整合16S rRNA基因测序和转录组学技术，研究圆叶当归（Ilicis Rotundae Cortex）提取物对脂多糖/Lenrofloxacin诱导的小鸡肝脏损伤的保护作用

《Poultry Science》：Integrating 16S rRNA gene sequencing and transcriptomics to investigate the hepatoprotective effects of Compound Ilicis Rotundae Cortex against Lipopolysaccharide / Enrofloxacin-induced liver injury in chicks

　　张盖银|张志丹|孟健|钱雅静|秦玉喜|李卓然|罗世奇|李旭欣|苏杰宇|司洪彬
广西大学动物科学和技术学院，南宁市，530004，广西，中国

**摘要**
研究表明，圆叶石楠树皮（CIRC）具有缓解大肠杆菌诱导的肝损伤的作用。然而，其针对雏鸡肝损伤的疗效及其调控机制仍不清楚。本研究利用脂多糖（LPS）和恩诺氟沙星（ENR）建立了雏鸡肝损伤模型，以探讨CIRC的效果。结果表明，日粮中添加3‰的CIRC显著预防了肝损伤，恢复了生长性能，并减轻了受损雏鸡的炎症和氧化应激。通过对16S rRNA基因测序和肝脏转录组学的综合分析，发现CIRC的肝保护作用是通过肠-肝轴介导的。CIRC通过调节肠道微生物群、增强肠道屏障功能并丰富产生丁酸的细菌，增加了血清和肝组织中的丁酸（BA）水平，缓解了LPS/ENR对肝脏丁酸代谢途径的抑制，并进一步调控了IL-17、Toll样受体和NF-κB信号通路，从而共同发挥肝保护作用。总之，CIRC通过调节肠道微生物群在预防雏鸡肝损伤中起着关键作用。

**引言**
由大肠杆菌等病原菌引起的禽类疾病具有高发病率和死亡率，给家禽业带来了巨大的经济损失，并对公共健康构成严重威胁（Monroy等人，2025；Wang等人，2025）。然而，不恰当地使用抗生素预防和治疗病原体感染可能导致家禽出现抗药性和毒性（Badawy等人，2021；Peng等人，2022）。特别是过量或长期使用抗生素会加重肝脏的代谢和排毒负担，导致肝损伤（Westphal等人，1994；Zhu等人，2013；Ling等人，2023）。此外，抗生素使用常伴随肠道微生物群失衡，进而导致内毒素（脂多糖，LPS）水平升高（Kuti等人，2020；Zhong等人，2022）。LPS是一种强效的免疫刺激剂，会引发全身性炎症反应（Gong等人，2025），从而加剧家禽的肝损伤（Xia等人，2025）。圆叶石楠树皮（IRC），在中国壮族自治地区被称为“九 Bi Ying”，是一种传统中草药，来源于圆叶石楠（Ilex rotunda Thunb）的干燥树皮或根皮（药典，2020；Zeng等人，2025）。迄今为止的研究表明，IRC含有120种已鉴定的生物活性化合物（Zeng等人，2022），这可能是其用于治疗咽喉痛和急慢性胃肠炎的主要临床依据（Shang等人，2022）。体外研究还证明了其对广泛病原微生物的显著抗菌活性（Wu，2017；Kim等人，2020）。除了抗菌作用外，其粗提物（Qiu等人，2015）及其活性成分——如圆叶酸（Liu等人，2021）和丁香苷（Chen和Xiao，2012；Jiang等人，2019）也被科学验证具有肝保护作用。此外，含IRC和刺五加根（RAB）、姜黄根（RC）的复方九 Bi Ying胶囊（国家药品批准号：Z44022534；由广州白云山兴群制药有限公司生产）被用于治疗腹泻和胃肠炎。一项关键的比较研究显示，IRC和CR的组合比三种成分的组合（IRC、RAB和CR）对小鼠大肠杆菌诱导的肝损伤更有效（Wang，2019）。然而，CIRC对家禽肝损伤的影响及其机制尚未完全阐明。

