《Animal Reproduction Science》：Magnetic nanoparticle–based sperm selection: Progress and prospects for improving semen quality and fertility in livestock
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尼尔伦杜·保罗（Nilendu Paul）|普拉迪普·纳格（Pradeep Nag）|A. 库马雷斯安（A. Kumaresan）|蒂鲁马拉·拉奥·塔卢里（Thirumala Rao Talluri）印度卡纳塔克邦班加罗尔，国家乳品研究所（National Dairy Resea
尼尔伦杜·保罗（Nilendu Paul）|普拉迪普·纳格（Pradeep Nag）|A. 库马雷斯安（A. Kumaresan）|蒂鲁马拉·拉奥·塔卢里（Thirumala Rao Talluri）
印度卡纳塔克邦班加罗尔，国家乳品研究所（National Dairy Research Institute）ICAR南部区域站，生殖生物学实验室（Theriogenology Laboratory），邮编560030
摘要
精液纳米纯化是畜牧业生殖生物技术领域的一项创新进展，提供了一种针对性强、非侵入性的精子筛选方法。传统的精液处理技术，如离心、上游法（swim-up）和密度梯度法，主要依赖于运动能力和形态等物理特性，但这些方法往往无法清除发生凋亡、顶体受损或功能受损的精子。相比之下，磁性纳米纯化技术能够根据分子表面标志物（包括磷脂酰丝氨酸、泛素、顶体糖蛋白及其他与特定状态相关的膜蛋白）选择性地去除缺陷精子。本文探讨了了解精子亚群多样性和表面生物标志物表达如何为先进的、基于生育能力的精子筛选策略奠定基础，并进一步讨论了磁性纳米颗粒的合成原理、表面功能化方法以及精液纯化的实际操作流程。比较研究表明，经过纳米纯化的精子具有更强的膜完整性、运动能力、线粒体活性和DNA质量，同时还能降低氧化应激。值得注意的是，实地试验表明，使用纳米纯化精液时，受孕率可以提高，且所需精液剂量仅为传统方法的一半。该技术的低成本、安全性和易于在野外应用的特点，使其成为人工繁殖计划中的实用选择。未来展望指出，通过特定精子表面生物标志物的结合，该技术还有潜力实现多重筛选和非侵入性的性别分离。
引言
精液处理是生殖生物技术的重要组成部分，尤其是在畜牧业繁殖和辅助生殖技术（ART）中。人工授精（AI）是牛、水牛、猪和小型反刍动物遗传改良计划的基石，能够快速将优良种质传播到大量群体中（Kumar Patel等人，2017年）。然而，AI的成功在很大程度上取决于精子的质量。传统的精子筛选方法（如上游法、离心和密度梯度分离）旨在富集运动能力正常且形态正常的精子，但在清除功能缺陷的精子方面效果不佳（Muratori等人，2019年）。这些传统方法主要依赖于运动能力、形态和密度等物理属性，而这些属性并不一定与分子的或功能的完整性相关。因此，DNA完整性受损、膜结构破坏、提前发生 capacitation（精子成熟过程）或具有凋亡标志物的精子仍可能存在于最终使用的精液中（Muratori等人，2019年；Tiptiri-Kourpeti等人，2025年）。这类精子的存在会降低受孕率并影响胚胎发育。此外，反复离心和长时间处理可能会引起氧化应激，进一步影响精子的活力和功能（Tiptiri-Kourpeti等人，2025年）。这些传统方法的局限性促使人们探索基于分子生物标志物的精子纯化技术。负面表面生物标志物（如磷脂酰丝氨酸（Karabulut等人，2022年）、泛素（Sutovsky等人，2015年）和凝集素结合糖蛋白（Paul等人，2024年）在缺陷精子上表达或暴露，可作为精子功能障碍的精确指标。这些标志物使得通过新型生物技术手段（包括基于磁性纳米颗粒的纯化方法）有针对性地去除不良精子成为可能。
