《Talanta》：Characterization of proteoforms within α-synuclein complexes in living cells by cleavable cross-linking combined with top-down mass spectrometry
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Xue Yang|Bowen Zhong|Jing Chen|Yue Sun|Baofeng Zhao|Qun Zhao|Zhen Liang|Yukui Zhang|Yu Liang|Lihua Zhang中国科学院大连化学物理研究所国家色谱分析中心医学蛋白质组学国家重点实验室
Xue Yang|Bowen Zhong|Jing Chen|Yue Sun|Baofeng Zhao|Qun Zhao|Zhen Liang|Yukui Zhang|Yu Liang|Lihua Zhang
中国科学院大连化学物理研究所国家色谱分析中心医学蛋白质组学国家重点实验室，中国大连116023
摘要 α-突触核蛋白（α-syn）以多种蛋白质形式存在，这些形式与不同的伴侣相互作用以执行各种生物功能。因此，对α-syn复合物中的蛋白质成分进行自上而下的质谱（MS）分析对于理解其功能至关重要。然而，直接从细胞或组织裂解物中纯化α-syn复合物会导致在天然细胞环境中存在的弱或瞬时相互作用伙伴的丢失。体内交联可以在细胞裂解前固定这些天然相互作用，但对共价交联的蛋白质复合物进行自上而下的MS鉴定具有挑战性。为了克服这些限制，我们开发了一种策略，将可切割交联与自上而下的MS相结合，从而能够全面表征活细胞中α-syn复合物的蛋白质组成。具体来说，使用二硫苏糖苷酰乙氧基丙酸（DSEP）这种化学可切割交联剂，通过体内交联固定了活细胞内的天然相互作用，包括瞬时或弱的相互作用，防止在后续样品制备过程中丢失相互作用伙伴。通过对交联的α-syn复合物进行亲和富集后，通过切割DSEP来解交联这些蛋白质，以便进行自上而下的MS分析。根据我们的策略，在三个生物学重复实验中鉴定了α-syn复合物中的136种蛋白质形式，与传统的亲和纯化方法相比，α-syn复合物的蛋白质成分增加了2.26倍。此外，α-syn复合物的相互作用网络得到了重构，为每种相互作用蛋白提供了详细的蛋白质形式信息，有助于揭示更详细的生物过程分子机制。
引言 α-突触核蛋白（α-syn）及其相互作用伙伴组装成功能性复合物，在帕金森病（PD）的发病机制中起着关键作用[1]、[2]、[3]。最近的研究揭示了α-syn的广泛蛋白质形式多样性，每种蛋白质形式在PD中执行不同的功能[4]、[5]、[6]。例如，丝氨酸129位点的磷酸化（S129）增强了α-syn的寡聚化并促进了有毒聚集体的形成，而C端截短的α-syn蛋白质形式则更倾向于组装成致病性纤维[7]、[8]、[9]。此外，α-syn相互作用蛋白的蛋白质形式异质性可以进一步影响与α-syn聚集相关的病理过程。例如，全长甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH(1–335)）与全长α-syn相互作用，加速其聚集，而C端截短的GAPDH(1–269)则抑制α-syn聚集并减少路易小体的形成[10]。因此，准确表征活细胞中α-syn复合物的蛋白质组成对于进一步阐明α-syn蛋白质形式及其相互作用物的具体功能至关重要。
然而，到目前为止，α-syn复合物主要在蛋白质水平上进行了研究，使用共免疫沉淀结合自下而上的质谱（MS）、邻近标记技术，随后进行自下而上的MS[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。然而，这些方法缺乏蛋白质形式特异性信息，从而掩盖了α-syn复合物中蛋白质成分的独特作用。
目前，关于α-syn复合物蛋白质组成的研究仍然是一个巨大的挑战。原位MS已成为在生理条件下分析分离或纯化蛋白质复合物蛋白质组成的强大技术[18]、[19]、[20]。然而，直接从细胞或组织裂解物中纯化蛋白质复合物会破坏天然细胞环境。具体来说，细胞内成分的稀释、亚细胞区室的破坏以及使用洗涤剂和机械处理会导致弱或瞬时相互作用的丢失，而这些相互作用对于准确解析蛋白质复合物的动态蛋白质形式图谱至关重要[21]、[22]。