**材料与方法**
**药物制备**
LPS（IL2020）来源于大肠杆菌O55:B5，购自北京Solarbio科技有限公司（北京，中国）。ENR（250508）是一种兽用抗生素，购自浙江国安药业有限公司（杭州，中国）。IRC（240201）和RC（2502001）购自南宁浩雅生物药业有限公司（南宁，中国）。Gandan颗粒（202403021）是一种在中国获得审批的肝保护性兽药（兽药批准号：164006113），含有靛蓝染料植物（Isatis indigotica Fort.）和茵陈（Artemisia capillaris Thunb.），作为阳性对照，购自华旭有限公司（郑州，中国）。
**CIRC的制备**：将30克IRC与30克RC混合，浸泡在10倍量的水中过夜。次日剧烈煮沸，然后小火煮1小时，过滤收集滤液。残渣再分别用8倍和6倍量的蒸馏水提取两次，每次都采用相同的煎煮和过滤程序。所有滤液合并后进行真空过滤两次。合并后的滤液通过旋转蒸发浓缩至1克/毫升（粗草药当量）。在-80°C预冷后，浓缩物进行冻干。最终粉末产量为16.8克，表示每1克粉末相当于1克粗草药，储存在-20°C。

**实验动物与方案**
共获得180只1日龄黄羽雏鸡（一种在中国和东南亚广泛饲养的肉鸡品种，因其肉质优良）。该实验获得了广西大学实验动物伦理委员会的批准（批准号：GXU-2025-360）。经过14天的适应和统一饲养后，将雏鸡随机分为6组，每组包含5个重复笼舍，每个笼舍6只雏鸡。
- **对照组（C）**：未接受LPS/EN处理；
- **模型组（M）**：接受LPS/EN处理；
- **高剂量CIRC组（CIRC-H-M）**：接受LPS/EN处理并同时给予高剂量CIRC（饲料中0.3%）；
- **低剂量CIRC组（CIRC-L-M）**：接受LPS/EN处理并同时给予低剂量CIRC（饲料中0.1%）；
- **单独CIRC组（CIRC-H）**：未接受LPS/EN处理但给予高剂量CIRC（饲料中0.3%）；
- **Gandan颗粒组（GD-M）**：接受LPS/EN处理并同时给予Gandan颗粒（水中1克/升）。
除C组和CIRC-H组外的所有雏鸡在20至22日龄期间通过饮用水给予ENR（100毫克/千克体重/天）。22日龄时停止喂食和Gandan颗粒。最后一次给予ENR后，腹腔注射LPS（200微克/千克体重）（Guo等人，2012）。6小时后，从每个重复笼舍随机选取一只雏鸡，通过颈静脉采集血液，在室温下凝固2小时后以3500转/分钟离心10分钟分离血清。采集血液后，通过颈椎脱位处死雏鸡。收集肝脏的右叶和盲肠内容物，迅速放入液氮中冷冻，并储存在-80°C。此外，还固定了肝脏左叶的一半用于后续分析。

**生长性能测定**
在干预期间每天测量雏鸡的体重。体重增重（BWG）计算为最终体重减去初始体重。每只雏鸡的累计平均饲料摄入量（FI）为每个笼舍的总饲料摄入量除以笼舍内的雏鸡数量。干预期间的饲料转化率（FCR）计算公式为FCR（克/克）= FI（克）/ BWG（克）（Mo等人，2023）。

**肝功能指标测定**
使用商业试剂盒（ALT，目录号A059-2；AST，目录号C010-2-1；南京建城生物工程研究所，中国）严格按照制造商说明测定血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。

**抗氧化水平评估**
通过使用商业试剂盒（催化酶CAT，目录号ADS-W-KY002；总抗氧化能力T-AOC，目录号ADS-W-KY005；超氧化物歧化酶SOD，目录号ADS-W-KY011；一氧化氮NO，目录号ADS-W-N005-96；丙二醛MDA，目录号ADS-W-YH002；谷胱甘肽过氧化物酶GPx，目录号MM-60040O1；Enzyme-linked Biotechnology，中国）测定肝脏组织中的抗氧化状态。

**ELISA测定免疫细胞因子**
将肝脏组织在冰上快速解剖，准确称重，然后用9倍体积的冰冷生理盐水（1:9，w/v）匀浆。2500转/分钟离心10分钟后，收集10%的肝脏匀浆液，并使用总蛋白测定试剂盒（BCA方法，目录号A045-4-2；南京建城生物工程研究所，中国）测定其蛋白浓度。

