基于适配体调控的转录抑制的无细胞合成生物学方法，用于实现超灵敏的凝血酶检测的电化学生物传感器

《Talanta》：Electrochemical biosensor for ultrasensitive thrombin detection based on aptamer-modulated transcriptional inhibition of cell-free synthetic biology

　　

Jing Wang|Hongfu Zeng|Ming Chen|Lifen Chen|Yue Lin|Fang Luo|Longhua Guo|Bin Qiu|Zhenyu Lin

中国福建省福州市福州大学化学学院，食品安全与生物分析科学教育部重点实验室、福建省食品安全与健康分析与检测重点实验室，350116

摘要

在这项研究中，我们开发了一种将适配体门控的无细胞合成生物学与电化学分析相结合的新策略，用于检测凝血酶（以凝血酶为模型目标）。设计了一种嵌入有目标特异性适配体的DNA模板，作为“分子开关”。目标结合会诱导适配体的构象变化，从而对T7 RNA聚合酶产生空间阻碍，进而抑制RNA报告基因的转录。转录出的RNA可以与固定在电极表面的甲基蓝（MB）标记的DNA探针杂交，导致电活性物质从电极表面移开，从而产生相对较低的电化学信号。相反，转录出的RNA量减少会导致电化学信号增强。在优化条件下，该生物传感器的线性范围为0.06 nM至6 μM，检测限（LOD）为0.032 nM（信噪比=3）。该传感器对干扰蛋白表现出优异的特异性。在20倍稀释的人血清中进行加标回收测试，回收率为95.35%至105.20%，RSD值为2.32%至4.90%，证实了其在复杂生物基质中的抗干扰能力。这种方法创新实现了对凝血酶的敏感和特异性检测，并为蛋白质目标的无细胞电化学分析提供了一种通用策略。通过替换适配体序列，该平台可以扩展到多种蛋白质，为无细胞合成生物学在生物传感和临床诊断中的应用开辟了新的途径。

引言

基于无细胞合成生物学的检测技术在检测小分子、核酸和蛋白质方面具有明显优势[[1], [2], [3]]。它们可以通过目标响应的合成遗传电路和开关元件精确触发转录过程。最终，这些过程生成的RNA分子作为报告分子[4,5]。目前，大多数报道的无细胞生物传感器采用光学信号（如比色法、荧光）作为读数方式[[6], [7], [8]]。比色法依赖于显色底物的视觉变化，操作简单，但信号量化较差，阻碍了其在精确检测中的应用[9]。荧光法能够实现高灵敏度检测，但容易受到环境光、样品背景荧光和光漂白效应的干扰[10]。

电化学检测技术具有成本可控、灵敏度高等特点[11]。这项技术结合了无细胞系统的精确生物调控能力，开发出了针对不同目标的生物传感器[12,13]。例如，通过在DNA功能化界面固定一个无细胞的支点激活遗传电路，提出了一种多重电化学传感器，可以直接同时检测多个目标[14]。在另一项研究中，通过将别构转录因子与CRISPR-Cas系统集成，设计了一种用于检测孕酮的无细胞电化学生物传感器；这种有机组合显著提高了检测过程中的选择性和灵敏度，因为转录因子和基因编辑系统的协同应用进一步增强了检测的特异性和灵敏度[15]。通过将酶偶联的磁微球引入无细胞系统，开发出了一种高灵敏度的目标分子电化学检测方法[16]。这些研究共同验证了将无细胞转录系统与电化学检测结合的巨大潜力。然而，该领域的研究仍处于初步阶段。

适配体是通过体外选择获得的单链DNA或RNA分子；它们具有独特的三维构象，能够以高特异性和亲和力识别并结合目标分子[17,18]。早期研究表明，当DNA适配体位于转录起始位点附近时，可以在目标分子存在的情况下干扰转录，导致基因表达降低。无细胞表达系统可以通过体外转录机制将适配体-目标结合的生物识别事件转化为化学信号，从而实现基因表达调控，进而实现信号指数级放大。这种能力有助于开发灵敏且选择性的无细胞生物传感器[19]。例如，通过将赭曲霉毒素A（OTA）适配体插入DNA模板中，构建了一种转录调控核糖开关，当OTA结合时，可以抑制下游报告基因儿茶酚2,3-双加氧酶的表达，从而产生可见的比色信号[20]。随后，这种模板整合的适配体被进一步应用于可编程分子电路，构建了模块化且功能多样的无细胞生物传感器，其传感过程通过荧光信号进行监测[21]。现有研究表明，基于适配体的转录开关可以将分子识别转化为可放大的转录信号。然而，据我们所知，尚未有研究报道将适配体调控的无细胞转录抑制与电化学检测相结合。

凝血酶是凝血级联反应中的关键酶，催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，在血液凝固过程中起核心作用。开发高灵敏度和特异性的凝血酶检测技术具有重要意义[22,23]。在这里，我们报道了一种通过将凝血酶特异性适配体整合到DNA转录模板中的无细胞电化学生物传感器，用于超灵敏度检测凝血酶。嵌入的适配体作为分子开关，在目标结合时调节转录。在凝血酶存在的情况下，适配体-目标结合会诱导构象变化，对T7 RNA聚合酶产生空间阻碍，从而抑制RNA报告基因的转录。相反，在目标不存在的情况下，可以高效产生RNA。生成的RNA产物进一步调节固定在金电极上的甲基蓝（MB）标记的DNA探针（MB-DNA）的空间构型，实现定量电化学信号读出。通过适配体调控的转录抑制机制将特定的生物分子识别转化为可放大的电化学信号，这种策略为蛋白质检测提供了新的方法。

章节片段

材料与设备

Tris (2-羧乙基) 磷酸氢盐（TCEP）从MedChemExpress（MCE，上海，中国）购买。6-巯基己醇（MCH）和氯化钾（KCl）从Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.（上海，中国）获得。T7 RNA聚合酶（50 U/μL）、RNase抑制剂（40 U/μL）、NTP混合物（每种25 mM，无核酸酶）、经过DEPC处理的水、20×磷酸盐缓冲液（PBS）、核糖核酸酶H（RNase H）和无机焦磷酸酶（YIPP）均从

基于无细胞表达的电化学生物传感器检测凝血酶的原理

图1展示了用于检测凝血酶的无细胞电化学生物传感器的原理。该生物传感器使用MB-DNA探针作为信号转换器。该探针通过其3′端的硫醇基团共价固定在金电极表面，5′端带有MB标签。此外，一个预先构建的无细胞转录系统提供了T7 RNA聚合酶和NTP底物，使得无需活细胞即可高效进行体外RNA合成。

结论

我们提出了一种基于适配体门控无细胞转录系统的新型电化学生物传感器，用于定量检测凝血酶。这种设计具有两个关键的分析优势：（1）凝血酶结合适配体的超高亲和力和特异性确保了精确的分子识别，有效减少了复杂基质中异源蛋白质的干扰。（2）适配体-凝血酶结合作为开关，控制无细胞系统的运行。

CRediT作者贡献声明

Jing Wang：概念构思、数据整理、初稿撰写。Hongfu Zeng：概念构思、数据整理、正式分析。Ming Chen：资金获取、方法学设计。Lifen Chen：实验研究。Yue Lin：资源协调。Fang Luo：软件开发。Longhua Guo：验证工作。Bin Qiu：项目管理。Zhenyu Lin：撰写及审稿编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本项目得到了中国国家自然科学基金（22574024）的支持。