体内交联（XL）利用交联剂在活细胞中共价固定目标蛋白及其伴侣的相互作用，从而保留了弱或瞬时的相互作用[23]、[24]。传统的体内交联结合自下而上的蛋白质组学只能分析蛋白质水平的蛋白质复合物，而不能分析蛋白质形式的水平[25]。为了克服这一限制，将体内交联与自上而下的MS相结合，有望用于表征活细胞中α-syn复合物的蛋白质组成。然而，直接通过自上而下的MS表征交联的蛋白质复合物存在很大挑战。交联反应引入了共价连接和蛋白质形式的多种化学修饰，显著增加了光谱复杂性，从而阻碍了交联蛋白质复合物中蛋白质组成的鉴定。
在这项研究中，我们开发了一种策略，结合使用可切割交联与自上而下的MS（CleavXL-TDMS），实现了活细胞中α-syn复合物的蛋白质组成分析（图1）。首先，使用化学可切割交联剂二硫苏糖苷酰乙氧基丙酸（DSEP）进行体内交联，然后对交联的α-syn复合物进行亲和富集。接着，通过切割DSEP来解交联蛋白质成分，确保后续进行自上而下的蛋白质组成分析。利用这一策略，我们确定了活细胞中α-syn复合物的详细蛋白质组成。此外，基于鉴定出的蛋白质形式，重构了包含蛋白质形式信息的α-syn复合物的相互作用网络。
章节片段 实验部分 试剂和材料。 二甲基亚砜（DMSO）、尿素、二硫苏糖醇（DTT）、NH4HCO3、十二烷基硫酸钠（SDS）和DST购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。NP-40洗涤剂购自Beyotime（中国上海）。α-syn单克隆抗体、抗兔IgG、HRP连接抗体、抗兔IgG（H+L）购自cell signal technology（美国丹佛）。链霉亲和素琼脂糖、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS basic（1×）和甲酸（FA）已订购
用于蛋白质形式鉴定的化学可切割交联剂的研究 交联反应引入的共价连接和多种化学修饰增加了蛋白质形式的MS复杂性，并阻碍了它们在交联状态下的鉴定。为了解决这一挑战，考虑了化学可切割交联剂，这些交联剂可以在MS分析之前切割交联物种。大多数这类交联剂含有NHS酯反应基团，以及各种可切割基团，如二硫键等
结论 总之，我们的工作开发了一种CleavXL-TDMS策略，实现了活细胞中α-syn复合物的原位蛋白质组成分析。利用这一策略，成功表征了Biotin-TEV-α-syn-SY5Y细胞中α-syn复合物的蛋白质成分，与传统的AP方法相比，蛋白质成分的覆盖率提高了2.26倍。基于鉴定出的蛋白质形式，重构了α-syn复合物的相互作用网络，
CRediT作者贡献声明 Lihua Zhang： 撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念化。Xue Yang： 撰写 – 原稿撰写、可视化、实验研究、数据管理。Bowen Zhong： 数据管理。Jing Chen： 数据管理。Yue Sun： 数据管理。Baofeng Zhao： 资金获取。Qun Zhao： 方法学研究。Zhen Liang： 资金获取。Yukui Zhang： 资金获取、概念化。Yu Liang： 撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念化
数据可用性 http://proteomecentral.proteomexchange.org ），数据集标识符为PXD072786 [45]、[46]。
新颖性声明 我们的工作报道了一种结合使用可切割交联与自上而下的质谱（MS）的策略，用于实现活细胞中α-突触核蛋白复合物的蛋白质形式分析。首先，使用二硫苏糖苷酰乙氧基丙酸（DSEP）通过体内交联固定了活细胞内的天然相互作用，防止在后续细胞裂解和样品制备过程中丢失弱或瞬时的相互作用伙伴。然后对交联的蛋白质成分进行
利益冲突声明 作者声明他们没有可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢 本工作得到了中国国家重点研发计划 （2021YFA1302602、2025YFA1309302）、国家自然科学基金 （22393931、22574153）、大连化学物理研究所 的创新研究基金（DICP I 202450）、辽宁振兴人才计划 （XLYC2202034）以及地方科技发展 （辽宁）中央指导基金（2024JH6/100600004）的支持。
