通过结合重组酶辅助扩增技术和侧向流动试纸检测方法，实现对鸡毒支原体的快速视觉识别

《Poultry Science》：Rapid visual detection of Mycoplasma gallisepticum by combining recombinase-aided amplification with lateral-flow dipstick assay

　　汇勇轩|舒旺|新义仁|方旺|刚路|高峰|崔耀成
新疆生产建设兵团动物疾病预防与控制重点实验室，石河子大学动物科学技术学院，新疆石河子市，832000，中国

**摘要**
鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）是一种重要的禽类病原体，对全球范围内的鸡和火鸡具有负面影响，并被世界动物卫生组织列为需报告的疾病病原体。因此，快速准确的诊断是控制MG感染的关键因素。本研究建立了一种基于重组酶辅助扩增（RAA）与侧向流动试纸（LFD）结合的简单、快速且可视化的检测方法。通过引物和探针筛选后，优化了RAA-LFD方法的引物浓度、探针浓度、反应时间和条件，并分析了其特异性和敏感性。结果表明，在39°C的等温条件下，RAA可在20分钟内扩增目标基因，并且产物可在5分钟内通过LFD可视化。该方法与鸡滑液支原体（Mycoplasma synoviae）、牛支原体（Mycoplasma bovis）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、溶血曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌属（Salmonella spp.）、大肠杆菌（Escherichia coli）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、粪肠球菌（Enterococcus faecium）或粪肠球菌（Enterococcus faecalis）无交叉反应。此外，RAA-LFD方法表现出高灵敏度和良好的重复性，检测限为10拷贝/μL。共有100份疑似MG感染的临床样本使用RAA、PCR和实时荧光定量PCR（qPCR）进行了检测。RAA检测方法与传统PCR或qPCR之间的符合率分别为96%和98%。这些结果表明，所建立的RAA-LFD方法操作简便、特异性高且灵敏度好，适用于基层现场的MG感染诊断。

**引言**
鸡毒支原体是一种对全球鸡类构成威胁的致病性支原体，被世界动物卫生组织列为需报告的疾病（Yehia等人，2023年）。它会引起慢性呼吸道疾病和生殖系统损伤，表现为鼻分泌物、气管啰音、咳嗽、呼吸困难及输卵管炎。因此，会导致体重增长减缓、产蛋量下降、孵化率降低、胴体质量下降以及鸡对其他疾病的易感性增加（Ishfaq等人，2020年；Mugunthan等人，2023年）。据估计，仅在美国蛋鸡生产领域，MG每年造成的经济损失就约为1.4亿美元（Chaidez-Ibarra等人，2022年）。此外，现有研究表明，MG在中国本土鸡中普遍存在，给中国的家禽产业带来了巨大的经济损失（Wei等人，2023年；Fang等人，2025年）。因此，开发早期、快速且简单的检测方法对于控制MG的传播具有重要意义。
传统的和新型的诊断方法已被建立并应用于MG的检测，包括细菌培养、血清学检测（如ELISA）和分子技术（如常规PCR和实时荧光定量PCR）（Sprygin等人，2010年；Ball等人，2020年；Elyazeed等人，2020年；Matucci等人，2023年）。尽管这些方法可靠，但它们依赖于复杂的仪器和熟练的技术人员，限制了其在现场检测中的应用。为了解决这些问题，出现了等温核酸扩增技术，包括重组酶辅助扩增（RAA）、滚环扩增（Rolling Circle Amplification）、环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）和链置换扩增（Strand Displacement Amplification）（Lee等人，2022年；Nguyen等人，2022年；Ghosh等人，2025年）。然而，滚环扩增、环介导等温扩增（LAMP）和链置换扩增存在引物设计复杂以及需要相对较多引物的问题，这也限制了它们的广泛应用。作为代表性的等温核酸检测技术，RAA因其引物简单、操作方便、无需特殊设备以及扩增温度较低而脱颖而出。
侧向流动试纸技术是一种便携式辅助工具，已成功应用于基于核酸、抗原和抗体的检测中，其结果可以直接用肉眼观察到（Ginés等人，2021年）。因此，LFD具有现场检测的潜力。RAA-LFD通过试纸实现扩增产物的可视化检测，使RAA技术更适合即时检测（POC）应用。该检测方法利用重组酶促进引物与双链DNA（dsDNA）互补序列的结合，并依赖单链DNA结合蛋白（SSB蛋白）防止引物解离（Homklinkaew等人，2023年）。DNA聚合酶通过其链置换活性进行复制，从而合成新的互补DNA链（Tian等人，2023年）。在37至42°C下短期孵育后，可通过试纸检测到扩增产物，通常需要约一小时，这使得RAA特别适合现场检测（Yu等人，2025年）。目前，RAA-LFD已应用于人类和动物的多种病原体检测（Jiang等人，2025年）。本研究建立了一种快速RAA-LFD检测方法，对MG的可视化检测具有强特异性和高灵敏度。该技术能够实时监测MG，为MG的风险评估和控制策略提供及时依据。

