利用序列嵌入技术和集成学习方法识别具有低溶血风险的抗真菌肽

《ACS Omega》：Harnessing Sequence Embedding and Ensemble Learning to Identify Antifungal Peptides with Low Hemolytic Risk

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真菌感染的日益普遍对人类健康构成了越来越大的威胁，这在一定程度上是由于抗生素的滥用以及对传统抗真菌药物的耐药性增加所致。抗真菌肽（AFPs）因其多样化的作用机制和相对较低的耐药性发展倾向而成为有前景的替代品。为了促进抗真菌肽的系统发现，我们开发了 AI4AFP。这一计算框架整合了精心策划的抗真菌肽资源与先进的机器学习方法，可以直接从肽序列预测抗真菌潜力。利用一个全面的数据集，我们构建了一个七模型集成系统，结合了多种序列编码策略（包括 ProtBERT-BFD、PC6 和 Doc2Vec）和多种学习算法（包括随机森林、支持向量机、卷积神经网络和微调的 BERT 模型）。该集成系统在独立测试集上表现出稳健的性能，准确率达到 0.94，马修斯相关系数达到 0.89，优于现有的抗真菌肽预测方法。重要的是，预测的抗真菌肽评分旨在反映其一般抗真菌潜力，而不是对特定物种的效力。针对代表性真菌病原体（包括白色念珠菌、光滑念珠菌和新形隐球菌）的实验验证表明，具有高预测抗真菌肽评分的肽表现出依赖于上下文的抗真菌活性。一些候选肽对特定物种表现出明显的抑制作用，尽管对其他物种的活性有限，这突显了抗真菌效力的内在物种依赖性，并支持了 AI4AFP 作为优先排序工具而非针对特定物种的预测器的角色。为了补充抗真菌肽的预测，我们进一步开发了一个溶血分类器，该分类器将肽序列和应用浓度作为连续输入，从而能够明确模拟溶血毒性的剂量依赖性。通过实验确定引起 10% 溶血的最小浓度（MHC10），提供了实证的安全参考，使抗真菌活性能够与浓度依赖性毒性一起进行解释。所有模型和验证结果都实现了在一个用户友好的网络服务器 AI4AFP （https://axp.iis.sinica.edu.tw/AI4AFP）上，提供了一个考虑疗效和安全性的抗真菌肽发现和优先排序平台。

引言

真菌是普遍存在的微生物，在生态系统中扮演着重要角色，其中一些可能具有传染性和致命性，威胁人类生命。全球有超过十亿人受到真菌感染的影响，主要真菌种类如曲霉菌、念珠菌和隐球菌导致了超过 1.5 亿例致命疾病。(1) 像青霉素、头孢菌素及其衍生物这样的天然产物已被成功开发成临床安全有效的抗生素，用于治疗细菌感染。(2) 相比之下，具有类似临床安全性的抗真菌药物的发现却严重滞后。由于误用和病原体的快速进化，以及可用抗真菌药物的多样性有限，抗真菌药物耐药性问题日益严重。抗真菌肽（AFPs）是一类具有抗病原真菌特性的抗菌肽（AMPs）的子集。由于其较低的宿主毒性、广泛的抗菌活性以及防止真菌产生耐药性的作用模式，AFPs 成为新抗生素的潜在替代品。(3) 通过传统方法从众多未知肽中发现有价值的抗真菌肽通常既耗时又昂贵。一种加速抗真菌药物开发并降低资源成本的有效方法是在进一步实验之前进行计算机模拟评估，以预测肽的抗真菌能力。

在过去的十年中，基于人工智能的抗真菌肽（AFP）预测在模型架构和特征工程方面迅速发展。早期的模型，如基于 SVM 的分类器，(4) 通过使用氨基酸组成和物理化学性质获得了中等性能。最近，深度学习框架如 Deep-AntiFP、(5) DeepAF、(6) 和 AFP-MFL (7) 报告了 89–94% 的测试准确率，这些框架整合了进化特征、上下文嵌入和多视图融合。iAFPs-EnC-GA (8) 集成模型和基于 BiTCN 的模型 (9) 将性能进一步提高，在独立测试中达到了 94–99% 的准确率和接近 0.98 的 AUC 值。诸如基于变换的进化特征、预训练的蛋白质语言模型和注意力引导的特征融合等创新有助于改善泛化能力。

