通过可调式手性螺旋金纳米棒产生的圆二色性技术，实现对人类血清中miRNA-21的高灵敏度检测

《Journal of Colloid and Interface Science》：Highly sensitive detection of miRNA-21 in human serum via adjustable circular dichroism from chiral helical gold nanorods

　　

Cannan Zhao|Shuai Wen|Yusheng Feng|Yingying Xiong|Qiuyue Liu|Qiusha Li|Jinglei Xu|Wei Wang|Jian Wang

发光分析与分子传感关键实验室（西南大学），教育部，西南大学药学院，中国重庆400715

摘要

微小RNA（miRNAs）由于其疾病特异性的表达谱，成为早期癌症诊断的关键生物标志物。然而，由于它们的低丰度和复杂的基质干扰，传统的检测方法面临重大挑战。为了解决这些问题，开发了一种创新的手性生物传感平台，该平台将螺旋金纳米棒（HGNRs）与杂交链反应（HCR）扩增和磁珠（MBs）辅助分离技术相结合，实现了对miRNA-21的高度敏感和特异性检测。在这种方法中，目标miRNA-21在磁珠表面引发cDNA的位移，触发HCR生成具有多个链霉亲和素-碱性磷酸酶（SA-ALP）结合位点的DNA聚合物。随后，ALP将抗坏血酸2-磷酸（AAP）转化为抗坏血酸，导致HGNRs的结构变化，从而产生可检测的圆二色性（CD）信号减弱。这种集成方法表现出低至3.025 pmol/L的显著灵敏度和优异的选择性，并在稀释的人血清基质中得到了成功验证。这种手性CD转导策略通过结合手性纳米材料和增强信号转导与级联扩增，为miRNA分析开辟了新的范式，具有临床液体活检应用的巨大潜力。

引言

微小RNA（miRNAs）是一类非编码RNA，通常长度为19-25个核苷酸，它们通过序列特异性结合到目标mRNAs上来在转录和转录后水平调节基因表达，在调控细胞增殖、分化和凋亡等基本过程中起着关键作用[1],[2]。大量研究表明，异常的miRNA表达与多种恶性肿瘤的发病机制密切相关，导致凋亡抑制、增殖增强、侵袭性增加以及耐药性的发展[3]。值得注意的是，miRNA-21在多种癌症类型中表现出失调，并在肿瘤发生早期表现出癌症特异性表达模式，从而为癌症诊断、治疗和预后评估提供了理论基础[4],[5],[6]。miRNA研究的进展表明，miRNAs存在于血清、血浆和其他体液中，使得肿瘤和各种疾病的非侵入性诊断和预后评估成为可能[7]。这些miRNAs表现出不同癌症类型特有的表达谱，并能在血液中以高稳定性和特异性进行细胞外循环，使其成为早期癌症检测的有希望的生物标志物[8]。然而，miRNAs的低丰度、小分子大小和易受基质干扰的特性，迫切需要开发高度敏感的检测方法[9]。尽管目前使用的技术如Northern blotting[10]和DNA微阵列[11]可用于miRNA检测，但这些传统方法存在一些局限性，包括繁琐的程序、较长的检测时间、对低丰度目标的灵敏度不足以及由于非特异性干扰导致的假阳性结果。因此，它们往往无法满足早期癌症中微量生物标志物的高灵敏度和准确检测的临床要求。

为了解决这些挑战，多功能纳米材料和高度集成传感平台的持续发展大大扩展了临床诊断的能力，为微量生物标志物的高灵敏度和选择性检测提供了创新策略[12],[13]。此外，还开发了多种扩增策略，如链置换（SD）扩增[14]、杂交链反应（HCR）[15],[16],[17]、滚环扩增（RCA）[18]、催化发夹组装（CHA）[19]和核酸酶辅助信号扩增[17],[20]，用于miRNA的敏感检测。此外，一些研究人员将扩增技术与纳米材料相结合，显著提高了检测性能。例如，我们的团队基于金纳米棒（AuNRs）的暗场光散射成像[19],[21],[22]与信号扩增策略相结合，成功实现了临床血清样本的检测。