**qRT-PCR定量免疫细胞因子mRNA表达**
从-80°C保存的肝脏组织中提取总RNA。组织在液氮中研磨后，使用StarSpin Animal RNA Kit（目录号P133-01；GenStar，中国）按制造商说明提取总RNA并测定其浓度。然后使用PrimeScript RT试剂盒（目录号A230-10；GenStar，中国）合成第一链cDNA。随后进行qRT-PCR以测定IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA表达水平。引物序列见表1。以β-actin为内参（Mo等人，2023），通过2^-ΔΔCt方法计算每个目标基因的相对mRNA表达量。首先计算ΔCt = Ct（目标基因）- Ct（β-actin）；接着计算ΔΔCt = ΔCt（实验组）- ΔCt（C组）。倍变化值表示为2^-ΔΔCt，C组归一化为1。

**肝脏的组织病理学检查**
固定后，肝脏标本脱水、修剪、包埋在石蜡中并切片。在光学显微镜下观察切片以评估肝组织病理变化。

**16S rRNA基因测序**
使用Mag-Bind Soil DNA Kit（200）（目录号M5635-02；Omega Bio-tek，美国）按制造商说明从盲肠内容物样本中提取总基因组DNA（每组n=5）。测定提取DNA的浓度和纯度。随后使用通用引物341F（5‘-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和806R（5‘-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）通过PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区域。制备测序文库并在Illumina MiSeq平台上测序。测序后，使用PEAR软件（版本0.9.8）根据重叠情况组装两个短读长序列，并使用Usearch软件（版本11.0.667）处理fastq文件生成单个fasta和qual文件。使用RDP数据库（http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp）对细菌OTU进行分类。使用Mothur软件（版本3.8.31）计算所有α多样性指数（包括Chao1、Simpson和Shannon指数）。在R软件（版本3.6.0）中绘制OTU富集曲线和物种丰度曲线。使用R vegan包（版本2.5-6）可视化β多样性，并使用STAMP（版本2.1.3）和LefSe（版本1.1.0）比较组间差异。

**雏鸡肝脏转录组测序**
使用Trizol试剂从肝脏组织中提取总RNA（每组n=5）。评估RNA质量，所有样本的RNA完整性数（RIN）> 7.0。构建特定链的cDNA文库，并在DNBSEQ-T7平台上测序。使用FastQC（版本0.23.4）和Trimmomatic进行质量控制后，使用HISAT2（版本2.1.0）将clean reads校正到Gallus gallus参考基因组。使用DESeq2（版本1.46.0）进行差异表达分析，以|log2FoldChange| > 1和调整后的p值（padj）< 0.05为显著差异。基因本体论（GO）术语和京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径的功能富集分析使用clusterProfiler（版本4.14.4）进行。通过ELISA检测丁酸（BA）含量根据ELISA试剂盒（目录号ELK8174，ELK Biotechnology CO., LTD，中国）提供的说明书确定了血清和肝组织中的BA含量。统计分析包括肝功能指标、抗氧化参数和免疫细胞因子的数据使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行，图表使用GraphPad Prism（10.1.2）生成。对于16S rRNA基因测序和转录组测序，相关数据分析和图形可视化是在Sangon Biotech（上海）有限公司（上海，中国）提供的高性能计算云平台上进行的（https://ngs.sangon.com/flow）。统计显著性定义为p < 0.05。

**结果**

**CIRC对雏鸡肝脏损伤的预防作用**
与C组相比，M组中的ENR和LPS组合诱导了雏鸡的肝肿大（图1(b)），以及血清中ALT和AST水平显著升高（图1(c)和1(d)）。然而，CIRC处理后这些病理变化明显得到了缓解。CIRC-H-M组的器官指数和ALT水平与GD-M组相当，而ALT和AST水平与C组没有显著差异（图1(b)–(d)）。此外，高剂量的CIRC显著降低了雏鸡的FCR（表2）。