尽管取得了这些进展，但训练数据集的质量和构建仍然是一个关键限制。许多模型依赖于标记为 AFP 的肽作为正标签，而将未标记的序列（包括其他抗菌肽（AMPs）指定为负示例。这种方法可能会导致将具有未识别抗真菌活性的肽纳入负类，引入标签偏差并影响模型的稳健性。开发更严格的数据集策划策略以解决这种模糊性对于提高未来 AFP 预测模型的准确性和可靠性至关重要。虽然最近基于人工智能的抗真菌肽预测模型通过深度学习和先进特征工程实现了高性能，但没有任何模型将溶血安全性评估系统地整合到预测框架中。(4,5,8,9) 这凸显了需要一个双模型平台来解决这一关键问题，即通过联合评估抗真菌活性和溶血风险。

近年来，基于人工智能的模型在预测功能性肽的溶血潜力方面取得了显著进展。例如，HAPPENN (10) 使用了一个具有全面特征集的神经网络分类器——氨基酸组成、二肽/三肽模式、物理化学描述符、PseAAC 和联合三元组——实现了 0.90 的 AUC-ROC。其他高级方法利用了序列派生特征，包括传统编码、(11) 基于变压器的嵌入、(12) 结构描述符、(13) 和领域特定嵌入。(14) 深度学习架构如 Hybrid Transformer-CNN、(15) HemoPI2、(16) 和 HemoDL (12) 进一步提高了预测性能。然而，这些方法的共同限制是它们仅依赖于肽序列派生特征，忽略了浓度作为预测因素。这种做法忽视了一个重要的生物学事实——溶血活性是浓度依赖的。在低浓度下安全的肽在高剂量下可能会变得具有溶血性。当前的人工智能模型尚未解决这一差距，限制了它们在治疗肽筛选中的实际应用。

为了满足上述未满足的需求，我们开发了 AI4AFP，这是一个用户友好的基于网络的工具，它整合了两个独立的集成 AI 模型来评估肽的功能性和安全性。第一个集成模型预测肽是否表现出抗真菌活性（AFP），而第二个模型独立评估其溶血潜力，帮助用户高效筛选治疗肽候选物。

AFP 活性预测模型通过三个关键步骤构建：数据策划、序列编码和模型训练。从公共 AMP 数据库（如 CAMP、(17) DRAMP、(18) YADAMP、(19) SATPdb、(20) 和 DBAASP (21)）中收集了被明确标记为“抗真菌”活性的阳性 AFP。重要的是，与早期的方法（如 Antifp (4) 和 AFPDeep (22)）不同，我们避免了使用缺乏抗真菌注释的 AMP 作为负数据，以防止可能引入标签偏差并影响模型性能。

对于序列编码，我们应用了三种互补的方法：PC6 编码，(23) 将六个物理化学性质编码到一个 2D 矩阵中；Doc2Vec，(24) 一种灵活的基于自然语言处理的向量化技术；以及 ProtBert-BFD，(25) 一个基于 BERT 的语言模型，能够捕获序列级别的语义特征。这些编码的特征被用于训练多个分类器，包括随机森林（RF）、支持向量机（SVM）和卷积神经网络（CNN）。表现最好的模型被组合成一个集成系统，从而实现了高预测准确率。

另外，我们开发了一个用于溶血风险预测的新集成模型，独特地结合了肽序列和浓度作为输入特征。该模型解决了现有工具的一个主要限制，后者通常忽略了浓度依赖的溶血效应。通过整合浓度数据，我们的溶血模型提供了一种比劳动密集型实验验证更具生物学相关性和效率的替代方法。

