《Analytica Chimica Acta》：Exploring Cathepsin G Inhibition by Vinyl-Based Ionic Liquids: Insights from Lab-on-Valve integrated microsequential analysis and Molecular Docking Approaches
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Fátima A.R. Mota|Inês Ribas|Zhaofu Fei|Duangnapa Kiriwan|Sérgio F. Sousa|Marieta L.C. Passos|Jo?o L.M. Santos|M.Lúcia.M.F.S. Saraiva拉古什瓦大学（L
Fátima A.R. Mota|Inês Ribas|Zhaofu Fei|Duangnapa Kiriwan|Sérgio F. Sousa|Marieta L.C. Passos|Jo?o L.M. Santos|M.Lúcia.M.F.S. Saraiva
拉古什瓦大学（LAQV），REQUIMTE部门，化学科学系，应用化学实验室，药学院，Jorge Viterbo Ferreira街228号，波尔图，4050-313，葡萄牙
摘要
组织蛋白酶G是一种丝氨酸蛋白酶，参与与慢性伤口相关的炎症和组织重塑过程。在这项研究中，开发了一种基于Lab-on-Valve集成微序分析（μSIA–LOV）系统的自动流动分析方法，用于评估组织蛋白酶G的活性以及基于乙烯基的离子液体的抑制效果。该酶促反应基于N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺的水解，产物通过405纳米处的分光光度法进行监测。
所开发的系统能够实现准确、可重复且环保的分析，并高效确定IC50值，同时减少试剂消耗、分析时间和废物产生。其微型化配置允许在受控条件下快速可靠地筛选酶抑制剂，每小时可进行6次检测。
分子对接和分子动力学模拟表明，含有极性基团或吸电子基团的离子液体表现出更强的抑制效果，这是由于在组织蛋白酶G活性位点内形成了有利的静电和π–π相互作用，从而在分子水平上揭示了离子液体与组织蛋白酶G相互作用的结构-活性关系。
这些发现表明了离子液体结构如何调节组织蛋白酶G的抑制作用，并突显了μSIA–LOV平台作为绿色高效酶抑制研究工具的潜力，具有在慢性伤口管理方面开发靶向治疗策略的潜在应用。
引言
现代医学正逐渐从基于通用方法的传统治疗转向更加个性化和靶向的治疗策略[1]。这种范式转变优先考虑识别和使用疾病特异性生物标志物，以提高诊断的准确性和治疗效果[2]、[3]。通过针对潜在的病理机制而非整体治疗疾病，基于生物标志物的疗法有望减少副作用并优化治疗效果[2]、[3]。
在慢性伤口（CW）的背景下，这种影响全球数百万人的状况中，理解和针对特定生物标志物的治疗方法有可能彻底改变护理方式。慢性伤口的特点是持续的炎症、组织重塑受损以及愈合过程紊乱，常常导致长期痛苦和高医疗成本。在众多与慢性伤口病理相关的生物标志物中，组织蛋白酶G（Cat G）因其在炎症过程和组织重塑中的作用而成为研究焦点。Cat G主要由中性粒细胞释放，具有双重作用：在慢性伤口中，它加剧慢性炎症并降解细胞外基质；而在正常水平下，它支持组织修复。在正常情况下，Cat G促进细胞外基质重塑，调节炎症信号，并激活生长因子，从而促进细胞迁移和血管生成，刺激伤口愈合。这些特性使Cat G既可作为诊断标志物，也可作为有前景的治疗靶点。在慢性伤口中局部抑制Cat G是一种新兴策略，可以减少组织降解、限制慢性炎症、保护生长因子，并帮助控制细菌定植[4]。
在这种背景下，离子液体（ILs）正被探索作为局部治疗策略的创新工具，其调节酶的特性可以用来治疗特定疾病，如慢性伤口。这种双重能力——平衡其风险和益处——使ILs成为新型药物输送系统和生物技术进步的有希望的候选者。通过精细调节其化学结构，研究人员旨在最大化治疗效益，同时最小化毒性，为医学及其他领域的更安全、更有效应用铺平道路[5]、[6]。
离子液体是由阳离子和阴离子组成的有机盐，其特征是熔点低于100°C。它们因其独特的物理性质而备受关注，但除了物理和化学优势外，离子液体在催化领域也引起了极大兴趣，特别是由于它们在酶抑制方面的潜力。离子液体对酶的抑制作用已成为研究人员关注的焦点，是评估这些化合物毒性的关键参数。研究表明，特定酶活性的抑制可以可靠地衡量离子液体的毒性，为其潜在的环境和生物影响提供了宝贵见解。然而，这种抑制能力也为治疗应用开辟了新的途径。据我们所知，目前尚无研究报道本工作中研究的离子液体对Cat G活性或其他酶的影响或毒性。此外，酶促反应的自动化和微型化也尚未被报道[7]、[8]。