**材料与方法**
**细菌菌株和临床样本**
使用了4株MG菌株以及鸡滑液支原体（Mycoplasma synoviae）、牛支原体（Mycoplasma bovis）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、溶血曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌属（Salmonella spp.）、大肠杆菌（Escherichia coli）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、粪肠球菌（Enterococcus faecium）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）菌株（均从临床分离并在实验室保存）。共收集了100份疑似MG感染的鸡的咽喉样本，用无菌棉签采集样本后放入PBS缓冲液中，立即送回实验室。所有材料均储存在-80°C。
**核酸提取**
MG、鸡滑液支原体、牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼海姆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、粪肠球菌和粪肠球菌的DNA模板均按照DNA提取试剂盒（Novizan Biotechnology Co., Ltd.，南京）的说明进行提取。提取的DNA浓度使用微量核酸和蛋白质分析仪（NanoDrop 2000）测定。所有DNA样本均储存在-20°C。
**引物的设计与筛选**
基于MG的mgc2和pvpA基因的保守序列（GenBank登录号：U34842.1和AF035624.1），并根据RAA（Basic）试剂盒（Nanjing Wobo Biotechnology Co., Ltd.，南京）说明书的要求，设计了四对引物（表1）。RAA反应体系（50 μL）的组成如下：缓冲液A 25 μL；正向引物（10 μM）和反向引物（10 μM）各2 μL；DNA模板5 μL；无菌水13.5 μL；缓冲液B 2.5 μL。使用MG菌株SHZ-1提取的DNA作为扩增模板。阴性对照组用5 μL无菌水代替DNA模板。反应体系在39°C的水浴中孵育20分钟。RAA扩增产物通过酚-氯仿纯化后，再进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。最终选定的最佳引物对用于后续的RAA-LFD条件优化。
**表1. 本研究设计的用于检测MG的mgc2和pvpA基因的寡核苷酸引物和探针**
| 引物 | 基因 | 序列（5′→3′） | 产物大小（bp） |
|-----------------|-----------------|------------------|---------------|
| MG-F1 | mgc2 | TGCCACCTAACCAAATGGGAATGCGACCAG | 166 |
| MG-R1 | GCTTTATTTCCCATCGGCACCCCACCACCAM | | 280 |
| MG-F2 | CTAATCCCCAACAAAGAATTAACCCACAGG | | 280 |
| MG-R2 | CTTACAGCTTTATTTCCCATCGGCACCCCAM | | 218 |
| MG-R3 | ATTCATATTAGGCATTTGGTTAGGGAAGTTT | | 218 |
| MG-F4 | pvpA | GCTCTTATTCTATTGTCAGGGATTGCACTAAC | 226 |
| MG-R4 | CAAGTAATACAATCCCTACTACAAGTCCAG | | 226 |
| MG-R1b | mgc2 | Biotin-GCTTTATTTCCCATCGGCACCCCACCACCA | | |
| 探针1 | FAM-AACCAAATGCCCCCACAAATGGGAGGAATGCC[THF]CCAAGACCAAACTTCC-C | | |
| 探针2 | FAM-AGACCAAACTTCCCTAACCAAATGCCTAATAT[THF]AATCAACCAAGACCA-C | | |

