《Microchemical Journal》：Fe-BSA-assisted signal amplification coupled with synergistic NiCo LDH@rGO/CMC hybrid interface for electrochemical immunosensing of calprotectin
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海达尔·哈米德·萨尔曼·阿尔克瓦齐（Heydar Hameed Salman Arkwazee）| 戈拉姆雷扎·德赫甘（Gholamreza Dehghan）| 穆罕默德·卡拉杰-孔多里（Mohammad Khalaj-Kondori）伊朗大不里士大学自然科学学院生物系生物化学与
海达尔·哈米德·萨尔曼·阿尔克瓦齐（Heydar Hameed Salman Arkwazee）| 戈拉姆雷扎·德赫甘（Gholamreza Dehghan）| 穆罕默德·卡拉杰-孔多里（Mohammad Khalaj-Kondori）
伊朗大不里士大学自然科学学院生物系生物化学与分子生物学实验室，大不里士 51666?16471
摘要
钙保护蛋白（CALP）是一种关键的诊断生物标志物，其灵敏的检测在炎症性肠病（IBD）的筛查、早期诊断、治疗反应监测以及疾病管理中起着至关重要的作用。尽管已有许多研究关注粪便中CALP的检测，但用于血清分析的高效生物传感器仍然较少，且通常具有有限的动态范围。因此，本研究基于多种放大策略构建了一种新型夹心型电化学免疫传感器，以实现CALP的超灵敏检测。该免疫传感器利用了NiCo层状双氢氧化物（NiCo LDH）、还原氧化石墨烯（rGO）和羧甲基壳聚糖（CMC）的协同效应，这些成分以纳米复合材料（LDH@rGO-CMC）的形式存在，既能捕获一级抗体（Ab1），又能提供优异的导电性。该纳米复合材料通过简单的水热法合成，并通过常见技术进行了表征，随后成功用于改性丝网印刷碳电极（SPCEs）。此外，还合成了BSA-Fe复合物作为高性能的类酶标签，用于捕获二级抗体（Ab2）并作为产信号催化剂。在LDH@rGO-CMC和BSA-Fe复合物的协同作用下，所制备的免疫传感器表现出广泛的线性检测范围（0.05–170 μg/mL）和低检测限（0.27 ng/mL），能够以优异的选择性、可接受的稳定性和高重复性覆盖生理和病理相关的血清CALP水平。此外，电化学分析的准确性已在人血清样本中得到验证，回收率令人满意，相对标准偏差（RSD）低于4%。因此，这些结果增加了这种生物传感器在临床监测不同生物标志物中的应用前景。
引言
炎症性肠病（IBD）是一组特发性、慢性且反复发作的胃肠道疾病，严重影响患者的生活质量并增加结直肠癌的风险[1],[2]。这种慢性炎症性疾病主要包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），其特征包括腹痛、贫血、黏液便、肠梗阻和出血[3],[4]。然而，在缺乏明显症状的情况下，区分这些疾病和肠易激综合症较为复杂[5]。内镜检查和组织活检被认为是诊断IBD和管理肠道炎症的金标准[6],[7]。尽管这些标准化技术具有灵敏性和可靠性，但存在严重局限性，如耗时较长、成本高昂、采样偏差以及需要技术娴熟的操作人员。此外，由于这些程序具有侵入性，且需要术前进行肠道准备和镇静，患者接受度较低。考虑到IBD患者需要终生进行多次内镜检查，因此需要能够反映肠道炎症的替代诊断技术[8],[9]。
多种生物标志物可用作筛查指标，为IBD的诊断、及时治疗干预和治疗效果评估提供所需的灵敏度和选择性[8]。其中，钙保护蛋白（CALP）作为一种非侵入性筛查工具，在IBD[10],[11]和结直肠癌进展[11],[13],[14]的监测中引起了特别关注。CALP属于钙结合S100家族（S100A8和S100A9），在中性粒细胞中因感染和炎症反应而大量表达[15],[16]。体液中这种异二聚体蛋白的浓度与炎症程度成正比[17]，可占细胞质总蛋白含量的50%[18]。然而，不同的肠道病理状态会导致黏膜通透性增加，进而促使中性粒细胞迁移到胃肠道组织[19]。肠道腔内的细菌刺激这些细胞释放CALP[11]。尽管粪便中的CALP常用于IBD的评估[7]，但不同检测平台的结果存在差异[20]。最新研究表明，血清中的CALP水平也可作为IBD诊断的潜在指标[20],[21],[22]。目前，CALP的常规检测方法依赖于酶联免疫吸附测定（ELISA），这种方法成本较高且需要样品预处理[11]。在生物传感技术领域，电化学免疫传感器在灵敏度、可靠性和操作速度方面具有显著优势。这些传感平台利用了抗体-抗原系统的选择性，结合了各种纳米材料的信号放大特性[23],[24]。