最终，这两个模型都被整合到 AI4AFP 网络平台中，允许用户同时评估肽的抗真菌疗效和安全性。这简化了肽药物开发的早期筛选流程，并有效利用了有限的资源。

材料与方法

数据收集与使用

我们从五个公开可用的数据库中收集了标注有抗真菌活性的肽序列：CAMP、(17) DRAMP、(18) YADAMP、(19) SATPdb、(20) 和 DBAASP。(21)。过滤掉了重复序列和包含不常见氨基酸残基（“B”、“Z”、“U”、“J”、“O”、“X”、“i”、“n”和“–”）的序列，以便符合嵌入方法的要求。考虑到 AFP 的长度分布，我们排除了长度不在 10 到 50 之间的异常序列。为了防止模型在明显相似的数据上训练，我们使用了 CD-HIT，身份阈值设为 0.95，以保留每个相似 AFP 组的代表性序列。最终，我们获得了 3,011 个作为阳性样本的 AFP（图 1）。我们还准备了相同的负数据集，以确保我们的二分类模型不会因数据不平衡而产生偏差。负数据集包括随机生成的序列和非 AMP 肽。我们随意链接了 20 种必需氨基酸以生成长度分布与阳性数据集匹配的随机序列。此外，我们从 UniProtKB/Swiss-Prot 数据库中收集了非 AFP 肽，选择了长度在 10 到 50 个氨基酸之间且不包含不常见氨基酸残基且未被标记为“抗菌”、“抗生素”或“防御素”等关键词的序列。尽管如此，我们承认这些被选为负样本的肽可能仍然表现出其他尚未发现或标注的抗微生物活性，包括潜在的抗真菌活性。其中一半是随机生成的，另一半是 UniProt 肽，构成了 3,011 个负数据点。我们将数据分为独立的测试集（20%），并使用剩余数据的 10% 在训练和超参数调优期间进行模型验证。图 S1 和 S2 显示了训练和测试数据集的长度分布图。我们构建了与阳性数据集长度分布相似的负数据集，以防止机器学习模型容易根据肽长度预测 AFP。此外，还使用了 AntiFP (4) 的 DS2 数据集作为基准数据集，以确保模型性能的公平比较。简而言之，DS2 数据集包括 1,168 个 AFP 作为阳性数据集和 1,168 个非 AMP 作为阴性数据集，平均长度约为 55 个氨基酸。

图 1. 数据收集和使用，用于构建 AI4AFP。阳性和阴性数据的数量相等，以确保我们的二分类模型在平衡的数据集上进行训练、验证和测试。

蛋白质编码方法

蛋白质编码旨在将序列肽转换为计算矩阵，这对于模型构建非常重要。理想的蛋白质编码方法应该能够呈现蛋白质特性，以便机器学习算法学习它们之间的差异。在这项研究中，我们使用并比较了两种蛋白质编码方法 Doc2Vec (26) 和 PC6。(23) Doc2Vec 是一个无监督的文档嵌入模型，将肽转换为固定长度的向量。在这里，我们将每个阳性 AFP 数据点分割成 3 个连续的氨基酸，即每 3 个连续的氨基酸被视为一个词。Doc2Vec 模型将每个肽视为一个句子，并在其训练过程中学习其特性以更新模型权重。我们使用开源的 Python NLP 库 Gensim 实现了 Doc2vec，将“vector_size”参数设置为 50，将肽序列转换为 50 维向量。另一种蛋白质编码方法是我们之前研究中开发的 PC6，(23) 它根据氨基酸的 6 个物理化学性质将肽序列转换为 2D 图像：疏水性（H1）、侧链体积（V）、等电点 pH (pl)、?COOH 基团的解离常数的对数负值（pKa）和侧链的净电荷指数（NCI）。PC6 中使用的物理化学性质是基于氨基酸的，即每个氨基酸残基都被单独考虑，而不是对每个肽的所有氨基酸进行平均。因此，PC6 具有同时考虑肽的物理化学性质和其氨基酸顺序的优势。每个肽都被填充到 50 的长度，然后转换为相应的 6 个标准化物理化学性质值，形成 50 × 6 的矩阵。ProtBert-BFD 是一个基于 BERT（双向编码器表示）架构的预训练蛋白质语言模型，专门用于从蛋白质序列中进行全面分析和特征提取。该模型在 Big Fantastic Database (BFD) 上进行训练，该数据库包含大约 21 亿个蛋白质序列。这种大规模训练使 ProtBert-BFD 能够有效地捕获复杂的序列依赖性、进化模式和功能特性，使其非常适合各种下游生物信息学任务，如蛋白质分类、结构预测和功能注释。

本研究使用随机森林（RF）、支持向量机（SVM）和深度学习方法来构建预测模型。我们采用了Scikit-learn（一个用于预测数据分析的Python包），并在训练时使用默认参数实现了随机森林（RF）和支持向量机（SVM）模型。深度学习模型则是使用TensorFlow（及其高级API Keras）开发的。该深度学习模型被构建为一个单层卷积神经网络（CNN）。CNN层从编码的肽序列中提取特征，这些特征随后被展平并传递给一个全连接神经网络。最终输出是一个介于0和1之间的概率值，通过Sigmoid激活函数进行转换。为了优化模型性能，我们微调了关键超参数，包括CNN层的数量、学习率为0.0002、丢弃率为0.5以及批量大小为256。优化后的模型架构包含一个这样的CNN层，能够有效处理肽序列数据并生成准确的预测结果。