**探针的设计与筛选**
上述筛选出的最佳引物对为MG F1/MG R1。使用该引物对进行RAA反应后，在琼脂糖凝胶中观察到预期大小的清晰明亮条带。随后，将反向引物的5′端标记生物素并命名为MG R1b。根据RAA（LFD）试剂盒（Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd.，南京）的说明，设计了两种探针（表1）。每种探针的5′端标记FAM荧光团，在探针中间加入四氢呋喃（THF）位点，并在3′端加入C3磷酸化间隔基团。每种探针均在不添加MG DNA模板的情况下进行RAA-LFD检测，以检测可能由引物-探针复合物引起的假阳性信号。
**RAA-LFD检测法的建立**
根据RAA核酸扩增试纸试剂盒（Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd.，南京）的说明，建立了50 μL的RAA反应体系。预混液包括25 μL的A缓冲液、12.9 μL的ddH?O、2 μL的正向引物（2 μM）、2 μL的反向引物（2 μM）、0.6 μL的探针（2 μM）、5 μL的DNA模板和2.5 μL的B缓冲液。将预混液在干净的PCR管中充分混合后加入含有冻干酶制备物的检测单元管中。随后向检测单元管中加入5 μL待测DNA样本，并在管盖内侧滴加2.5 μL的B缓冲液。紧密盖紧管盖，轻轻翻转管子5-6次以确保充分混合，以12000 rpm离心10秒，然后在39°C的恒温水浴中孵育20分钟。反应结束后，将50 μL的反应混合物用无菌水或PBS按1:300的比例稀释，使用通用核酸检测试纸（Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd.，南京）进行检测。实验流程如图1所示。

**图1. RAA-LFD检测平台示意图。**
从临床样本中提取DNA，利用RAA技术快速扩增目标基因。扩增产物在39°C的恒温水浴中孵育20分钟。反应结束后，将50 μL的反应混合物用无菌水或PBS（50 μL反应混合物：300 μL稀释液）稀释，使用通用核酸检测试纸进行检测。

**RAA-LFD反应条件的优化**
将选定的最佳引物对进行稀释。在其他反应体系成分不变的情况下，分别将正向和反向引物添加到体系中，最终浓度分别为0.5、1、1.5、2、3和4 μM，以筛选最佳引物浓度。根据最佳引物浓度，将探针浓度稀释为0.5、1、1.5、2、3和4 μM，以筛选最佳探针浓度。确认最佳引物和探针浓度后，分别将反应温度设定为25、30、35、37、39和41°C，每种反应孵育30分钟以筛选最佳反应温度。最后，将反应时间设定为10、15、20、25和30分钟，以优化最佳反应时间。
**特异性测试**
使用MG、鸡滑液支原体、牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼海姆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、粪肠球菌和粪肠球菌的DNA作为模板，以ddH?O作为阴性对照模板，在优化的最佳反应条件下进行RAA-LFD检测，以评估该方法的特异性。
**标准质粒的构建**
对MG的mgc2基因进行了聚合酶链反应扩增。MG mgc2基因的完整PCR扩增引物如下：正向引物：TTGGAGTTAGCTTTGTGTTCTCG；反向引物：ATTTTGCGGTGGAAAACCAGCTC。PCR扩增体系包括10 μL的PCR Mix、6 μL的ddH?O、各1 μL的正向和反向引物（10 μM）以及2 μL的DNA模板。反应程序设置为：95°C预变性5分钟；95°C变性30秒、61°C退火30秒、72°C延伸30秒；最后在72°C延伸7分钟。反应结束后，将扩增片段连接到pMD19-T载体上并转化至DH5α感受态细胞中。阳性菌株通过菌落PCR进行筛选和验证，然后送至上海桑贡生物技术有限公司进行测序，测序结果在NCBI中进行比对。根据质粒提取试剂盒的说明提取质粒DNA并储存在-20°C。通过PCR和测序验证重组质粒（pMD19-mgc2）的正确性后，使用超微量分光光度计测定其浓度并计算拷贝数。质粒拷贝数是通过以下公式计算的：质粒拷贝数（拷贝/μL）= [质粒浓度（g/μL）× 6.02×1023] / [质粒长度（bp）× 660 g/mol]。质粒pMD19-mgc2在10?到102拷贝/μL的梯度范围内进行了十倍稀释，并储存在-20°C。

