组蛋白去乳酰化作用塑造着肝细胞癌的表观遗传特征，并影响治疗方案的制定

《iLIVER》：Histone delactylation shapes epigenetic landscapes and therapeutic stratification in hepatocellular carcinoma

　　吴子杰|李希明|何志军|李炳华|徐彦超|胡伟伟|李金通|姚文兵|刘强|高向东|江涛|田洪 江苏省生物医药药物可开发性重点实验室和国家中药重点实验室，中国药科大学生命科学技术学院，南京211198，中国

摘要
背景与目的
组蛋白赖氨酸丁酰化已成为代谢与基因调控之间关键的表观遗传联系。其稳态依赖于丁酰化和去丁酰化过程。组蛋白赖氨酸去丁酰化在肝细胞癌（HCC）中的生物学和临床意义尚不明确。本研究旨在探讨组蛋白赖氨酸去丁酰化（HLDL）在肝细胞癌中的临床意义，并建立基于HLDL的分子分类以促进精准治疗。

方法
我们系统地分析了多个组学HCC队列（n > 1,700）中的HLDL情况，以建立基于HLDL的分子分类。不同的亚型通过基因组学、转录组学和免疫特征进行表征。通过药物基因组学建模预测治疗敏感性，并通过体外调节组蛋白赖氨酸丁酰化来验证结果。

结果
HLDL分类区分了两类具有不同生物学和治疗特征的亚型。低HLDL肿瘤表现出更高的基因组不稳定性、激活的致癌信号通路以及富集但具有抑制作用的免疫微环境，相应地预后较差，但对免疫检查点抑制剂、阿特珠单抗联合贝伐单抗治疗和索拉非尼治疗敏感。相比之下，高HLDL肿瘤具有代谢稳定和去丁酰化活跃的表型，对乐伐替尼和经动脉化疗栓塞反应更好。功能实验确认，降低HLDL活性会导致组蛋白赖氨酸丁酰化增加、PD-L1上调和乐伐替尼耐药性，而恢复去丁酰化可以逆转这些效应。

结论
组蛋白赖氨酸去丁酰化是HCC异质性和治疗反应的关键表观遗传决定因素。本研究中建立的基于HLDL的分类将代谢、免疫和药理特征整合到一个简洁的框架中，为精准治疗提供了新的途径，并为调节HCC中的丁酰化-去丁酰化平衡提供了潜在靶点。

1. 引言
肝细胞癌（HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一。HCC具有复杂的病理生理学特征、高度的异质性以及显著的临床结果变异性，给精准肿瘤学带来了巨大挑战。新兴研究表明，HCC的发展和进展不仅涉及基因突变和转录失调，还涉及促进肿瘤异质性的表观遗传修饰。组蛋白赖氨酸丁酰化是一种由肿瘤微环境中乳酸异常积累驱动的表观遗传修饰。该修饰首次在2019年被记录，是一种依赖乳酸的表观遗传修饰，可调节基因表达，并与肿瘤发生密切相关。组蛋白赖氨酸丁酰化是一种可逆的修饰，由“写者”（如p300）和“擦除者”（HDAC1–3）动态调控。越来越多的证据表明，组蛋白赖氨酸丁酰化参与HCC中的转录调控和肿瘤微环境的重塑。张等人报告称，缺乏具有乳酸转移酶活性的HBO1会导致H3K9丁酰化水平显著下降，并抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。组蛋白去乙酰化酶HDAC1–3已被确定为组蛋白赖氨酸去丁酰化的关键调节因子，SIRT2去乙酰化酶也被鉴定为组蛋白去丁酰化酶。多项研究表明这些去乙酰化酶在HCC中起关键作用。然而，组蛋白去丁酰化在HCC中的作用及其临床意义仍不甚清楚，特别是在分子亚型分型和个性化治疗方面的潜力尚不明确。
在本研究中，我们假设HDAC1–3相关的组蛋白去丁酰化是HCC生物学异质性和治疗结果的关键驱动因素。我们旨在通过整合多个转录组数据集，构建一个基于组蛋白赖氨酸去丁酰化（HLDL）相关基因的预后模型。我们的具体目标是将患者分为不同的分子亚组，并系统研究HLDL水平与肿瘤免疫微环境、致癌信号通路和药物敏感性之间的关系。本研究旨在为HCC的表观遗传导向的精准亚型分型提供理论依据。