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**图1. CIRC维持雏鸡的肝脏稳态。**
(a) 动物实验示意图；
(b) 肝指数；
(c) 血清中的ALT水平；
(d) 血清中的AST水平。数据表示为平均值±标准误差（mean ± SEM），每组n = 5。同一列上不同的字母表示具有显著差异（P < 0.05）。

**表2. 不同组别雏鸡的生长表现。**
| 组别 | BBW (g) | EBW (g) | FI (g) | FCR (g/g) |
|------|-------|-------|-------|--------|
| C | 93.03±1.31 | b | 150.47±2.98 | c |
| M | 97.46±0.70 | ab | 161.01±4.58 | abc |
| CIRC-H-M | 100.55±1.04 | a | 168.09±0.82 | ab |
| CIRC-L-M | 94.72±0.96 | b | 158.65±2.07 | bc |
| CIRC | 93.75±0.40 | b | 148.27±0.54 | d |
| GD-M | 100.15±1.62 | a | 171.89±1.96 | a |
| | | | 196.28±5.70 | b |

**注释：** 同一列中不同的上标字母表示具有显著差异（P < 0.05）。数据表示为平均值±标准误差（mean±SEM），每组n = 30（5栏×每栏6只雏鸡）。

**进一步的肝脏组织学检查显示了以下变化。** 如图2(a)所示，C组雏鸡的肝脏呈红亮、光滑、有弹性。H&E染色显示肝细胞核呈圆形，染色质分布均匀，肝索排列规则，窦状血管无充血。相比之下，M组的肝脏呈暗红色，肝索排列紊乱，肝细胞内含有大小不一的细胞质空泡，并伴有出血灶和窦状血管扩张（图2(b)）。单独补充CIRC不会改变正常的肝脏组织结构（图2(e)），但可以有效对抗LPS/ENR引起的肝脏损伤。在CIRC-H-M组中，肝脏呈红亮，没有明显的细胞质空泡化，肝索和窦状血管排列规则（图2(c)）。然而，CIRC-L-M组和GD-M组的肝脏颜色暗淡。尽管细胞质空泡化有所缓解，但这些处理未能阻止ENR与LPS联合引起的肝索紊乱和窦状血管扩张（图2(d)和2(f)）。这些结果表明，高剂量的CIRC可以保护肝脏免受ENR与LPS联合引起的损伤，并恢复雏鸡的生长表现。

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**图2. 不同组别雏鸡肝脏组织的病理切片（每组n = 5）。**
(a) C组；
(b) M组；
(c) CIRC-H-M组；
(d) CIRC-L-M组；
(e) CIRC-H组；
(f) GD-M组。红色圆圈内为出血灶；黄色箭头指向扩张的肝窦状血管；绿色箭头突出显示肝组织内的空泡。

**CIRC缓解肝脏损伤中的氧化应激**
氧化应激是肝脏损伤发展中的常见病理机制（Allameh等人，2023年）。肝脏损伤后肝细胞功能受损会引发氧化应激，持续或强烈的氧化应激会增加肝细胞死亡的风险（Matuz-Mares等人，2022年）。如图3(a)–(f)所示，在LPS/ENR联合刺激下，M组雏鸡的全身抗氧化能力（T-AOC）和关键抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）水平显著降低，而氧化损伤标志物（MDA和NO）水平明显升高。补充CIRC后，这些异常指标得到逆转。在CIRC-H-M组中，T-AOC、SOD、CAT和GPx的水平有效恢复到接近正常范围，MDA和NO的水平也显著降低，效果与Gandan颗粒相当。这些结果表明，氧化应激确实是LPS/ENR联合刺激引起的肝脏损伤过程中的核心机制，且CIRC（特别是高剂量时）通过增强内源性抗氧化防御并有效清除过量的自由基和脂质过氧化产物来发挥其保护作用。

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**图3. 不同组别肝脏组织的抗氧化能力。**
(a) T-AOC；
(b) SOD；
(c) CAT；
(d) GPx；
(e) MDA；
(f) NO。数据表示为平均值±标准误差（mean ± SEM），每组n = 5。同一列上不同的字母表示具有显著差异（P < 0.05）。