**使用微调后的BERT模型对杀菌肽进行分类**
我们使用由ProtBert-BFD编码的蛋白质序列对BERT模型进行了微调，以用于杀菌肽的分类。数据集包含3,011个正例和3,011个负例序列，这些序列被转换为文本格式。每个序列都被分词并转换为固定长度的输入ID和注意力掩码，并填充到50个字符的长度（见图S1）。数据集被分为90%的训练集和10%的验证集，以获得相似的长度分布（见图S2），从而优化模型性能。在微调过程中，模型参数被更新一个周期，同时跟踪损失值和准确率，以提高分类精度。训练完成后，我们在验证集上评估了模型的性能，并使用10折交叉验证在测试集上生成了最终预测结果。我们计算了混淆矩阵和ROC曲线来评估模型的有效性，并确定了能够最大化性能的最优分类阈值。最后，将训练好的模型保存在一个指定的目录中，以便进一步改进。

**模型集成**
为了提高预测性能，我们实施了一种集成策略，结合了多种模型，每种模型都使用了不同的蛋白质编码方法和机器学习算法（见图2）。这一过程包括三个关键步骤：

**图2**
**图2. AI4AFP模型流程概述：**蛋白质序列使用PC6、Doc2Vec和Prot_bert_bfd进行编码。这些嵌入被机器学习模型（CNN、RF、SVM）和微调后的BERT分类器处理。预测结果通过集成学习整合，以确定杀菌肽的活性，并在我们的基于集成的溶血预测模型中检查其溶血安全性。

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1. **特征提取：**蛋白质序列使用各种方法进行编码，包括PC6、Doc2Vec和ProtBERT-BFD，将其转换为特征向量，分别表示为XPC6、XDoc2Vec和XProtBERT。这些特征捕捉了序列的多种特性：
$$\mathbf{X}_{\text{encoded}} = \mathbf{f}_{\text{encoding}}(\mathbf{S}), \quad \mathbf{S} \in \text{protein sequences}$$
其中$f_{\text{encoding}}$代表特定的编码方法。

2. **基础模型训练：**使用10折交叉验证，在这些特征上训练了多个基础分类器，如CNN、SVM、RF和微调后的BERT，以确保每个模型的稳健性能。每个基础模型的输出为：
$$\hat{y}_i(k) = h(k)(\mathbf{X}_{\text{encoded}), \quad i = 1, 2, \dots, N$$
其中$h(k)$表示第k个基础模型，$\hat{y}_i(k)$是第i个样本的预测结果。

3. **集成元学习器：**将基础模型的预测结果整合成堆叠特征，作为神经网络元学习器的输入。这个元学习器捕捉基础模型之间的关系，生成最终的集成输出：
$$\mathbf{Z} = \left[ \hat{y}_1(1), \hat{y}_2(1), \ldots, \hat{y}_K(1), \ldots, \hat{y}_{K} \right] \in \mathbf{R}^{K \times N}$$
这个堆叠矩阵$Z$被用作训练神经网络元学习器的输入。元学习器的输出为$\hat{y}_{\text{final}} = g(\mathbf{Z}; \theta)$，其中$g$是神经网络元学习器，$\theta$表示模型的参数（如权重和偏置）。在训练过程中调整这些参数以最小化误差或损失并提高模型的预测性能。元学习器捕捉基础模型之间的关系，产生最终的集成预测$\hat{y}_{\text{final}}$。

**伪代码概述**
表S1中的伪代码展示了这种堆叠集成模型，它结合了三种不同的蛋白质编码策略（PC6、Doc2Vec、ProtBERT-BFD）和多种分类器（CNN、RF、SVM、微调后的BERT），通过神经网络元学习器来提高杀菌肽的分类性能。

**溶血预测模型的实现**
我们从DBAASP数据库中获取了一个包含2,984个肽序列的数据集，这些序列的长度介于15到50个残基之间，以及它们在应用浓度下的相应溶血百分比。（21）为了提升模型的泛化能力，移除了相似度≥90%的冗余序列。每个肽序列使用PC6方法编码成350维的特征向量，其中六个物理化学性质值代表每个氨基酸。每个残基后附加一个标准化浓度值，从而得到每个氨基酸的7维表示。序列被填充到50个残基的统一长度，以确保输入大小的一致性。我们设计了五个独立的二元分类器，阈值分别设置为5%、10%、20%、30%和40%，以捕捉溶血风险的连续性，同时保持可解释性。每个模型确定给定浓度下的肽是否超过指定的溶血阈值，从而基于分类器的输出实现多层次的溶血估计。