2. 材料与方法
2.1. 数据来源
HCC患者的转录组数据来自GEO（基因表达组学数据库，GSE14520、GSE202069、GSE104580、GSE109211和GSE97098）、TCGA（癌症基因组图谱）、ICGC（国际癌症基因组联盟）和EGAS00001005503。对于RNA-seq数据，进行了统一处理，将其转换为每百万转录本的数值。研究的数据库包括TCGA、ICGC、GSE202069、EGAS00001005503和GSE97098。对于非标准化的微阵列数据，应用了Log2标准化。蛋白质组和临床数据来自CPTAC（临床蛋白质组肿瘤分析联盟）和CNHPP（中国人类蛋白质组计划）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE149614、GSE151530、GSE282701）也从GEO下载。所有数据的详细信息总结在补充表1中。
2.2. 差异表达基因（DEG）分析
使用‘limma’包在GSE14520数据集中识别肿瘤组和非肿瘤组之间的DEGs。调整后的p值 < 0.05和|log2FC| > 1.5被确定为临界值。通过热图显示前20个基因（下调前10个和上调前10个）。
2.3. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）
将HDAC1、HDAC2和HDAC3的表达作为WGCNA（版本1.70-3）包的临床特征。首先，我们对所有样本进行聚类并移除异常值。接下来，构建了结合特征热图的样本树状图。软阈值功率确定为softpower = 4，使用无标度拓扑拟合指数R2 > 0.85来满足无标度网络的标准（见补充图1）。使用加权邻接矩阵计算基因相似性，并进一步构建基因系统发育树。使用动态树切割算法划分基因共表达模块，设置参数minModuleSize = 50以控制最小模块大小。最后，筛选出与HDAC1、HDAC2和HDAC3表达相关性最高的模块作为后续分析的关键模块。在模块成员资格 > 0.4和基因显著性 > 0.2的阈值条件下，识别关键模块内的枢纽基因。
2.4. 预后模型构建
使用HLDL-DEGs，通过单变量和LASSO回归分析在训练数据集中获得预后基因。LASSO模型经过10折交叉验证以避免过拟合，计算出最优λ值lambda.min = 0.02309288和lambda.1se = 0.17879976。基于1标准误差标准选择lambda.1se以构建更简洁且稳健的基因签名。在最优λ值下筛选出具有非零系数的基因作为后续HLDL评分计算的核心签名基因。使用风险评分的中位数值，将HCC患者分为低风险和高风险两组。通过Kaplan–Meier曲线和接收者操作特征（ROC）曲线（1年、3年和5年）评估模型的预后可靠性。TCGA-LIHC、ICGC和GSE202069数据集被用作外部验证集。
2.5. 免疫评分、同源重组缺陷（HRD）和肿瘤内异质性（ITH）的评估
使用ESTIMATE算法估计免疫浸润。HRD评分来自已发布的资源，ITH使用DITHER算法量化。
2.6. scRNA-seq数据预处理
对于独特的分子标识符数据，使用Seurat（版本4.3.0，由纽约基因组中心的Satija实验室开发和维护）中的“NormalizeData()”函数进行基因表达值标准化，使用默认参数。每个细胞计算两个质量指标：线粒体基因的百分比和检测到的基因总数。排除了线粒体基因表达超过20%的细胞或基因数量少于200个或超过6,000个的细胞。使用CellMarker数据库中的经典标志物进行细胞注释。根据标记物表达将T细胞亚群分类为毒性细胞或耗竭细胞。
2.7. 人类细胞系和化合物
人类HCC细胞系PLC/PRF/5和Huh7在添加了10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养，温度为37°C，培养环境为5% CO2的潮湿气氛。乐伐替尼（L125518）、乳酸钠（S108838）和恩替诺肽（E125068）从Aladdin Bio-Chem Technolog（上海，中国）购买。
2.8. CCK-8实验
PLC/PRF/5和Huh7细胞接种在96孔板（每孔3000个细胞）中，在37°C、5% CO2条件下孵育48小时。使用MedChemExpress（商品编号HY-K0301，美国）的检测试剂盒（Cell Counting Kit-8）计算存活细胞数量。在450 nm处的吸光度在分光光度计（Molecular Devices，加州圣何塞，美国）上测量。每组设置四个平行重复实验。
2.9. IC50值
使用CCK-8实验计算IC50值。细胞在96孔板中过夜接种。第二天，在37°C、5% CO2条件下培养细胞48小时，使用GraphPad Prism 9.5（GraphPad Software，加州，美国）通过非线性剂量-反应曲线拟合计算IC50值。结果来自三个独立实验。
2.10. 定量逆转录酶-PCR
按照制造商的说明使用FreeZol Reagent（商品编号R711，Vazyme，南京，中国）从细胞中提取总RNA。然后按照制造商的说明使用HiScript III RT SuperMix for qPCR（商品编号R323，Vazyme）生成cDNA。按照制造商的说明使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（商品编号Q712，Vazyme）进行实时逆转录酶-PCR。目标基因的相对表达通过2-ΔΔCt方法计算；β-actin mRNA用作内参。引物序列列在补充材料中。
2.11. 西部印迹
细胞在含有1 mM PMSF（Phenylmethylsulfonyl fluoride，商品编号ST506，Beyotime Biotechnology）的RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay）裂解缓冲液中裂解。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（商品编号23,227，Thermo Scientific，美国）测量蛋白质浓度。蛋白质样品与含有2-羟基-1-乙硫醇的5 × 加载缓冲液混合。等量的蛋白质（40 μg）在12% SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）上分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜（商品编号IPVH00010，Merck Millipore，德国）上。膜在室温下用5%非脂牛奶和1 × TBST（Tris缓冲液加上Tween 20）封闭2小时。然后膜与抗组蛋白H3兔抗体（商品编号PTM-1001RM，1:1000，PTM Bio Inc.）、泛抗Kla兔抗体（商品编号PTM-1401，1:1000，PTM Bio Inc.）和Vinculin单克隆抗体（商品编号ET1705-94，1:20,000，Huabio，中国）孵育2小时。膜用1 × TBST洗涤三次，然后用HRP结合的山羊抗兔IgG多克隆抗体（商品编号HA1001，1:50,000，Huabio）作为二抗孵育2小时。使用ECL化学发光溶液（商品编号WBKLS0500，Merck Millipore，德国）可视化条带。
2.12. 统计分析
对于正态分布数据（使用Shapiro–Wilk测试）和方差同质性的数据，使用Student’s t检验；否则使用Mann–Whitney U检验。分类变量使用卡方检验或Fisher’s精确检验进行比较。通过Spearman’s等级相关性评估相关性。为了控制假发现率，对所有相关统计检验应用Benjamini-Hochberg方法。使用卡方检验或Fisher’s精确检验评估HLDL（高/低）分组与临床病理分类变量之间的统计显著性。数据使用GraphPad Prism 9.5（GraphPad Software，加州，美国）进行分析，并表示为平均值±标准差。双尾p < 0.05表示统计显著性。