**RAA-LFD、PCR和qPCR的敏感性测试**
使用质粒pMD19-mgc2的系列稀释液（浓度范围：1.8×10?到1.8×10?拷贝/μL）作为模板，来确定三种方法的敏感性：RAA-LFD、PCR和qPCR。RAA-LFD检测在上述最佳条件下进行。用于PCR检测的引物与RAA-LFD检测的引物相同，退火温度为71°C；其余反应系统和操作步骤与构建标准质粒时使用的相同。对于qPCR检测，采用了TB Green实时PCR试剂盒（Takara Biotech Co., Ltd., Beijing, China），引物也与PCR相同。25 μL的qPCR反应体系包括12.5 μL的qPCR Mix、1 μL的正向引物（10 μM）、1 μL的反向引物（10 μM）、1 μL的模板和9.5 μL的无菌水。反应程序设置为：首先在95°C下预变性30秒；然后进行40个循环，每个循环包括在95°C下变性15秒和在58°C下退火5秒。

**重复性测试**
使用本研究中建立的MG核酸检测方法，使用三种不同浓度的重组质粒（1.8×10?拷贝/μL、1.8×103拷贝/μL和1.8×102拷贝/μL）作为模板，进行了三次内实验和实验间重复性测试，并分析了扩增结果。

**临床样本的检测**
从中国新疆石河子市两个肉鸡养殖场的疑似MG感染的鸡中收集了100份喉拭子样本。这些鸡表现出关节肿大、运动障碍、呼吸困难、生长迟缓、产蛋量下降、鼻窦炎或结膜炎等临床症状。这些鸡均未接种过MG或MS疫苗。所有样本均使用了RAA、PCR和qPCR进行检测。

**结果**

**引物和探针的筛选**
在本研究中，设计了四对针对MG菌株mgc2和pvpA基因的引物，用于RAA扩增分析。纯化后，通过2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果显示，所有设计的引物对都能产生预期大小的特异性条带；其中，MG F1/MG R1引物对产生的条带最亮、最清晰，非特异性条带最少（图2A）。因此，选择MG F1/MG R1引物对作为后续实验的最佳组合。为了避免LFD检测中的潜在假阳性信号，设计了两组探针，并使用MG F1/MG R1b进行了RAA-LFD检测。结果表明，两组引物-探针组合在试纸上均显示出阳性条带；然而，在无模板阴性对照中，MG F1/MS R1b/Probe 1在测试线位置出现了假阳性条带，而MG F1/MG R1b/Probe 2没有条带（图2B）。最终选择MG F1/MG R1b/Probe 2作为后续实验的引物-探针组合。

