利用微流控技术实现肿瘤靶向纳米胶囊的一步界面自组装，以协同开展化学疗法和光动力疗法

《Nano Today》：One-step interfacial self-assembly of tumor-targeting nanocapsules by microfluidics for synergistic chemo- and photodynamic-therapies

　　

杨泽|刘子伟|罗长江|谢玉婷|马涛|梁婷波|陈东

浙江大学医学院第一附属医院肝胆胰外科，中国杭州310003

摘要

协同化疗和光动力疗法对肿瘤治疗非常有效。然而，由于有毒有机溶剂、复杂的制备过程以及光敏剂稳定性差，制备用于协同治疗的纳米载体颇具挑战性。本文提出了一种绿色且多用途的策略，通过在微流控设备中一步界面自组装来制备靶向肿瘤的纳米胶囊。在界面处，聚-L-赖氨酸（PLL-FA）与伊红绿（ICG）通过静电复合物形成后，ICG的光稳定性显著提高，并且能够通过光热效应控制药物释放。当装载RSL3后，RSL3@ICG+PLL-FA纳米胶囊在细胞摄取、活性氧（ROS）生成和肿瘤靶向方面表现出优异的性能。静脉注射后，RSL3@ICG+PLL-FA纳米胶囊通过协同化疗和光动力疗法有效抑制肿瘤生长，其中RSL3介导的GPX4抑制以及ICG在近红外（NIR）照射下产生的ROS能够有效杀死肿瘤细胞。流式细胞术分析表明，这些纳米胶囊能够重塑肿瘤微环境（TME）并激活抗肿瘤免疫反应，显示出在协同化疗和光动力疗法中的巨大潜力。

引言

尽管肿瘤学领域取得了显著进展，但有效的肿瘤治疗仍然是一个主要的临床挑战[1]、[2]。虽然传统的化疗和放疗方法被广泛使用，但依赖于光敏剂在光照下生成ROS的光动力疗法已成为一种有吸引力的替代方案[3]、[4]。然而，光动力疗法的应用常常受到激发光组织穿透性差的限制[5]、[6]、[7]。为了解决这个问题，近红外（NIR）染料因其激发波长位于NIR范围内而显得最有前景[8]。然而，由于化学物质的毒性和生物安全性问题，目前唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NIR染料是伊红绿（ICG）[9]、[10]。

为了将ICG用于光动力疗法，人们利用了纳米技术，并开发了许多递送载体以实现ICG的靶向递送，包括基于聚合物的纳米颗粒[11]、[12]、基于脂质的纳米颗粒[13]、[14]、白蛋白纳米颗粒和二氧化硅纳米颗粒[15]、[16]。这些纳米载体可以通过被动或主动靶向提高ICG向肿瘤部位的递送效率[17]、[18]，并且ICG在NIR照射下生成的ROS能够有效杀死肿瘤细胞[20]。尽管付出了努力，但ICG的光稳定性仍然是一个挑战[21]、[22]，因为ICG分子在NIR照射下容易聚集和降解。染料性质的快速丧失会降低ROS的持续产生，从而影响整体治疗效果[10]、[23]、[24]。为了提高抗肿瘤效果，人们采用了不同的策略来稳定ICG以用于光动力疗法。例如，ICG稳定的纳米乳液显示出改善的ICG光稳定性[25]、[26]。然而，纳米乳液的制备通常需要高能超声处理或高压均质化，这使得难以实现一致的生产，并可能导致ICG在制备过程中的降解[27]、[28]。多步骤策略（如逐层组装）通常涉及复杂的制备过程和多个纯化步骤，严重限制了其制备效率[29]。为了解决这些限制，一步微流控策略似乎是一种有前景的方法，可以同时提高ICG的稳定性和实现靶向性，因为微流控技术提供了更好的控制，避免了苛刻的条件并降低了制备复杂性。

此外，将光动力疗法与化疗结合以获得协同效应有望优化抗肿瘤效果。例如，RSL3可以抑制GPX4，防止肿瘤细胞清除脂质ROS，而ICG的光动力效应产生的ROS会消耗细胞内的谷胱甘肽（GSH），从而破坏肿瘤细胞的抗氧化防御系统，进一步放大RSL3诱导的铁死亡效应[30]。然而，RSL3的临床应用受到其在水中溶解度低的限制[31]。开发纳米载体系统对于提供ICG和RSL3的协同递送平台具有重要意义，以实现协同化疗和光动力疗法。

为了有效应对这一挑战并提供稳定的疏水核心用于封装，本文开发了一种多用途的一步策略，通过溶剂交换驱动的界面复合物来制备靶向肿瘤的核壳纳米胶囊。在微流控通道中快速交换溶剂后，带负电的ICG与带正电的PLL-FA在油/水界面形成复合物，形成核壳结构。ICG+PLL-FA纳米胶囊在水中表现出良好的稳定性，并且在NIR照射下具有可控的光热效应。当装载RSL3后，RSL3@ICG+PLL-FA纳米胶囊在细胞摄取、ROS生成和肿瘤靶向方面表现出优异的性能。静脉注射后，RSL3@ICG+PLL-FA纳米胶囊通过协同化疗和光动力疗法有效抑制肿瘤生长，其中RSL3介导的GPX4抑制以及ICG在NIR照射下产生的ROS能够有效杀死肿瘤细胞。通过肿瘤靶向功能、可控的药物释放和NIR照射下的局部ROS生成，实现了较低的副作用。流式细胞术分析表明，RSL3装载的纳米胶囊能够重塑肿瘤微环境（TME）并激活抗肿瘤免疫反应，显示出在协同化疗和光动力疗法中的巨大潜力。

章节片段

材料

使用伊红绿（ICG，分子量=829.14?g/mol；上海Macklin生化技术有限公司）和聚-L-赖氨酸（PLL，分子量=146.19?g/mol；上海Rhawn化学有限公司）作为壳材料。碘化油（lipiodol；Guerbet公司）作为核心材料。（1S,3?R）-RSL3（RSL3；上海Aladdin生化技术有限公司）被装载到核壳纳米胶囊中。尼罗红（NR；上海Aladdin生化技术有限公司）用作荧光探针。叶酸（FA，分子量=441.40?g/mol；上海

结果与讨论

为了制备载药靶向肿瘤的纳米胶囊，将（1S,3?R）-RSL3（RSL3）、碘化油（lipiodol）和伊红绿（ICG）共溶于乙醇中，将叶酸功能化的聚-L-赖氨酸（PLL-FA）溶于水中。在微流控设备中快速交换乙醇和水后，它们自组装成RSL3@ICG+PLL-FA纳米胶囊，如图1(a)所示。带负电的ICG由于其可离子化的磺酸基团而具有两亲性，如图S1所示，

结论

本研究开发了一种一步策略，通过在油/水界面处将带负电的ICG与带正电的PLL-FA进行静电复合物来制备靶向肿瘤的纳米胶囊。设计的RSL3装载的ICG+PLL-FA纳米胶囊表现出多种优势，包括良好的生物相容性、肿瘤靶向功能、改善的ICG稳定性、NIR触发药物释放以及协同化疗和光动力疗法。因此，RSL3@ICG+PLL-FA纳米胶囊具有NIR

CRediT作者贡献声明

杨泽：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学、概念化。刘子伟：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、正式分析、数据管理、概念化。罗长江：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、正式分析、数据管理、概念化。谢玉婷：可视化、验证、方法学、正式分析、概念化。马涛：撰写

资助

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：22278352）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：22278352）的支持。