**CIRC调节雏鸡的炎症反应**
细胞炎症因子的平衡在肝脏损伤向进一步恶化或再生转变中起着关键作用（Jing等人，2018年）。在本研究中，使用qRT-PCR和ELISA测量了典型炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α）的转录和蛋白水平。与C组相比，M组雏鸡肝脏匀浆中的促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）水平显著升高，而抗炎因子IL-10的水平显著降低（图4(a)–(h)）。这表明LPS/ENR联合刺激引发了严重的肝脏炎症反应，伴随补偿性抗炎机制不足。与M组相比，CIRC处理防止了LPS/ENR引起的炎症反应。值得注意的是，高剂量的CIRC不仅降低了TNF-α、IL-1β和IL-6的转录表达，还显著提高了IL-10的水平，使其高于C组（图4(a)–(h)）。

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**图4. 不同组别雏鸡肝脏组织中的免疫因子水平。**
(a) IL-1β的相对mRNA表达；
(b) IL-6的相对mRNA表达；
(c) IL-10的相对mRNA表达；
(d) TNF-α的相对mRNA表达；
(e) IL-1β的浓度；
(f) IL-6的浓度；
(g) IL-10的浓度；
(h) TNF-α的浓度。IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的相对mRNA表达以β-actin为内部对照进行标准化，并表示为相对于C组（设为1）的倍数变化。数据表示为平均值±标准误差（mean ± SEM），每组n = 5。同一列上不同的字母表示具有显著差异（P < 0.05）。

**CIRC的肝保护机制的多组学分析**
已知CIRC可以进入肝脏和肠道经络，先前的研究报道它通过调节肠道微生物群的结构来保护胃肠道健康（Zeng等人，2022年）。为了进一步阐明肠道微生物群对CIRC肝保护作用的贡献，我们调查了相关的微生物变化。每个样本的原始数据测序质量见补充表1。有趣的是，根据α多样性指数，短期LPS/ENR处理增加了雏鸡盲肠微生物群的丰富度，而CIRC处理显著增加了微生物多样性（图5(a)–(c)）。基于加权UniFrac距离的β多样性比较显示三组之间存在显著差异（图5(d)–(f)。

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**图5. 盲肠内容物的16S rRNA基因测序结果（每组n = 5）。**
(a)–(c) α-多样性指标：Chao指数、Shannon指数和Simpson指数；
(d) OUT水平的PCA；
(e) OUT水平的PCoA；
(f) OUT水平的系统发育树；
(g) 属水平上的LEfSe分析；
(h) 属水平微生物群差异的ANOVA；
(i) 血清中的BA浓度。数据表示为平均值±标准误差（mean ± SEM），同一列上不同的字母表示具有显著差异（P < 0.05）。

**LEfSe用于识别每组中的微生物生物标志物（图5(g)）。** C组中的优势属是Erysipelatoclostridium；M组中的特征微生物包括Eisenbergiella、Anaerofilum和DTU089。CIRC处理后，Ruminococcaceae、Enterobacteriaceae和Actinobacteria成为优势菌属。简而言之，CIRC干预后最显著的变化是Eisenbergiella、Anaerofilum和DTU089的数量减少，而Ruminococcaceae、Enterobacteriaceae和Actinobacteria的数量增加。进一步分析不同组间的差异菌属发现，如图5(h)所示，LPS/ENR处理三天后雏鸡的肠道微生物群组成发生了变化。Anaerotruncus、Eisenbergiella、UC5-1-2E3、unclassified Clostridia vadinBB60组、Unclassified Bacteria、Anaerofilum和Negativibacillus以及Ruminococcus的数量增加。其中，Eisenbergiella和Anaerotruncus（在特定病理条件下）被认为是促炎微生物，表现为免疫细胞释放的炎症介质增加。相比之下，未分类的Oscillospiraceae、Oscillospiraceae UCG-005、Butyricicoccus、Pseudoflavonifractor和Ruminococcus torques组的数量减少，这些微生物有助于维持肠道屏障完整性和肠道稳态。这表明肠道屏障受损，Butyricicoccus的减少进一步导致宿主产生丁酸的能力下降。CIRC干预可能通过增加Blautia和Oscillospiraceae_UCG-005的数量来部分恢复肠道微生物失调，降低Eisenbergiella、unclassified Oscillospiraceae、UC5-1-2E3和unclassified_Clostridia_vadinBB60组的数量，并提高Lachnoclostridium、Unclassified_Ruminococcaceae、Enterococcus和Faecalibacterium的数量，从而进一步发挥肝保护作用。与这些肠道微生物群的变化一致，ELISA结果显示M组血清中的BA浓度显著降低，而CIRC通过增加产丁酸细菌的数量提高了血清中的BA水平（图5(i)）。这些结果表明LPS/ENR可以引起雏鸡的肠道微生物群失调，可能刺激促炎反应并加剧免疫失调。同时，CIRC似乎通过调节肠道微生物群来发挥其抗炎和免疫调节作用。