在用于开发电化学免疫传感器的各种纳米材料中，层状双氢氧化物（LDHs）受到了越来越多的关注。它们具有较大的表面积、可调的金属组成、生物相容性和显著的离子交换能力，有助于高效的电子转移并促进生物分子的稳定固定。为了进一步提高电化学性能，LDHs可以与导电纳米材料（如还原氧化石墨烯（rGO）结合，形成互连的导电网络并增加活性表面积[25]。此外，加入羧甲基壳聚糖（CMC）等生物相容性聚合物可为生物分子提供丰富的官能团，以实现共价偶联，同时改善LDH纳米片在电极表面的分散性[26],[27]。NiCo-LDH、rGO和CMC的协同组合可有效制备出导电性优异、抗体负载能力高且电化学性能出色的纳米复合材料。
受这些特性的启发，本研究旨在基于LDH@rGO-CMC纳米复合材料开发一种高灵敏度和稳定的电化学免疫传感器，用于CALP的定量检测。考虑到适当标记探针对夹心型免疫传感器灵敏度和可靠性的重要性，本研究引入了一种新的催化标签，使用牛血清白蛋白（BSA）和Fe3+（BSA）。在该复合物中，BSA提供生物相容性的高分子支架，而Fe3+作为活性催化位点，模拟天然过氧化物酶的氧化还原行为。因此，即使结构或环境发生变化，BSA-Fe仍能保持其催化活性，确保比天然酶更出色的稳定性和耐用性。将这种标记策略与导电且生物相容的LDH@rGO-CMC纳米复合材料结合，可提供一个兼具高效催化、稳定固定和灵敏检测的协同平台。所设计的免疫传感器展示了临床相关的检测范围，能够可靠地量化与多种炎症性疾病相关的CALP浓度。与广泛研究的粪便CALP检测方法不同，本研究解决了临床诊断应用中对血清兼容生物传感策略的需求。
章节片段
材料
硝酸钴（Co(NO3)2·6H2O）、硝酸镍（Ni(NO3)2·6H2O）、氢氧化钠（NaOH；98%）、羧甲基壳聚糖（CMC）、石墨粉、盐酸（HCl；37%）、磷酸二钠（Na2HPO4.7H2O；98%）、磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O；98%）、氯化钠（NaCl；98%）和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）均购自德国达姆施塔特的Merck公司。牛血清白蛋白（BSA；96%）、人血清白蛋白（HSA；96%）、过氧化氢（H2O2；30%）
制备的纳米材料的形态通过FE-SEM进行了表征。如图1a所示，合成的NiCo LDH由纳米层组成，这些纳米层随机混合排列[54],[55]。与纯LDH相比，生长在rGO-CMC基质上的纳米层分布更均匀，具有层次结构（图1b）。此外，锚定在rGO-CMC复合体上的纳米片尺寸显著增大，排列也变得不那么紧密
结论
有效监测和监测特定的癌症相关生物标志物对于疾病的早期发现和诊断、及时干预以及预防后续死亡至关重要。尽管在粪便CALP检测领域已付出大量努力，但能够定量血清CALP的传感平台的开发仍有限。本研究制备了一种灵敏的免疫传感器，用于检测IBD的重要诊断生物标志物CALP。
海达尔·哈米德·萨尔曼·阿尔克瓦齐（Heydar Hameed Salman Arkwazee）：负责撰写初稿、方法学设计和实验研究。戈拉姆雷扎·德赫甘（Gholamreza Dehghan）：负责审稿与编辑、项目管理和概念构思。穆罕默德·卡拉杰-孔多里（Mohammad Khalaj-Kondori）：负责审稿与编辑、验证、方法学设计和实验研究。
已获得所有参与者的书面同意，大不里士大学伦理委员会（IR.TABRIZU.REC.1404.200）批准了本研究。
资金支持
本研究未获得任何公共部门、商业机构或非营利组织的资助。
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