3. 结果
3.1. HLDL预后模型的建立和验证
为了阐明与HLDL相关的转录组改变，我们在GSE14520队列中整合了差异表达分析和WGCNA。通过将DEGs与HDAC1–3相关模块交集，我们识别出188个HLDL相关基因（图S1A–F）。单变量Cox和LASSO回归分析确定了九个枢纽基因——ADH1B、AQP9、CD14、CDC37L1、CYP3A43、NR1I2、NR1I3、SPP2和TTR——构成了HLDL预后签名（图1A，B）。该模型有效地将患者分为高风险和低风险组，这些基因在低风险亚组中的表达更高（图1C）。训练队列中的时间依赖性ROC曲线分别为1年、3年和5年的生存率提供了0.74、0.72和0.68的AUC（图1D）。在TCGA-LIHC、ICGC-LIRI-JP和GSE202069队列中的外部验证证实了该模型的预测性能一致（图1E，G），突显了HLDL模型在独立数据集中的稳健性和泛化能力。我们应用该模型进行后续的临床相关性、分子机制和治疗意义分析。HDL评分的临床和预后相关性
在建立了一个基于HDL的可靠预后模型后，接下来我们评估了该模型在肝细胞癌（HCC）患者中的临床和预后相关性。Kaplan–Meier分析显示，HDL评分高的患者（HLDL-H）在各个队列中的总生存率显著更好（图2A–F，图S2A和B）。为了特别突出HDL分类的独特优势，排除复杂的肿瘤免疫微环境的干扰，我们对基于ESTIMATE免疫评分分为高组和低组的患者进行了预后分析。值得注意的是，虽然按ESTIMATE免疫评分分层的患者组间总生存率没有显著差异（图S2C），但按HDL亚型分类分层的两组患者则显示出显著差异（图2A，p < 0.0001）。单变量Cox分析确定了HDL评分是一个独立的预后因素（图S2D–H）。

