期感染或与其他绦虫如Taenia hydatigena和Dipylidium caninum的交叉反应[47]。然而，我们的样本中显微镜检查未发现其他绦虫卵，这降低了交叉反应的可能性。此外，两个确认为阳性的样本中Copro-ELISA呈阴性可能是因为抗原因冻融而降解或蠕虫负荷较低[48,49,50]。另一方面，未能通过分子方法确认ELISA阳性样本可能与PCR抑制有关[51]。粪便样本代表了一个高度复杂的基质，尽管本研究使用了专门的粪便DNA提取试剂盒（Quick-DNA? Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit，Zymo Research，美国）来减少抑制物的负面影响，但此类试剂盒很少能100%有效[52]。此外，由于本研究未使用内部PCR扩增对照来观察可能的抑制作用，这引发了关于PCR结果可能出现假阴性的担忧。为了解决这一限制，建议未来的粪便样本分子分析包括内部扩增对照，以监测潜在的非特异性抑制物。这些因素共同导致了这些检测结果之间的不一致性。诊断比较显示Copro-ELISA在这组样本中没有统计一致性，且敏感性较低。总之，这些发现强调了使用单一诊断方法的局限性，并强调了在流行病学调查中使用组合检测方法的必要性。

序列分析确认检测到的分离株属于E. granulosus s.s.（G1基因型）。该基因型已被报道为土耳其和全球人类和牲畜CE的主要原因[10, 12, 53]。在伊斯坦布尔的狗中检测到G1基因型表明，即使在大型城市环境中，羊-狗传播循环仍然活跃。值得注意的是，之前在伊斯坦布尔的人类手术样本中也发现了相同的基因型[22]。这表明该地区的人类感染来源于当地狗，突显了流浪狗的人畜共患风险。然而，目前还没有对伊斯坦布尔的牲畜进行广泛调查，需要进一步的研究来更好地了解该地区的传播情况。确定流行地区的主要基因型对于制定有效的控制计划至关重要[35, 54]。

结论
本研究首次在伊斯坦布尔的流浪狗中分子鉴定出E. granulosus s.s.，填补了该地区CE流行病学研究的空白。这种人畜共患病基因型的检测突显了城市和城郊地区持续的传播风险。考虑到评估的多方法学方法，分子和显微镜方法比ELISA获得了更可靠的结果。尽管如此，结合使用显微镜、Copro-ELISA和分子方法对于全面诊断仍然具有价值，应在未来的监测计划中应用。改进常规的抗寄生虫治疗、流浪狗管理以及牲畜内脏的处理方式，对于减少环境污染和支持基于“同一健康”（One Health）的控制策略至关重要。