我们实现了包括支持向量机（SVM）、随机森林（RF）、多层感知器（MLP）、k最近邻（KNN）、XGBoost和AdaBoost在内的六种机器学习算法的集成，采用软投票方法。系统地探索了不同的模型组合，以识别在不同阈值下预测溶血潜力的最稳健配置。

**模型评估指标**
我们使用准确性、精确度、敏感性、特异性和马修斯相关系数（MCC）来评估模型性能。以下是模型评估指标的公式：
- **准确性（Accuracy）：** $$\text{Accuracy} = \frac{T_P + T_N}{T_P + T_N + T_F + T_F}$$
- **精确度（Precision）：** $$\text{Precision} = \frac{T_P}{T_P + T_F}$$
- **敏感性（Sensitivity）：** $$\text{Sensitivity} = \frac{T_P}{T_P + T_N}$$
- **特异性（Specificity）：** $$\text{Specificity} = \frac{T_N}{T_N + T_F}$$
- **马修斯相关系数（MCC）：** $$\text{MCC} = \frac{\text{TP} \times \text{T_N}}{\text{TP} + \text{FP} \times \text{FN}}$$
马修斯相关系数（MCC）是一个衡量模型分类两组数据准确性的分数，它考虑了所有四种结果：正确的正类和负类预测，以及错误判决。与准确性不同，即使一个组显著大于另一个组，MCC也能提供一个公平且平衡的比较方法。

**选定肽的合成**
我们使用先前发表的GAN模型设计了新的肽，（29）然后通过我们的AFP预测模型筛选出11个具有高预测杀菌活性的肽进行合成。台湾Mission Biotech公司通过固相合成生产了纯度超过95%的肽，并提供了质谱和HPLC数据。肽以粉末形式保存在-80°C下，在使用前用无菌水溶解。

**最小抑制浓度（MICs）和最小杀菌浓度（MFC）的评估**
最小抑制浓度（MICs）根据CLSI协议M27-A3和M38-A2确定。制备接种液时，菌株在3 mL的YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）培养基中于30°C下培养过夜，然后洗涤两次并重新悬浮在蒸馏水中。使用血细胞计计算每个接种液的浓度。接着将其稀释到推荐的浓度，使用RPMI 1640培养基（10.4克RPMI 1640粉末、34.5克MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]、2%葡萄糖，调pH至7.0）。肽序列连续稀释2倍，每孔加入100 μL肽和100 μL接种液，共96孔。肽的最终浓度范围为0.125至64 μg/mL，接种液的最终浓度为1.25 × 10^3个细胞/mL。平板在35°C下孵育48小时，MIC定义为没有可见菌落的最低浓度。最小杀菌浓度（MFC）在MIC测试后确定。对于每种菌株，从0.5 MIC（阳性对照）到最高浓度（64 μg/mL）的含肽孔液分别吸取3 μL并转接到新鲜的YPD琼脂平板上。平板在30°C下孵育48小时，MFC定义为没有形成菌落的最低药物浓度。

**溶血活性评估**
为了评估肽的溶血活性，使用去纤维化羊血（Taiwan Prepared Media）进行了光谱测定。红细胞（RBCs）通过离心（4°C下3000 × g离心10分钟）分离出来，用PBS洗涤三次，并重新悬浮至最终浓度8 × 10^9个细胞/mL。将20 μL的红细胞悬液加入到180 μL的肽溶液中（肽溶液在特定浓度范围内稀释），然后在37°C下孵育30分钟不搅拌。之后将平板在300 × g下离心10分钟（Eppendorf 5810R）。上清液（100 μL）转移到新的微孔板上，使用微孔板读取器在540 nm处测量吸光度来量化血红蛋白释放量。实验重复三次，使用蒸馏水作为阳性对照（100%溶血）和PBS作为阴性对照（0%溶血）。溶血率根据以下公式计算：
$$
\text{溶血率（%）= \frac{\text{OD}_{\text{test}} - \text{OD}_{\text{negative control}}{ \text{OD}_{\text{positive control}} \times 100\%
$$
**最小溶血浓度（MHC10）**定义为相对于阳性对照导致10%溶血的最低肽浓度。