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图2. HLDL评分与HCC队列中的生存率和临床病理特征之间的关系。(A–F) 多个HCC队列的Kaplan–Meier曲线。(G–I) HLDL亚型与临床病理参数及现有HCC分类的相关性。缩写：HLDL，组蛋白赖氨酸去乳酰化；K–M：Kaplan–Meier。

接下来，我们分析了HLDL评分与多个HCC数据集中的各种临床特征之间的相关性。较低的HDL评分与HCC恶性相关的临床参数相关，如晚期临床阶段、较大的肿瘤大小和较高的AFP水平（图2G–H，图S3A–D）。值得注意的是，我们还发现乙型肝炎病毒感染与低HDL评分之间存在显著相关性。从生物学角度来看，HDL亚型在基因组、mRNA、miRNA和蛋白质水平上表现出显著的相关性（图S3E）。与已建立的HCC分子分类相比，HDL模型需要更少的基因即可实现高度一致（图2I），[7]，[8]，[14]，[15]，[16]，[17]，这突显了HDL模型的效率和临床实用性。

3.3 HLDL亚型的多组学特征
为了进一步阐明不同HDL亚型之间预后差异的生物学基础，我们进行了多组学分析，发现了亚型之间的明显分子差异。HLDL-L肿瘤表现出更高的基因组不稳定性，表现为HRD评分增加、DNA修复相关通路的富集（图3A–B）、ITH评分（图3C）以及TP53突变频率升高（图3D）。基因集富集分析显示细胞周期、MAPK、PI3K/AKT、VEGF和Wnt信号通路的激活（图3E）。增殖标志物（MKI67、PCNA、TOP2A）的表达与HDL评分呈负相关（图3F；图S6A–B）。此外，基于多组学的通路富集结果显示HLDL-L亚型在E2F通路中显著富集（图S5A–F）。我们推测，高乳酸微环境可能通过持续激活E2F转录程序来驱动肝瘤细胞的不可控细胞周期进展和恶性增殖。跨32种肿瘤类型的泛癌分析证实了这一负相关性（图S6D），并且HLDL评分在肿瘤组织中通常较低（图3G）。总体而言，这些发现表明低HDL评分表明高增殖活性和基因组不稳定性，将去乳酰化状态与肿瘤侵袭性联系起来。

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图3. HLDL亚型之间的基因组不稳定性及通路差异。(A–C) 不同亚型的HRD评分、DNA修复相关通路富集和ITH评分。(D–E) 突变谱型和TP53改变。(F) HLDL评分与MKI67表达的相关性。(G) 肿瘤与正常组织的泛癌分析。缩写：HLDL，组蛋白赖氨酸去乳酰化；HRD：同源重组缺陷；ITH：肿瘤内异质性。