**CIRC通过逆转被抑制的丁酸盐代谢和调节炎症途径发挥肝保护作用**
每个样本的转录组测序原始数据统计信息见补充表2。为了确认CIRC在预防肝脏损伤中的免疫调节作用，对雏鸡肝脏进行了转录组测序。如图6(a)–(c)所示，LPS/ENR处理导致与C组相比有1,461个差异表达基因（DEGs），其中690个下调，771个上调。CIRC预处理后，相对于M组有126个DEGs下调，106个上调。图6(d)显示了M组相对于C组富集的前20个KEGG途径，其中识别出丁酸盐代谢途径。基因集富集分析（GSEA）确认该途径受到抑制（富集得分= -0.601，P = 0.032）（图6(e)），这与肠道微生物群测序结果一致。进一步测量肝脏组织中的BA浓度显示M组中的BA水平显著降低，而CIRC处理显著提高了肝脏中的BA水平（图6(f)）。BA水平的变化会影响身体的能量供应并调节炎症水平。如图6(g)所示，LPS/ENR处理抑制了肝脏的TCA循环，并异常激活了JAK-STAT、TNF和NF-κB途径。虽然刺激了促炎反应，但LPS/ENR抑制了肝脏中的过氧化物酶体途径，可能导致ROS积累、脂质代谢紊乱和氧化还原平衡失调。相反，CIRC预处理上调了细胞周期途径（富集得分= 0.453，P = 0.006），可能反映了损伤后肝脏组织的快速修复的增殖活性（图6(i)）。此外，它通过调节IL-17信号途径、Toll样受体信号途径和NF-κB信号途径发挥抗炎和免疫调节作用（图6h）。