**RAA反应条件的优化**
在其他条件不变的情况下，设置了引物浓度梯度。如图3A所示，在0.5 μM到4 μM的引物浓度范围内可以观察到清晰的测试条带，且在1.5 μM到4 μM时条带更明显。综合考虑后，最终选择1.5 μM作为引物浓度，并添加了2 μL的正向引物和反向引物。接下来进行了RAA-LFD探针浓度的筛选。如图3B所示，在0.5 μM到4 μM的探针浓度范围内可以观察到清晰的测试条带，且在1.5 μM时条带最明显。因此，选择该范围内的较低探针浓度（1.5 μM）用于后续的RAA检测，并添加了0.6 μL的探针。确定了RAA-LFD检测的最佳反应温度。如图3C所示，在30°C到39°C的温度范围内可以检测到条带，其中39°C时条带强度最高。因此，选择39°C作为后续RAA-LFD检测的反应温度。随后进一步确定了RAA-LFD检测的最佳反应时间（图3D）。结果显示，在10到30分钟的时间范围内可以观察到清晰且可区分的目标条带，且20到30分钟时条带强度最佳。因此，选择该范围内的较短时间（20分钟）用于后续实验。

**特异性测试**
使用MG和其他十种鸡病原体的核酸作为模板，评估RAA-LFD检测方法的特异性。结果显示，所有MG菌株在琼脂糖凝胶电泳后均产生了目标条带，而其他细菌的DNA产生了阴性结果（图4A）。这表明RAA-LFD方法对MG的检测具有优异的特异性，且与其他常见鸡病原体无交叉反应。

**RAA-LFD的敏感性比较**
测试并比较了RAA-LFD、PCR和qPCR的敏感性。结果显示，这三种方法的检测限分别为1.8×101拷贝/μL、1.8×103拷贝/μL和1.8拷贝/μL（图4B-D），表明RAA-LFD检测的敏感性是PCR的100倍，但低于qPCR。

**重复性测试**
对建立的RAA-LFD方法进行了内实验和实验间重复性测试。实验间重复性测试的结果显示在图4E中。对于MG，三种不同浓度的重组质粒（1.8×10?拷贝/μL、1.8×103拷贝/μL和1.8×102拷贝/μL）被分组并在三次重复实验中进行了测试。所有三种浓度下均出现了清晰的测试条带，且条带强度在三次重复试验中基本一致。内实验重复性测试的结果显示在图4F中。对于MG，在所有三种浓度（1.8×10?拷贝/μL、1.8×103拷贝/μL和1.8×102拷贝/μL）下均观察到清晰的测试条带，且每种浓度下的条带强度高度一致。这表明本研究中建立的MG RAA-LFD方法具有优异的重复性和再现性。

**临床样本的检测**
使用三种方法（RAA-LFD、PCR和qPCR）同时检测了100份疑似MG感染的临床样本。结果显示，RAA-LFD的阳性率为58%（58/100），而PCR和qPCR的阳性率分别为54%（54/100）和60%（60/100）。RAA-LFD与PCR之间的符合率为96%，RAA-LFD与qPCR之间的符合率为98%（表2）。值得注意的是，所有54个PCR阳性样本在RAA-LFD检测中也为阳性，敏感性（阳性一致率）为100%。在46个PCR阴性样本中，有42个也在RAA-LFD检测中为阴性，特异性（阴性一致率）为91.3%。与PCR方法相比，本研究中建立的RAA-LFD方法的Kappa值为0.9（表3）。这些结果表明，本研究中开发的RAA-LFD方法可用于临床样本中MG的检测。

**结论**
Mycoplasma gallisepticum是已知26种禽类支原体中最致病的一种（Klostermann和Lierz, 2023）。它可以通过垂直和水平传播，在全球所有养禽国家广泛分布（Kursa等, 2024）。此外，它通常继发于或同时存在于新城疫、传染性支气管炎、Haemophilus paragallinarum疾病和大肠杆菌感染等传染病中，对禽业造成重大经济损失（Liu等, 2025a）。快速、准确和便捷的检测方法对于早期临床诊断和预防MG感染至关重要。等温核酸扩增技术由于其可视化、操作简单、效率高和成本低等优点而迅速发展，特别是RAA和RPA（Bi等, 2025；Zhang等, 2026）。RAA是RPA技术的优化版本，具有更大的推广和应用潜力。RAA中使用的重组酶来源于细菌或真菌，因此其来源更广泛且成本更低（Bi等, 2025）。目前，RAA技术已成功应用于多种动物病原体的检测，如布鲁氏菌（Liu等, 2025b）、新型鸭正肠病毒（Jiang等, 2025）和马链球菌（Zu等, 2025）。