3.4 HLDL亚型的免疫特征
鉴于肿瘤增殖、基因组不稳定性和免疫调节之间的密切相互作用，接下来我们探讨了与传统HLDL亚型相关的免疫特征。免疫分析显示HLDL-L肿瘤具有更炎性但免疫抑制的微环境。ESTIMATE算法显示HLDL-L肿瘤的免疫和基质评分显著更高（图4A）。单样本GSEA显示HLDL-L肿瘤中免疫相关通路的活性增强（图4B），涉及刺激、抑制和抗原呈递的免疫调节基因上调（图4C）。HLDL评分与免疫细胞浸润（图4D）、免疫微环境耗竭的标志物（图4E）和调节性T细胞丰度（图4F）呈负相关，且HLDL-L肿瘤表现出较高的M1/M2巨噬细胞比例（图4G）。

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图4. HLDL-L和HLDL-H肿瘤之间的免疫特征差异。(A–B) 免疫和基质评分及通路富集。(C–D) 免疫调节基因表达和免疫细胞组成。(E–G) HLDL评分与免疫耗竭标志物、调节性T细胞丰度和M1/M2比例的相关性。(H–N) 单细胞转录组分析和细胞间通讯分析显示HLDL-L肿瘤中的免疫激活和检查点抑制。

跨三个不同数据集的scRNA-seq分析进一步验证了这些发现，显示HLDL-L肿瘤中T细胞浸润比例较高，同时耗竭的T细胞比例也增加（图4H–K；图S7A–C，F–H）。细胞间相互作用分析显示HLDL-L肿瘤中恶性细胞与T细胞亚群之间的通讯增强（图4L–M；图S7D和I），伴有PD-1/PD-L1信号通路的活性升高（图4N；图S7E和J）。总的来说，这些结果表明HLDL-L肿瘤具有富集的免疫环境但检查点受到抑制。

3.5 HLDL分类的治疗意义
考虑到HLDL亚型的不同免疫和分子特征，我们进一步探讨了它们对治疗反应的潜在影响。在EGAS00001005503队列中，低HLDL评分可能与阿特珠单抗单药治疗和联合抗PD-L1/抗VEGF治疗的更好反应相关（图5A–B），这与HLDL-L肿瘤中PD-1/PD-L1的激活一致。值得注意的是，联合治疗将HLDL-H患者的反应率从4%提高到29%。相反，HLDL-H肿瘤可能对TACE更敏感，而HLDL-L肿瘤可能对索拉非尼更敏感（图5C–E）。此外，在三个独立的数据集中，HLDL评分与索拉非尼和仑伐替尼的反应均呈负相关，表明HLDL-H患者可能对这些疗法更敏感（图5F–G）。这些数据表明HLDL分类可能作为治疗选择的预测生物标志物，将肿瘤的表观遗传状态与治疗反应联系起来。

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图5. 与HLDL分类相关的治疗反应。(A–B) 阿特珠单抗或阿特珠单抗加贝伐单抗的治疗反应。(C–D) TACE的治疗结果。(E) 索拉非尼的反应。(F–G) HLDL评分与索拉非尼和仑伐替尼敏感性的相关性。缩写：HLDL，组蛋白赖氨酸去乳酰化；T+A，阿特珠单抗加贝伐单抗；RECIST，实体瘤的反应评估标准；TACE，经导管动脉化学栓塞。

3.6 HLDL分类的实验验证
最后，为了实验验证HDL分类的生物学相关性，我们检查了HDL评分不同的HCC细胞系。PLC/PRF/5细胞（低HLDL评分）的组蛋白赖氨酸乳酰化水平明显高于Huh7细胞（高HLDL评分）（图6A–B）。此外，Huh7细胞对索拉非尼更敏感，且PD-L1表达较低（图6C–D）。乳酸钠处理增加了组蛋白的全面乳酰化，抑制了HDL标志性基因的表达，并上调了MKI67、PCNA、PD-L1和HLA-A（图6E–H）。此外，乳酸暴露通过上调JUN表达诱导了仑伐替尼耐药性（图6I–J）。