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**图6. 肝组织转录组测序结果（每组n = 5）。**
(a) DEGs的火山图（M组 vs. C组）；
(b) DEGs的火山图（CIRC-H-M组 vs. M组）；
(c) 热图；
(d) 前20个富集KEGG途径的气泡图（M组 vs. C组）；
(e) 丁酸盐代谢的GSEA富集图（M组 vs. C组）；
(f) 血清中的BA浓度，数据表示为平均值±标准误差（mean ± SEM），同一列上不同的字母表示具有显著差异（P < 0.05）；
(g) GSEA前20个途径的 Ridge 图（M组 vs.C); (h) 前20个富集的KEGG通路的气泡图（CIRC-H-M与M对比）；(i) 细胞周期的GSEA富集图（CIRC-H-M与M对比）。讨论LPS常用于诱导肝损伤的模型中，通常与其他药物联合使用（He等人，2017年）。ENR是一种在临床实践中广泛使用的抗生素，用于预防和治疗家禽的细菌感染（Grabowski等人，2024年）；然而，长期使用可能导致肝毒性（Wang等人，2025年）。LPS和ENR联合使用以诱导雏鸡的肝损伤模型具有很高的临床相关性，因为它直接模拟了家禽养殖中最常见的病理情况之一——由细菌感染和抗生素治疗引起的并发症（Anwar和Mabrouk，2023年；Benameur等人，2023年；Wang等人，2023年）。作为基础研究与兽医临床实践之间的桥梁，该模型在筛选家禽肝脏保护药物方面具有物种特异性和转化潜力。该模型已成功应用于评估多种潜在的肝脏保护剂的有效性，如复合甘草酸铵（Guo等人，2020年）和改良的 rougan decoction（Wang等人，2023年）。在本研究中，LPS和ENR的联合使用导致了肝脏的显著组织病理学损伤，这与先前文献中报告的典型肝损伤模型一致（Guo等人，2012年；Wang等人，2023年）。然而，一个限制是没有广泛应用的鸡肝病理损伤评分标准，因此我们无法客观量化这些组织病理学变化。氧化应激已被证实是多种肝脏疾病的发生和发展的关键驱动因素，包括药物诱导的肝损伤、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病和肝纤维化（Allameh等人，2023年）。LPS诱导的肝脏氧化应激是一个涉及多种细胞类型和信号通路的复杂过程（Zhong等人，2016年；Yang等人，2025年）。其特征是ROS的产生与内源性抗氧化防御系统之间的不平衡，导致细胞大分子的损伤，进而引发炎症、凋亡和坏死（Li等人，2023年）。在本研究中，LPS/ENR的联合使用下调了肝脏过氧化物酶体通路，导致ROS积累。同时，SOD、CAT和GPx的水平下降，阻碍了ROS的清除，最终促进了氧化应激引起的肝损伤。许多现代药理学研究表明，中药（TCM）及其活性成分可以通过多靶点和多通路有效缓解氧化应激，从而对肝损伤产生显著的保护作用（Qian等人，2024年；Wu等人，2025年）。中药化合物如柴胡疏肝散（Lou等人，2022年）和甘蔗糖颗粒（Liu和Wang，2021年）已被发现通过与Nrf2/HO-1通路的调节来发挥肝脏保护作用。类似地，来自中药的黄酮类和酚类化合物，包括绿原酸（Wei等人，2025年）、白芥素（Dong等人，2020年；Wang等人，2021年）、槲皮素（Zhang等人，2024年）和表儿茶素（Zhang等人，2025年），也能有效激活Nrf2通路并缓解氧化应激。尽管我们的转录组数据中Nrf2通路没有富集，但富含黄酮类和酚酸的CIRC表现出強烈的氧化应激调节活性。它在LPS/ENR处理后显著恢复了下降的抗氧化能力（T-AOC、SOD、CAT、GPx），并降低了氧化损伤标志物（MDA、NO），从而对肝损伤起到了显著的保护作用。在肝损伤的病理过程中，氧化应激和炎症反应之间存在密切的因果关系（Liu等人，2020年）。ROS本身作为重要的炎症信号分子（Chen等人，2024年），能够激活多种促炎信号通路，尤其是NF-κB通路（Li等人，2019年；Li等人，2022年）。NF-κB的激活会导致促炎细胞因子的产生（Fajgenbaum和June，2020年），如TNF-α、IL-6和IL-1β。这些炎症介质反过来可以刺激炎症细胞产生更多的ROS，从而形成一个恶性循环（Chen等人，2025年）。中药的一个关键优势在于它能够同时针对这两个相互关联的过程（Pandey等人，2024年）。许多草药成分在发挥抗氧化作用的同时还能抑制促炎通路，如NF-κB（Li等人，2019年；Pan等人，2025年）。例如，甘草酸不仅提高了SOD和GSH的水平，还有效降低了TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度（Wang等人，2022年）。这种双重机制结合了抗氧化和抗炎作用，使中药能够更全面地阻断肝损伤的病理进程（Zhang等人，2025年）。这与我们的研究结果一致，CIRC表现出同时的抗氧化和抗炎效果。