利用酶促水解和超滤技术在膜生物反应器中制备具有高抗氧化活性的酪乳组分

《International Journal of Dairy Technology》：Production of a buttermilk fraction with high antioxidant activity using enzymatic hydrolysis and ultrafiltration in a membrane bioreactor

　　**摘要**

**背景、情境或理由**
酪乳是黄油生产过程中的副产品，其中含有被“加密”的生物活性肽，这些肽在释放后可能表现出抗氧化活性。通过酶水解结合膜分离技术，可以提供一种可持续的方法来增强乳制品副产品的功能特性，并促进其价值利用。

**目的**
本研究旨在利用膜生物反应器中的顺序酶水解与超滤结合技术，从酪乳中提取具有较高抗氧化活性的低分子量肽。

**方法**
酪乳分别使用Alcalase?、Prolyve?和Neutrase?进行酶水解。水解产物在膜生物反应器中处理，该反应器配备有孔径为30–80 kDa的管状超滤膜，操作条件为100 kPa和40°C。研究了水解程度、蛋白质分布、肽的大小及抗氧化活性。肽的大小通过电泳和理论计算进行测定，抗氧化活性则通过ABTS试剂盒进行评估。数据分析采用ANOVA和Tukey检验（P < 0.05）。

**主要发现**
顺序使用Alcalase?和Neutrase?进行水解可达到最高的水解程度（34%），从而产生平均长度约为三个氨基酸、摩尔质量为0.33 kDa的短肽。超滤将这些低分子量肽分离到渗透液中，其抗氧化活性最高（971 μmol Trolox当量/克蛋白质）。电泳确认渗透液中不存在大于5 kDa的蛋白质，且渗透液和截留液的生物活性均高于未经处理的酪乳。

**科学或工业意义**
这种酶与膜结合的处理方法能够从酪乳中回收生物活性肽，从而提升这种未充分利用的副产品的价值。研究结果为生产具有抗氧化特性的功能性食品成分提供了一种可行的策略，有助于推动乳制品行业的可持续发展。

**引言**
酪乳是黄油生产过程中的副产品，由乳清搅拌产生，含有蛋白质、脂肪、寡糖、磷脂、糖脂及其他具有生物活性的成分（Ali 2019；Pereira等2024）。全球年产量约为6.5106亿吨（Sakkas等2022）。一些乳制品公司利用酪乳生产酪乳粉。此外，酪乳还可用于精油微胶囊化基质、烘焙原料（Hameed等2023）、果汁和饮料（Jakhar和Jain 2019）以及冰淇淋（Szkolnicka等2020）。全球酪乳市场呈稳定增长趋势，预计未来几年复合年增长率约为4.5%至5.1%。这一增长得益于酪乳在烘焙、糖果和乳饮料行业的广泛应用（Blake 2023）。虽然商业领域主要利用酪乳的乳化特性，但工业界正逐渐关注其高质量蛋白质的价值开发。酪乳中的蛋白质含有具有生物活性的肽，这些肽在消化过程中可发挥抗炎（S. Li等2019）、降压（Arroume等2016；Magouz等2023）、免疫调节（Mohamed和Schaalan 2018）和抗氧化（Ayyash等2018）作用。然而，部分天然蛋白质可能引起过敏反应，因为消化系统中的酶无法有效分解这些蛋白质。因此，对酪乳进行预处理（如酶水解）可降低其致敏性。酪乳中的蛋白质经酶水解后可生成生物肽（Astaire等2003），低分子量肽的致敏性较低（Golkar等2019；Xu等2011）。此外，酶水解还能通过减小肽链长度来增强其生物活性（Li等2023）。研究表明，肽链长度在500 Da至3000 Da（或3–20个氨基酸残基）范围内时抗氧化活性最强（AA；Cheung等2012）。因此，需要选择合适的水解酶以实现更高的水解程度。不过，小分子肽可能带有苦味（Zhou等2013），从而影响其消费。除了水解外，还可以通过分离技术进一步提高生物活性，但这一过程可能成本较高（如色谱法Marson等2020）。膜分离技术适用于分离水解后的肽（Faucher等2022），已用于肉类废弃物（Sbeghen等2022）、牛奶（Nath等2021）、啤酒酵母残渣（Marson等2020）、微藻生物质（Sossella等2020）、豆奶（Nath等2019）和乳清蛋白（O'Loughlin等2013；Yu等2021）的纯化。水解与分离可在膜生物反应器（MBR）中同时进行，实现一体化操作。MBR能控制产品的分子量，因为选择了合适的膜孔径（Cheison等2006；Prieto等2007）。合适的分子量截留值应既能保留天然蛋白质又能让水解肽通过。虽然已有关于酪乳价值利用的研究，但大多未聚焦于蛋白质的回收（García-Cano等2021）。一些研究探讨了超临界流体对酪乳中乳球蛋白抗原性的降低效果（Rombaut等2007；Ries等2010；Contarini和Povolo 2013；Bourlieu和Michalski 2015；Spitsberg等2019；Anto等2020；Fontecha等2020）。Barry等（2017）研究了通过酶水解和膜分离制备磷脂的方法，Krebs等（2024）将浓缩酪乳与脱脂牛奶混合以评估其凝乳特性，Asif等（2023）用酪乳制作切达奶酪。然而，很少有研究专注于酪乳中蛋白质的回收与利用。Conway等（2013）使用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解酪乳蛋白以生成生物肽，Magouz等（2023）通过发酵酪乳释放乳球蛋白来提高生物肽产量。本研究则旨在通过膜生物反应器和超滤技术，从酪乳中回收具有抗氧化活性的低分子量肽。