本研究提出了一种通过靶向MG的mgc2基因来诊断MG的RAA-LFD方法。引物和探针是RAA-LFD检测的关键组成部分。为了实现最佳的扩增特异性和效率，推荐的RAA检测引物长度为30–35 bp，探针长度为46–52 bp（Zhao等, 2021）。然而，较长的引物和探针可能形成二级结构，且反向引物和探针上的化学修饰容易在LFD检测中产生假阳性信号（Li等, 2023；Yin等, 2025）。因此，对引物和探针进行筛选是必要的。在本实验中，选择了最佳的引物组合MG F1/MG R1/Probe 2用于MG检测。使用这种组合（引物浓度1.5 μM，探针浓度1.5 μM），RAA反应在39°C下20分钟内完成，扩增产物可以通过LFD在5分钟内被检测到，且不会产生假阳性信号。目前，PCR和qPCR是大多数实验室中用于MG分子检测的主要技术（Galluzzo等人，2022年；Kang等人，2023年）。为了评估RAA检测方法对MG的检测性能，我们将其与实验室开发的PCR和qPCR方法进行了比较。PCR和qPCR对MG的检测限分别为1.8×103拷贝/μL和1.8拷贝/μL，这与相关文献中的数据一致（Wang等人，2024年），证实了这两种方法作为RAA对照的可靠性。本研究证明，RAA-LFD检测方法的灵敏度可达101拷贝/μL。虽然PCR和qPCR需要昂贵的热循环仪和经验丰富的技术人员，但本研究中开发的RAA-LFD方法可以在水浴中轻松进行，并通过观察侧向流动试纸条上的条带来直观解读结果。本研究开发的诊断系统也适合非专业人员使用。用户只需将所需的试剂与待检测的核酸样本混合，反应在水浴中进行，然后使用侧向流动试纸条进行检测。该检测方法主要需要的仪器是移液器和水浴，这凸显了其在现场进行MG鉴定的潜力。最近的研究表明，研究人员已将RPA与来自Pyrococcus furiosus的Argonaute蛋白结合用于MG的检测。这种方法可以在蓝光或紫外光下进行可视化观察（Zhao等人，2025年）。然而，这种方法需要额外的设备，如用于视觉检查的蓝光或配备UV透射光的成像系统来捕捉反应管的图像，并通过连接的计算机软件获得清晰的图像。因此，RAA-LFD检测方法更适合基层养殖人员用于MG感染的诊断。

**结论**
本研究建立了一种基于mgc2的RAA-LFD检测方法。该方法针对鸡MG基因组中最保守的区域设计，验证了其在快速直观检测MG特异性核酸方面的有效性。RAA扩增的产物通过LFD可视化技术被检测到。该检测方法表现出优异的分析灵敏度和特异性，以及出色的重复性和再现性。该方法快速便捷，不需要专门的设备或高技能人员，因此非常适合在资源有限的环境或现场环境中进行MG的现场诊断和分子流行病学调查。

**利益冲突声明**
作者声明没有利益冲突。

**补充材料**
补充材料1. RAA-LFD临床样本检测结果
补充材料2. PCR临床样本检测结果
补充材料3. qPCR临床样本检测结果

**作者贡献声明**
Xuan Huiyong：撰写——原始草稿，研究
Wang Shu：方法学，研究，正式分析
Ren Xinyi：软件，正式分析，数据管理
Wang Fang：软件，正式分析
Lu Gang：监督，方法学
Gao Hongwei：方法学，正式分析
Cui Yaocheng：撰写——审稿与编辑，资金获取