它不仅抑制了促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的转录和表达，还上调了抗炎细胞因子IL-10的转录和表达水平。随着现代研究的进步，肠道微生物群与肝脏健康之间的双向调节关系变得越来越清晰（Kanmani等人，2020年）。肠道不仅是营养物质的主要吸收场所，还是重要的免疫和代谢器官（Shen等人，2025年）。其微生物群的平衡通过多种途径影响肝脏功能（Li等人，2023年）。肠道屏障的完整性对于防止有害物质进入系统循环至关重要（Juanola等人，2024年）。通过调节肠道微生物群，中药可以增强肠道屏障功能，从而降低肠道通透性并减少循环中的LPS水平，有助于防止肝损伤的进展（Gong等人，2022年；Zeng等人，2024年）。特别是某些微生物属，如Blautia（de Mooij等人，2023年）和Oscillospiraceae UCG-005（Zhuang等人，2024年），已被证明可以保护肠道屏障的完整性。在本研究中，补充CIRC增加了这些有益肠道微生物的丰度，从而防止了雏鸡肝损伤的进一步恶化。由于药物或饮食干预导致的肠道微生物群中产生丁酸的细菌数量增加通常被视为有利的生理反应（Toribio-Mateas等人，2021年；Zhang等人，2024年）。丁酸是从肠道微生物群中提取的最重要和生物活性最强的代谢物之一，在维持肠道屏障、调节免疫微环境和保护肝脏健康方面起着关键作用（Hsu等人，2024年）。作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，丁酸在到达肝脏后可以直接作用于免疫细胞（Chriett等人，2019年），抑制促炎细胞因子如TNF-α和IL-6的表达，促进抗炎细胞因子如IL-10的产生，并诱导调节性T细胞（Tregs）的分化（Li等人，2021年）。在转录组水平上，增强丁酸盐代谢有助于抑制NF-κB通路，减轻肝脏细胞因子风暴，并调节Toll样受体信号通路，从而缓解肝脏对内毒素的过度免疫反应（Zhang等人，2022年）。值得注意的是，Blautia以其产生丁酸、抗炎和对LPS诱导的急性肝损伤的保护作用而闻名，其与血清ALT水平呈负相关（Mao等人，2023年；Geng等人，2024年）。在本研究中，LPS/ENR的联合刺激减少了雏鸡中产生丁酸的细菌（如Butyricicoccus）的数量，进一步降低了血清和肝脏组织中的丁酸水平，GSEA显示肝脏中的丁酸盐代谢受到抑制，这导致了NF-κB通路的异常激活，TNF-α、IL-1β和IL-6的表达上调，以及IL-10的表达下调，最终导致了雏鸡的肝损伤。CIRC对肠道微生物群组成具有积极的调节作用，显著增加了产生丁酸的细菌的丰度，包括Blautia，并显著恢复了血清和肝脏组织中的BA水平。升高的丁酸含量通过IL-17信号通路、Toll样受体信号通路和NF-κB信号通路进一步发挥了肝脏保护作用。结论总之，本研究表明CIRC显著预防了LPS/ENR引起的雏鸡肝损伤。其肝脏保护机制主要是通过恢复肠道中产生丁酸的细菌的丰度来实现的，这提高了血清和肝脏组织中的BA水平，并缓解了受抑制的肝脏丁酸盐代谢通路。随后，CIRC调节了IL-17、Toll样受体和NF-κB信号通路，从而减轻了炎症和氧化应激，发挥了肝脏保护作用。未引用参考文献Li等人，2023年；Wang等人，2025年；Zeng等人，2022年；Zhang等人，2024年；Zhang等人，2025年。数据可用性声明本文报道的原始序列数据已存放在国家基因组数据中心（Nucleic Acids Res 2026）的基因组序列档案（Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2025）中，由中国科学院北京基因组研究所（GSA: CRA036860, CRA034761）提供，可公开访问于https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa。作者贡献实验设计由Geyin Zhang在Hongbin Si的指导下完成。动物实验由Geyin Zhang、Zhidan Zhang和Jian Meng执行。Jian Meng、Yajing Qian、Yuxi Qin、Zhuoran Li、Shiqi Luo和Yuxin Li协助Geyin Zhang完成了所有后续实验。数据分析和手稿起草由Geyin Zhang和Zhidan Zhang完成。手稿由Jieyu Su和Sihongbin Si修订。作者声明关于本文的发表没有利益冲突。CRediT作者贡献声明Geyin Zhang：撰写——初稿、可视化、项目管理、方法学、正式分析、数据管理。Zhidan Zhang：撰写——初稿、验证、正式分析、数据管理。Jian Meng：方法学、研究、数据管理。Yajing Qian：验证、方法学。Yuxi Qin：验证、研究。Zhuoran Li：验证、正式分析。Shiqi Luo：方法学、数据管理。Yuxin Li：验证。Jieyu Su：撰写——审阅与编辑、资源。Hongbin Si：撰写——审阅与编辑、项目管理、资金获取。