**材料与方法**
实验分为三个阶段：首先对酪乳进行采样和理化性质分析，为后续过程建立基准；接着使用不同酶进行批次蛋白水解实验以确定最佳催化剂；最后在膜生物反应器中应用选定酶进行蛋白水解和生物活性肽的分离。

**设备与试剂**
实验使用以下设备：Delta Instruments（美国谢尔顿）的傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR Lactoscope）、Femto 700Plus分光光度计（巴西圣保罗）、Bio-Rad（美国赫拉克勒斯）的Mini-Protean II细胞仪（配备6 cm × 8 cm、厚度1.0 mm的玻璃板）、WGM Sistemas（巴西圣保罗）的超滤膜及配套设备、Fisatom（巴西圣保罗）的搅拌加热板（型号501）、Digimed（巴西圣保罗）的pH计（DM 23）。超滤膜由Koch Membrane Systems制造，材质为聚丙烯腈，管状结构，有效面积为0.1 m2，孔径范围为30–80 kDa。所有试剂均为分析级：NaOH、K2S2O8、乳酸、乙醇（Synth，巴西迪亚德玛）、Trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸）和ABTS（2,2'-偶氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，Sigma Aldrich，巴西圣保罗）。电泳试剂由Bio-Rad（巴西圣保罗）提供。测试三种酶用于酪乳蛋白水解：Alcalase?（EC3.4.21.62）和Neutrase?（EC3.4.22，来自Novozymes，丹麦Bagsv?rd，由LNF Latin America捐赠，巴西本托·贡萨尔维斯）；另一种酶Prolyve（EC3.4.21.62，来自Soufflet Biotechnologies SAS，法国科伦贝勒斯，由WGM Systems捐赠，巴西圣保罗）。所用酶均经过标准化处理（依据Anson 1938方法，使用1%（w/v）牛血清白蛋白作为底物）。酶按1:10（v/v）比例稀释后加入反应管。在最佳温度（55°C、55°C和45°C）下反应10分钟后，用三氯乙酸沉淀未水解蛋白质，并在280 nm处测定芳香氨基酸（酪氨酸和色氨酸）的释放量。结果表明Alcalase的酶活性是Neutrase的2.27倍，据此校准后续实验的酶浓度。

**酪乳采样与性质分析**
酪乳由Randon公司（巴西瓦卡里亚）提供，采集后置于5°C冷藏容器中运输。按照国际乳品联合会（IDF）的141C协议，使用FT-IR Lactoscope进行理化性质分析。酪乳中的蛋白质、脂肪和乳糖浓度分别为2.07 ± 0.02%、2.35 ± 0.03%、1.75 ± 0.02%，pH值为6.35 ± 0.10。