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图6. HLDL亚型的实验验证及组蛋白乳酰化在HCC细胞中的影响。(A–D) 亚型鉴定、组蛋白乳酰化和关键表型。(E–J) 乳酸钠对HCC细胞中组蛋白全面乳酰化、基因表达、增殖、免疫调节和仑伐替尼耐药性的影响。(K–N) Entinostat对Huh7细胞中基因表达和增殖的影响。统计分析采用未配对的学生t检验（D，G–I，N）或双因素方差分析后进行Tukey多重比较检验（F，J，L–M）。数据以均值±标准差表示（n = 3，*p < 0.05，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns：无显著性）。

为了验证HDAC的去乳酰化活性及其与HLDL标志性基因的关联，我们在Huh7细胞上使用了I类HDAC抑制剂entinostat进行实验。用entinostat处理的Huh7细胞中，Western blot分析显示整体乳酰化增加，表明I类HDAC的去乳酰化活性受到抑制，qPCR确认了HLDL标志性基因的下调（图6K–L）。CCK-8检测进一步证实，entinostat诱导的去乳酰化抑制，表现为HLDL水平下降，这与细胞增殖增强相关（图6M）。此外，用entinostat处理Huh7细胞显著上调了MKI67、PD-L1和JUN的表达，这与乳酸钠实验中的趋势一致（图6N）。这些实验证实，组蛋白乳酰化促进肿瘤细胞增殖、免疫调节和药物耐药性，验证了计算机推导出的HLDL分类。

4. 讨论
大多数现有的HCC分子分类强调基因组或临床特征，但提供的治疗指导有限。在本研究中，我们利用多组学数据确定了HCC的一种新的HLDL亚型，并探索了其临床、基因组、信号通路和免疫学特征。我们的结果表明，HLDL亚型分类可能有助于HCC的个性化医疗管理，其中HLDL-L亚型可能对索拉非尼和免疫疗法有反应，而HLDL-H亚型可能对TACE有反应。我们还发现，添加抗C抗体可以增强HLDL-H亚型对免疫疗法的反应。此外，HLDL亚型分类与HCC的分子特征之间的关联通过体外实验得到了验证。与其他系统相比，[7]，[8]，[14]，[15]，[16]，[17]，本研究建立的HLDL亚型分类框架为HCC患者的临床治疗决策提供了精确且可操作的基础（图7）。

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图7. HLDL亚型及其基于HLDL亚型的个性化治疗策略的总结。缩写：HLDL，组蛋白赖氨酸去乳酰化；Kla，组蛋白赖氨酸乳酰化；T+A，阿特珠单抗加贝伐单抗；RECIST，实体瘤的反应评估标准；TACE，经导管动脉化学栓塞。