最近，我们的团队开发了一种基于手性螺旋金纳米棒（HGNRs）聚集和圆二色性（CD）减弱的miRNA-21敏感生物传感平台[20]。目前，手性纳米材料因其独特的性质和广泛的应用而受到广泛关注。利用它们的局域表面等离子体共振（LSPR）[23]和表面增强拉曼散射特性[24]，这些手性纳米材料在生物医学治疗[25],[26]、对映选择性传感[27]和催化[29]方面显示出巨大潜力。此外，手性纳米结构的结构-信号相关性研究进一步促进了新型基于CD的生物传感器的开发。然而，当前手性纳米颗粒的应用主要集中在LSPR增强的结构优势上，而不是CD信号，而CD信号是一种稳定且响应性强的输出模式。鉴于这些考虑，基于CD的传感平台在构建简单而高度敏感的miRNA检测平台方面具有未开发的潜力[20]。更重要的是，银纳米颗粒（AgNPs）的表面涂层会影响HGNRs的形态，从而调整其CD响应模式，这可以发展成为一种方便且高度敏感的碱性磷酸酶（ALP）传感方法[30]。

在本研究中，通过将金HGNRs[31]作为手性探针与HCR扩增和基于磁珠（MBs）的分离[14],[32]相结合，开发了一种高度敏感和选择性的手性生物传感平台，以提高灵敏度和选择性。如图1所示，检测机制涉及目标miRNA-21触发固定在磁珠上的互补DNA（cDNA）的开放，从而暴露HCR的起始序列。这种启动使得H1和H2发夹探针依次杂交，促进HCR的逐步组装。生成的延长HCR产物提供了大量的链霉亲和素结合碱性磷酸酶（SA-ALP）结合位点，显著增强了抗坏血酸磷酸（AAP）向抗坏血酸（AA）的酶促转化。生成的AA减少了HGNRs表面的Ag⁺，随后介导了明显的形态变化，导致CD信号显著减弱，从而实现了高灵敏度的检测。此外，基于磁珠的分离在复杂的生物基质中表现出出色的性能，这归因于其在目标富集和干扰去除方面的双重功能。

章节片段

材料

所有寡核苷酸（表S1）由Sangon Biotech（上海）有限公司合成。链霉亲和素包覆的磁珠（1 μm）由Smart-Lifesciences Biotech有限公司提供。SA-ALP结合物从Proteintech有限公司商业购买。三氯化金（HAuCl?·4H?O）由上海Macklin生化有限公司提供。ALP缓冲液、磷酸盐缓冲盐水（PBS）和AAP从Macklin购买。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和AA从Sangon获得

结果与讨论

使用低长宽比的AuNRs作为种子进行二次生长，以合成具有高CD响应效率的HGNRs[30]。最初，成功合成了在660 nm处具有纵向LSPR吸收峰的AuNRs（图1A），并且没有表现出内在的手性（图1B）。SEM图像（图1C）确认了它们的均匀形态和良好的分散排列。二次生长后，所得HGNRs的吸收光谱与原始样品相比显示出明显的蓝移

结论

总之，通过使用HGNRs作为手性信号探针，结合HCR进行信号扩增和MBs进行高效分离，开发了一种高度敏感且抗干扰的手性检测方法。这种协同方法有效减少了来自复杂生物基质的干扰。HCR链的生长使得SA-ALP结合物能够大量结合到磁珠上，显著提高了ALP对AAP的催化效率。

CRediT作者贡献声明

Cannan Zhao：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。Shuai Wen：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。Yusheng Feng：研究、形式分析、概念化。Yingying Xiong：方法学、概念化。Qiuyue Liu：方法学、概念化。Qiusha Li：方法学、概念化。Jinglei Xu：方法学、概念化。Wei Wang：撰写——审稿与编辑、监督、方法学。Jian Wang：撰写——

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

国家自然科学基金（编号22174115）、重庆市自然科学基金（CSTB2024NSCQ-MSX0430）以及重庆市公共卫生重点专项（学科）项目（2025ZDSYS008）的财政支持。