**酶水解实验**
选择最佳酶进行酪乳蛋白水解的实验在带搅拌加热板的反应器（2 L容量）中进行。向反应器中加入1 L酪乳，并根据供应商说明添加不同浓度的酶。通过添加NaOH或乳酸调节pH值。表1列出了各酶的水解条件。

**MBR操作**
MBR分批次运行：首先生成水解产物，随后将水解液送入超滤系统（图1所示）。使用孔径为5 kDa的超滤膜分离高分子量蛋白质（截留液）和低分子量肽（渗透液）。然而，发生了严重的污染现象，导致渗透无法进行。之后，我们测试了管状超滤（UF）膜，发现该膜能够实现肽的渗透和分离。因此，我们继续使用这种膜进行研究。图1（在图查看器中打开）展示了从酪乳中生产肽的膜生物反应器（MBR）的示意图。每次实验前，都先使用（pH值为11的）NaOH溶液进行化学清洗，然后用Mili-Q?水冲洗至中性pH值。将10升水解后的酪乳加入容积为20升的不锈钢罐中，并保持温度在40°C，以增加渗透通量，因为温度对渗透有积极影响。一个气动泵将原料推向膜，通过阀门将压力设定为100千帕（1巴），并用压力计进行监测。渗透液（含有小分子肽）被收集起来，而保留液（含有天然蛋白质和大分子肽）则被返回到原料罐中。肽的分离时间大约在2到4小时之间，整个过程（包括反应和分离）需要6到8小时。膜截留率（MR）通过公式4计算得出，其中Cp表示渗透液中的浓度，Cr表示保留液中的浓度。

**肽的特性分析**
肽的特性通过预测链的平均长度（ALC）、平均摩尔质量（AVW）以及电泳实验来评估。此外，还评估了酪乳中氨基酸（AA）的生物活性。ALC的预测基于Perea等人（1993年）提出的概念，即假设氨基酸的摩尔质量为120道尔顿（Da），并使用公式5和6进行计算。

电泳实验采用Tris-Tricine-SDS-PAGE系统进行，具体方法参考Jiang等人的研究（2016年）。酪乳及其水解产物的AA通过Re等人（1999年）提出的ABTS-2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid）方法进行测定。我们也尝试了FRAP（血浆中铁还原能力）方法，但该方法的结果不稳定，因此最终选择了ABTS方法。反应物为100毫升ABTS（7毫摩尔）与100毫升2.45毫摩尔的过硫酸钾混合以生成ABTS•+自由基。该溶液在使用前需避光保存16小时。在氢供体（如肽）的存在下，这种自由基会被还原，从而降低溶液的吸光度。AA的浓度以Trolox当量抗氧化能力表示。我们使用浓度范围在100至900微摩尔之间的Trolox制备了标准曲线。将10微升Trolox与1毫升ABTS•+混合并反应6分钟后，测量其在734纳米处的吸光度。样品的AA浓度则是通过将20微升样品与980微升ABTS•+混合并反应6分钟后，在734纳米处测量吸光度得出的。AA的值以每克蛋白质的Trolox当量表示。

**统计分析**
所有实验数据（水解程度、抗氧化活性和工艺参数）均采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计处理，随后进行Tukey事后检验（P<0.05）。对于每组比较数据，均验证了参数模型的假设：通过Levene检验确认了数据的方差齐性，通过正态概率图验证了残差的正态性。所有实验均重复三次，以确保结果的稳健性和显著差异的有效性。

**结果**
图2显示了每种酶在不同时间点下的水解程度（HD）变化情况。为了提高HD，依次使用了Alcalase和Neutrase酶（图2中也有所展示）。当水解不再进行时，我们在不同时间点停止了反应。使用Alcalase?、Prolyve?和Neutrase酶时，分别获得的水解程度分别为26.41%、25.40%和5.80%。Alcalase和Prolyve酶的最终水解程度相似（分别为26.4%和25.2%），因为这两种酶都是内切蛋白酶。Alcalase是一种来自Bacillus licheniformis的丝氨酸蛋白酶，其活性位点具有天冬酰胺、组氨酸和丝氨酸三种催化基团。底物通过氨基酸侧链插入酶活性位点的裂解位点与酶结合（Beynon和Bond 1989；Whitaker 2018）。两种具有不同作用机制的酶（Alcalase + Neutrase）联合使用，比单独使用任何一种酶都能获得更高的水解程度（34.84%）。因此，我们决定按照这种酶的顺序来操作MBR。在这些条件下进行了新的实验。图3展示了MBR运行时的渗透通量情况。作为对比，MBR也仅使用酪乳进行了运行。