组蛋白乳酰化的平衡受到HDAC1–3异常过表达的破坏。我们的分析表明，失调的去乳酰化改变了一组与肿瘤相关的代谢和信号通路，这与先前的报道一致。[19]，[20]，[21]，[22]。值得注意的是，虽然HDAC1–3同时具有去乙酰化和去乳酰化功能，但我们的Western blot分析（图6B）证实HLDL标志物作为乳酰化状态的特异性表型指标，验证了HLDL评分作为组蛋白去乳酰化活性的可靠替代指标。HLDL模型专注于组蛋白去乳酰化相关基因，将表观遗传调控与代谢和免疫异质性联系起来，提供了一个统一框架，可以根据肿瘤的表观遗传-代谢谱型制定个体化治疗策略。乳酸积累是代谢重编程的标志，通过损害T细胞代谢导致免疫耗竭。[23]，[24] HLDL-L肿瘤含有丰富的细胞毒性但耗竭的T细胞，且PD-1/PD-L1信号增强。这种表型可能解释了它们对免疫检查点抑制剂的更好反应，因为检查点阻断可能部分逆转乳酸诱导的抑制。相比之下，代谢更稳定的、去乳酰化活跃的HLDL-H肿瘤对TACE的反应更好。从机制上讲，这种更高的敏感性可能是由于HLDL-H肿瘤依赖氧化磷酸化和血管生成信号传导，使它们特别容易受到TACE引起的缺血应激的影响。相反，HLDL-L肿瘤对TACE疗效的降低可能是由于糖酵解应激下的缺氧耐受性。临床上值得注意的是，我们发现HLDL评分与患者对仑伐替尼和索拉非尼的耐药性之间存在显著负相关，这与先前的研究一致，表明过度乳酰化会在HCC中诱导仑伐替尼耐药性。[26] HLDL标志物有望转化为HCC患者的简化临床工具，可能通过开发标准化的9基因qRT-PCR或NanoString检测方法来实现，该方法适用于福尔马林固定石蜡包埋样本。如果这种方法得到验证，可以通过识别HLDL-L患者作为潜在的免疫检查点阻断候选者，以及HLDL-H患者作为酪氨酸激酶抑制剂（例如仑伐替尼）或TACE方案的候选者来辅助决策。总体而言，我们的发现强调了HLDL模型在连接表观遗传重塑和临床实践方面的潜力，为优化HCC的个性化治疗策略提供了坚实的框架。

尽管有这些有希望的发现，但也应认识到一些局限性。首先，我们的模型是使用公共数据库的回顾性数据构建的，可能会引入选择偏差。其次，虽然我们提供了体外验证，但需要大规模的前瞻性临床队列和进一步的体内实验来全面确认HLDL标志物的可靠性和治疗预测价值。第三，虽然我们验证了全局乳酰化变化，但需要高分辨率映射来阐明HLDL相关去乳酰化的具体染色质水平靶点。第四，JUN在所提出的“乳酸-JUN-lenvatinib耐药性”调控轴中的功能作用仍需通过深入的体外和体内功能实验进一步验证，这一调控轴的详细分子调控机制也需进一步探索和阐明。5. 结论：组蛋白去乳酸化是决定肿瘤侵袭性和治疗反应的关键表观遗传学因素。HLDL评分将代谢、基因组、免疫和药理学特征整合为一个简洁且具有临床实用性的指标。未来的前瞻性研究将进一步验证其预测价值，并探索针对肝癌（HCC）中乳酸化-去乳酸化平衡的治疗策略。

作者贡献声明：
姚文兵：监督
刘强：资源提供
高向东：监督、资源提供
江涛：监督、资源提供、实验设计
田红：撰写-审稿与编辑、数据可视化、监督、资源提供、项目管理工作、方法学设计、实验设计、概念构思
吴自杰：撰写-审稿与编辑、初稿撰写、结果验证、软件使用、实验设计、数据分析
李西明：实验设计
何志军：数据管理
李炳华：资源提供
徐彦超：资源提供
胡维维：软件使用、实验设计
李景通：结果验证

知情同意：
所有作者均已阅读并批准最终稿件，并同意提交。

*器官捐赠*：
不适用。本研究未涉及使用捐赠的人类器官或组织。

伦理声明：
由于本研究仅使用了公开可用的数据和材料，因此免除了伦理声明的必要性。

数据可用性声明：
支持本研究所有发现的数据均存在于论文及其补充材料中。

利益冲突声明：
作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响本文工作的个人关系。

*动物实验*：
不适用。本研究未进行任何动物实验。

关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明：
如果文章中使用了AI，请指明使用了哪些部分以及使用比例。以下是一个示例：在准备本文的过程中，作者使用了Kimi（Moonshot AI）工具来优化语言表达、精炼语法以及检查文本格式的一致性。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对出版物的内容负全责。

资助：
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82273840、82073754）和新疆维吾尔自治区重点研发计划（2020B03003）的支持。