在这项工作中，评估了一系列乙烯基功能化离子液体对Cat G活性的抑制潜力。为了支持这项研究，采用了基于Lab-on-Valve集成微序分析（μSIA–LOV）系统的自动化分析方法。自动化的主目标是确保反应条件的精确控制，并能够可靠地评估酶活性和抑制效果。此外，自动化还带来了诸如减少试剂消耗、降低每次分析成本和最小化废物产生等优势，符合绿色分析化学的原则[9]、[10]、[11]。
测试了一系列离子液体以评估其对Cat G活性的抑制能力：1-乙烯基-3-乙基咪唑溴化物[VEIm][Br]；1-乙烯基-3-乙基咪唑碘化物[VEIm][I]；1-乙烯基-3-乙基咪唑六氟磷酸盐[VEIm][PF6]；1-乙烯基-3-氰甲基咪唑氯化物[VCyMIm][Cl]；1-乙烯基-3-氨基甲基咪唑氯化物[VAMIm][Cl]；1-乙烯基-3-羧甲基咪唑氯化物[VCMIm][Cl]；1-乙烯基-3-甲基羧酸酯咪唑[VMCIm]；1-乙烯基-3-(乙基-2-磺酸)咪唑[VESIm]；1-乙烯基-3-(丙基-3-磺酸)咪唑[VPSIm]；1-乙烯基-3-(丁基-4-磺酸)咪唑[VBSIm]；ρ-乙烯基苄基三甲铵四氟硼酸盐[VBTMA][BF4]；ρ-乙烯基苄基三甲铵六氟磷酸盐[VBTMA][PF6]。选择乙烯基功能化离子液体是因为它们具有后续聚合和整合到生物材料基质中的潜力，这可能为慢性伤口应用的局部治疗系统的发展提供可能。
所开发的方法基于底物N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe p-硝基苯胺（N-suc-ala-ala-pro-phe-pNA）在组织蛋白酶G的催化下转化为N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe和p-硝基苯胺（pNA）。通过反应过程中产生的有色化合物pNA来评估酶活性，该化合物可以通过405纳米处的分光光度法进行定量。
总之，这项研究推动了自动分析系统的发展，用于评估组织蛋白酶G的抑制作用，并探讨了离子液体作为新型酶调节剂的潜力。这些发现旨在为慢性伤口治疗提供更高效、可持续和靶向的治疗策略。
章节摘录
试剂和溶液
人类白细胞中的组织蛋白酶G（Cat G）（目录编号C4428）、N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酸4-硝基苯胺（N-suc-ala-ala-pro-phe-pNA）（目录编号S7388）、HEPES（目录编号H7637）、氯化钠（目录编号S9888）、氢氧化钠（目录编号30620）、醋酸钠（目录编号W302406）和醋酸（目录编号33209）均由Sigma-Aldrich?（美国密苏里州圣路易斯）提供。离子液体（图1）[VEIm][Br] [12]、[VEIm][I] [13]、[VEIm][PF6] [14]、[VCyMIm][Cl] [15]
结果与讨论
开发了一种μSIA-LOV方法的概念验证，旨在自动化组织蛋白酶G的酶抑制检测，并评估一组离子液体的抑制效果。该分析方法基于组织蛋白酶G催化的反应，该反应将底物N-suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA水解为N-suc-Ala-Ala-Pro-Phe和有色产物p-硝基苯胺（pNa）。这种有色化合物通过405纳米处的分光光度法进行定量，在进行酶促反应之前
结论
本工作中开发的自动μSIA-LOV系统是朝着更可持续和智能的酶学分析平台迈出的关键一步。优化的方法能够准确且可重复地评估各种离子液体对组织蛋白酶G活性的抑制效果，提供可靠的IC50值和一致的抑制谱型。
在分子水平上，结果表明，含有极性基团或吸电子基团（如羧酸基团）的离子液体表现出更强的抑制效果
CRediT作者贡献声明
Fátima A. R. Mota：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、形式分析、概念化。Inês Ribas：方法学、研究。Zhaofu Fei：撰写——审阅与编辑、资源、方法学。Duangnapa Kiriwan：可视化、软件、数据管理。Sérgio F. Sousa：撰写——审阅与编辑、可视化、软件、数据管理。Marieta L. C. Passos：撰写——审阅与编辑、监督。Jo?o L. M. Santos：撰写——审阅与编辑、监督。M.
数据可用性
本文提供的所有数据均包含在本文的图表和补充材料（SM）中。补充材料可供查阅。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了PT国家基金（FCT/MECI，科学技术基金会和教育部、科学与创新部）通过项目UID/50006/2025 DOI 1054499/UID/50006/2025 -绿色化学技术及清洁工艺联合实验室的支持。FCT（科学技术基金会）和ESF（欧洲社会基金）通过POCH（人力资本运营计划）为Fátima A. R. Mota提供了2022.09611号博士学位资助。BD。Marieta L.