图3显示了使用不同条件下的MBR渗透通量：(a) 未经水解的酪乳；(b) 先用Alcalase酶再用Neutrase酶依次水解的酪乳。压力为100千帕，温度为40°C。未经水解的酪乳的初始渗透通量较高（184升/小时·平方米），但在运行120分钟后显著下降至13.6升/小时·平方米。而使用酪乳的MBR的初始渗透通量较低（126升/小时·平方米），但同样在运行120分钟后也有所下降，最终渗透通量为20.8升/小时·平方米。MBR对蛋白质的截留率也有所不同：未经水解的酪乳的蛋白质截留率为55.9%，而经过水解的酪乳的蛋白质截留率较低（38.66%）。这一现象表明水解减小了酪乳蛋白质的分子大小，使得更多的蛋白质能够通过膜孔。表2显示了MBR在酶水解前后渗透液和保留液中蛋白质、乳糖和脂肪的浓度。

**讨论**
图2中的数据表明，为了提高水解程度（HD），依次使用了Alcalase和Neutrase酶。当水解不再进行时，我们在不同时间点停止了反应。Alcalase?、Prolyve?和Neutrase酶分别使酪乳蛋白质的水解程度达到26.41%、25.40%和5.80%。Alcalase和Prolyve酶的最终水解程度相似（分别为26.4%和25.2%），因为它们都是内切蛋白酶。Alcalase是一种来自Bacillus licheniformis的丝氨酸蛋白酶，其活性位点含有天冬酰胺、组氨酸和丝氨酸三种催化基团。底物通过与酶活性位点腔内的氨基酸侧链结合而被切割（Beynon和Bond 1989；Whitaker 2018）。两种酶的联合使用提高了水解程度（34.84%）。因此，我们决定按照这种酶的顺序来操作MBR。新的实验结果也证实了这一点。

表3显示了MBR运行时的渗透通量情况。与仅使用酪乳的情况相比，使用Alcalase和Neutrase酶依次水解酪乳后，渗透通量有所提高。未经水解的酪乳的初始渗透通量较高（184升/小时·平方米），但在运行120分钟后显著下降至13.6升/小时·平方米；而使用酪乳的MBR的初始渗透通量较低（126升/小时·平方米），但在运行120分钟后也有所下降，最终渗透通量为20.8升/小时·平方米。MBR对蛋白质的截留率也有所不同：未经水解的酪乳的蛋白质截留率为55.9%，而经过水解的酪乳的蛋白质截留率较低（38.66%）。这表明水解减小了酪乳蛋白质的分子大小，使得更多的蛋白质能够通过膜孔。表2还显示了酶水解前后MBR得到的渗透液和保留液中蛋白质、乳糖和脂肪的浓度。