磁性纳米纯化利用了经过抗体、凝集素或其他配体功能化的磁性纳米颗粒（MNPs），这些颗粒能够选择性地结合具有这些负面标志物的精子。经过孵育后，可通过磁场有效分离出结合了MNPs的精子，从而获得富含存活能力强、染色质完整、顶体完整且代谢活跃的精子（Paul等人，2022年）。与传统方法不同，纳米纯化不仅依赖于运动能力或形态，还根据直接影响生育能力的分子特征来去除精子。纳米纯化的另一个优势是其非侵入性和可扩展性，可以减少机械应力并缩短处理时间，从而保护精子的完整性。最近的研究表明，通过磁性纳米颗粒纯化的精子在体外受精和实地应用的人工授精试验中表现出更高的受精率和解冻后的恢复能力（Odhiambo等人，2014年；Ajayi等人，2026年）。这些发现对畜牧业尤为重要，因为在每次授精中使用更少的精子可以提高经济和遗传效益。
基于此背景，本文旨在总结精液纳米纯化的原理、已建立的标志物及最新进展。同时，本文还强调了其相对于传统技术的优势，探讨了可用于纯化系统的新兴生物标志物，并讨论了当前的限制和未来发展方向。通过整合分子生物学、纳米技术和生殖科学的见解，本文全面阐述了纳米纯化如何革新精子筛选策略并提升畜牧业繁殖计划的生育效果。
章节片段
精子亚群的生物学特性及其重要性
射出的精液中含有悬浮在精浆中的多种精子亚群。这些亚群在运动模式、形态特征、存活能力和功能能力上存在差异，现已被确认为每次射精中不可或缺且生物学上重要的组成部分（Keyser等人，2022年；Martínez-Pastor，2022年）。这些亚群的起源是多因素的，可能发生在睾丸中的精子发生过程或精子在体内的成熟过程中
负面表面标志物：识别及其重要性
负面精子表面标志物是表明精子存在缺陷、发生凋亡或生育能力较低的分子特征。识别和去除这些标志物对于提高精液质量至关重要，尤其是在辅助生殖技术的背景下。磁性纳米纯化技术利用与这些标志物结合的MNPs，成为一种精确且非侵入性的精子筛选方法。其中，三种关键标志物是磷脂酰丝氨酸
用于精子筛选的磁性纳米颗粒
磁性纳米纯化是一种有前景的替代传统精子纯化技术的方法，能够通过非侵入性和基于生物标志物的方式选择性地去除功能受损的精子。传统的纯化方法（如上游法和密度梯度离心）往往无法清除具有分子缺陷的精子亚群，且由于反复离心步骤可能导致精子受到氧化应激和机械损伤（Zini等人，
磁性纳米颗粒的合成
有多种合成策略可用于制备氧化铁基磁性纳米颗粒，包括物理、生物和化学方法。其中，共沉淀法因其高效、经济性和可重复性而在生殖细胞生物学中得到广泛应用（Sun等人，2014年）。该方法在碱性条件下（通常使用氨或钠）使亚铁（Fe2?）和铁（Fe3?）氯化物盐发生共沉淀
纳米纯化的机制和工作流程
尺寸在10–100纳米范围内的磁性氧化铁纳米颗粒因其在生物系统中的良好磁响应性、易于功能化以及安全性而受到广泛关注（Sun等人，2014年）。在精子纯化过程中，这些MNPs会与识别特定负面标志物的分子结合，例如用于检测磷脂酰丝氨酸的annexin V（Vasicek等人，2011年）或用于检测顶体损伤的凝集素（Paul等人
与传统技术的比较分析
精子纯化技术在去除非存活细胞、细胞碎片和污染物方面发挥了重要作用，从而提高了精液质量。诸如精子洗涤、上游法和胶体离心等方法旨在富集运动能力更强、膜完整性更高或染色质质量更好的精子亚群（Marzano等人，2020年）。
实际应用和田间效果
精液纳米纯化为精子筛选提供了一种变革性方法，尤其适用于依赖人工授精（AI）的畜牧业繁殖计划。纳米纯化的精液在体外和体内受精实验中均显示出更好的精子功能，包括更高的运动能力、更强的膜和顶体完整性以及更优的受精能力（Yousef等人，2020年；Bisla和Rautela，2021年；Rautela等人，2022年；Paul等人，2024年）。
其中一个关键优势是
结论与未来展望
基于磁性纳米颗粒的精液纯化技术正成为一种实用的、非侵入性的精子筛选方法，通过靶向磷脂酰丝氨酸、泛素和特定顶体糖蛋白等负面表面标志物，选择性地去除缺陷精子并富集具有功能能力的精子。与传统方法（如上游法和密度梯度离心）相比，该方法减少了
CRediT作者贡献声明
A. 库马雷斯安（Kumaresan）：撰写与编辑、监督、方法论设计、概念构建。蒂鲁马拉·拉奥·塔卢里（Thirumala Rao Talluri）：撰写与编辑、初稿撰写。尼尔伦杜·保罗（Nilendu Paul）：撰写与编辑、初稿撰写、概念构建。普拉迪普·纳格（Pradeep Nag）：撰写与编辑、正式分析。
资金来源
本研究是在印度农业研究委员会（ICAR）资助的“新型纳米纯化技术用于富集优质精子群体以提高奶牛生育能力并调整性别比例”项目下进行的。A. 库马雷斯安博士得到了印度农业部ICAR-National Fellow项目的支持。