表3进一步展示了水解对酪乳抗氧化活性的影响。水解后的酪乳具有更高的抗氧化活性。通过电泳实验（图4）分析了酪乳及其水解产物的平均链长和平均摩尔质量。随着水解程度的增加，肽的平均链长和平均摩尔质量逐渐减小。Alcalase + Neutrase酶组合使用后，肽的平均链长为2.939微摩尔。这一过程提高了乳制品工业副产品中蛋白质的生物活性。Mendis等人（2005年）和Ferreira等人（2007年）报告称，平均链长度较低的肽具有更高的抗氧化活性（AA）。Mendis等人（2005年）指出，肽链中两个氨基酸残基的疏水性和特定位置在抗氧化活性中起着重要作用。Ferreira等人（2007年）报告称，水解蛋白的还原能力与其向自由基提供电子并将其转化为更稳定产物的能力直接相关，从而中断链中的反应。关于MBR（膜生物反应器）的操作，我们观察到初始渗透通量较高，随后出现显著下降。这种行为是蛋白质超滤过程的典型特征（Cheryan 1998年）。Cheison等人（2006年）指出，未渗透蛋白的高回收率与其通过膜孔的能力密切相关，并且酶浓度也有利于这一过程，因为水解会增加蛋白质的渗透性。Leindecker（2011年）发现，当分子量截留值（MWCO）为10 kDa的UF（超滤）膜与MWCO为30 kDa和50 kDa的膜相比时，对牛奶蛋白的排斥率更高，但作者并未报告水解蛋白对这种分离效果的影响。Atra等人（2005年）报告称，使用MWCO为6–8 kDa的膜时，蛋白质的排斥率为92%–98%。我们使用了MWCO在30–80 kDa范围内的UF膜，虽然蛋白质的排斥率较低，但水解缩短了蛋白质的长度，我们观察到它们通过膜的量增加了。Rombaut等人（2007年）使用UF（30 kDa）和MF（0.1 μm及0.2 μm）膜来分离酪乳。蛋白质的排斥率（82.5%）高于我们的实验结果（55.9%）。研究人员观察到由于形成了浓度极化层，渗透率迅速下降，随后由于该层中磷脂的增加，渗透通量缓慢减少。因此，膜表面发生了严重的污染。Morin等人（2007年）对酪乳进行了微滤，并报告称，残留酪蛋白、小脂肪颗粒、离子钙和MFGM（乳脂球蛋白膜）等污染物将酪蛋白聚集在膜表面，形成了限制渗透的多孔层。我们也观察到酪乳在UF处理过程中渗透通量显著下降。在处理过的水解酪乳中，渗透通量仅为初始值的7.3%，而在未经处理的酪乳中这一比例为16.5%。我们推测小肽可以通过UF膜的不对称层并堵塞膜孔，这导致了渗透率的进一步下降。Roesch和Corredig等人（2003年）通过UF从酪乳中回收了脂质，并使保留物中的总脂质含量从8%增加到16%。Barry等人（2017年）使用Alcalase以及Neutrase和Alcalase的组合来水解酪乳中的蛋白质，以分离磷脂。作者得出结论，19%的pH值足以切割蛋白质，使肽能够通过50 kDa的UF膜。由于酪乳中含有游离脂肪（Mulder和Walstra 1974年），因此有脂肪进入了渗透液。游离脂肪无法通过撇去去除，而且这些分子可能太小而无法被UF膜截留，因此会进入渗透液。这些研究的目的是回收脂质，而蛋白质并非主要研究对象。然而，我们观察到在MBR配置中结合使用Alcalase + Neutrase + UF可以回收酪乳中的肽，保留物（含有脂质）和渗透液（含有生物肽）的生物价值都有所提高。小肽具有更高的抗氧化活性。在本研究中，我们在表4中使用理论方程预测了肽的大小，并通过电泳帮助确认了肽的摩尔质量。Ali（2019年）对酪乳进行了电泳分析，并解释了分子标记：α-乳球蛋白的分子量在10–15 kDa之间；β-乳球蛋白在15–20 kDa之间；酪蛋白（β、α和?）在20–40 kDa之间。此外，超过50 kDa的还有MFGM（乳脂球蛋白膜）蛋白（如酪脂球蛋白、黄嘌呤氧化酶和脱氢酶）。酪脂球蛋白是一种糖蛋白，占MFGM总蛋白质质量的40%以上。黄嘌呤氧化酶占总蛋白质质量的12%。图4中的电泳条带B显示，只有酪乳蛋白的分子量超过50 kDa，因此包括MFGM蛋白。经过酶水解后，来自MFGM的蛋白质和酪蛋白被分解成小于5 kDa的肽，这些肽太小而无法在凝胶中保留。此外，可能小于5 kDa的肽（表4）会在电泳过程中从凝胶中洗脱出来（?nay-U?ar等人2014年也有类似报告）。电泳显示酪乳中含有不同分子量的蛋白质，其中MFGM蛋白（如磷脂）的标记更明显。Britten等人（2008年）报告称，MFGM蛋白占酪乳总蛋白质的19%，Wong和Kitts（2003年）认为MFGM蛋白对酪乳的抗氧化能力有显著贡献。此外，来自牛奶蛋白的天然肽（α-乳白蛋白和β-乳球蛋白）也负责酪乳的抗氧化活性。酪蛋白比乳清蛋白具有更高的抗氧化活性，因为酪蛋白可以在其较大的表面积上捕获自由基（Ries等人2010年）。此外，蛋白质摩尔质量的降低释放出自由链，从而捕获自由基，进而提高抗氧化活性。通过Alcalase + Neutrase进行水解后，抗氧化活性（ALC）为2.939，这表明形成的肽主要是二肽和三肽。Guadix等人（2006年）得到了类似的结果：ALC为4.3，最大DH为23%，其中两种肽的摩尔质量在1–5 kDa之间，占79%。Perea和Ugalde（1996年）也对乳清进行了水解，他们分别得到了0.635 kDa和4.2的ALC。此外，27%的肽的摩尔质量在1–3 kDa之间。因此，我们的估计是MBR产生的渗透液具有较低的摩尔质量和较高的生物活性。本研究中生产的酪乳组分的营养价值不仅因其蛋白质含量而提高，还因为所得肽的生物可利用性。酶水解结合MBR技术的使用有助于选择低分子量片段，这些片段在营养上优于完整的蛋白质。人体消化系统具有专门的转运蛋白，如PepT1，它们优先吸收二肽和三肽而不是游离氨基酸，从而提高生物利用度（Gilbert等人2008年）。此外，观察到的抗氧化特性与肽的结构有关，因为较短的肽链（通常含有2–10个氨基酸残基）具有更强的中和自由基的能力（Zou等人2016年）。这种结构与活性之间的关系是开发功能性乳制品成分的关键因素，将传统的副产品转化为高价值的健康促进成分（Hernández-Ledesma等人2011年）。全球酪乳市场在传统领域如烘焙和饮料行业表现出持续增长（Blake 2023年）。根据最新的行业报告，预计未来五年内该市场将以约4.5–5.1%的复合年增长率（CAGR）扩张，这得益于消费者对天然和清洁标签乳制品成分的偏好增加（Mordor Intelligence 2024年）。将这种乳制品副产品转化为生物活性肽的来源，对于乳制品行业来说是一个战略性的进步，以满足市场对专业化和功能性营养的需求。此外，通过MBR生产这些成分可以提高最终产品的营养价值，并提供对健康有益的抗氧化特性。这种技术转变符合当前市场趋势，即优先选择高蛋白、低脂肪的乳制品衍生物，这些产品具有经过验证的代谢益处，将传统的副产品转化为高价值的功能性成分。最后值得注意的是，酪乳中蛋白质的水解及其在膜生物反应器中的分离使得酪乳中的总蛋白质含量（包括渗透液和保留物）都能被利用，因为这两者的生物活性都高于未经处理的酪乳。

**结论**
从酪乳中获得了低摩尔质量和较高生物活性的肽。使用Alcalase和Neutrase组合的膜生物反应器得到的渗透液显示出956 μmol TE/g蛋白质的抗氧化活性，而未经处理的酪乳的抗氧化活性为356 μmol TE/g蛋白质。利用酪乳生产生物活性水解肽可以为这种副产品的增值提供另一种途径，从而为拉丁美洲地区的消费者提供具有健康益处的乳制品。此外，保留物可用于回收磷脂，并将酪乳转化为两种高生物价值的产品。

**致谢**
作者S.S.F.感谢CAPES提供的奖学金。

**作者贡献**
对于多作者的研究文章，必须提供一段简短的文字说明每位作者的个别贡献。具体贡献包括：概念构思（V.B.B.、S.S.F.）、方法学（V.B.B.、S.S.F.）、验证（V.B.B.、S.S.F.、S.G.、J.S.、I.A.F.）、数据分析（V.B.B.、S.S.F.、J.S.、I.A.F.）、调查（V.B.B.、S.S.F.、S.G.、F.V.T.、G.H.T.、D.T.N.）、资源获取（V.B.B.、J.S.、I.A.F.）、数据管理（V.B.B.、S.S.F.）、初稿撰写（V.B.B.、S.S.F.）、审稿和编辑（V.B.B.、S.G.）、可视化（V.B.B.、S.G.）、监督（V.B.B.）、项目管理（V.B.B.）以及资金获取（V.B.B.）。所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。请参考CRediT分类法了解术语解释。作者身份应仅限于对研究工作有实质性贡献的人员。

**资金支持**
本研究部分由CAPES（巴西高等教育人员培训协调委员会）资助，财务代码为001。

**利益冲突声明**
作者声明没有利益冲突。

**数据可用性声明**
本研究中的数据来源于巴西论文公共仓库中的以下资源：http://tede.upf.br:8080/jspui/handle/tede/2063。