**结果与讨论**
**基于DS2数据集的模型性能**
我们使用了Antifp提供的公开DS2数据集进行训练和测试，以确保与现有预测器之间的公平比较，同时保持数据集大小的一致性。这种方法使我们能够严格评估模型架构。根据先前的研究，我们使用准确性（Acc）、敏感性（Sen）、特异性（Spe）和马修斯相关系数（MCC）来评估模型性能。表1展示了我们在DS2数据集上训练和测试的模型性能，以及Antifp、（4）AFPDeep、（22）和DeepAFP（6）的结果。（4）由于未在参考研究中报告精确度，因此未包含在比较中。

**表1. 使用DS2训练和测试数据集的AI4AFP模型与现有预测器的性能比较**
- **编码方法/AI模型** | **Acc** | **Sen** | **Spe** | **MCC**
- **PC6/RF** | 0.91 | 0.87 | 0.96 | 0.83 |
- **PC6/SVM** | 0.91 | 0.88 | 0.94 | 0.82 |
- **PC6/CNN** | 0.90 | 0.91 | 0.89 | 0.79 |
- **Doc2vec/RF** | 0.84 | 0.88 | 0.79 | 0.67 |
- **Doc2vec/SVM** | 0.83 | 0.86 | 0.82 | 0.68 |
- **Doc2vec/CNN** | 0.80 | 0.83 | 0.78 | 0.61 |
- **Prot_bert_bfd/BERT** | 0.93 | 0.90 | 0.95 | 0.85 |
- **Ensemble_seven_model** | 0.95 | 0.92 | 0.97 | 0.89 |

**现有方法**
- **混合特征（簇轮廓+物理化学性质）/DNN（Antifp, 2018）** | 0.90 | 0.91 | 0.90 | 0.81 |
- **嵌入层/CNN+LSTM（AFPDeep, 2019）** | 0.89 | 0.92 | 0.86 | 0.77 |
- **混合特征（Bert+二进制轮廓+BLOSUM62）/基于Transformer的模型+CNN-BiLSTM（DeepAFP, 2023）** | 0.96 | 0.95 | 0.97 | 0.93 |

**指标说明**
表格中的最高值用粗体表示，次高水平用粗体和下划线表示（例如，准确性的0.95和MCC的0.89）。结果表明，我们的集成模型取得了有竞争力的性能，排名在前端模型之列，证明了其在杀菌肽预测方面的有效性。在我们的基于PC6的模型中，PC6-RF获得了最高的MCC（0.83），超过了Antifp的0.81。此外，我们的基于BERT的模型（Prot_bert_bfd/BERT）表现出最强的单个模型性能，MCC为0.85。值得注意的是，我们的集成模型（Ensemble_seven_model）进一步改进了这些结果，实现了准确性（0.95）、敏感性（0.92）、特异性（0.97）和MCC（0.89）。这些发现强调了整合多种编码方法和模型的有效性，增强了预测能力。其性能接近DeepAFP，后者在DS2上获得了最佳的整体性能，准确性和MCC分别为0.96和0.93。DeepAFP是一个结合了BERT、二进制轮廓和BLOSUM62特征的混合Transformer模型，取得了最高的整体性能。这表明混合特征表示和Transformer架构可以进一步提升肽序列的预测能力。另外，我们观察到Doc2Vec编码的模型虽然特异性较高，但敏感性较低，这表明Doc2Vec模型可能需要更大的数据集进行有效预训练，而且DS2数据集可能不如我们收集的数据集充分。

**基于我们数据集的模型性能**
为了开发AI4AFP，我们使用不同的编码方法和机器学习算法在收集的数据集上训练和评估了多个模型。我们预留了10%的数据集用于测试，剩余的90%用于10折交叉验证以评估模型稳定性。模型在所有折中都表现出一致的高性能，准确性和F1分数平均值约为94%，MCC值在0.86到0.88之间，表明具有稳健和平衡的预测能力。AFPDeep没有向用户提供他们的预测器和模型，因此我们只将测试数据集提交给Antifp网站以获取他们的预测结果。我们的模型性能使用五个统计指标进行评估：准确性、精确度、敏感性、特异性和MCC。结果总结在表2中。值得注意的是，尽管在DS2数据集上的表现不佳，Doc2vec编码方法的表现超出了预期。不同模型和编码方法在收集的数据集上的预测性能

编码方法 模型 准确率 (Acc) 灵敏度 (Sen) 特异性 (Spe) Matthews相关系数 (MCC)
------------------------------------------------------
Doc2Vec+PC6+BERT 集成模型 0.94 0.95 0.94 0.95 0.89
Doc2VecRF 0.91 0.89 0.94 0.88 0.82
SVM 0.93 0.95 0.91 0.95 0.86
CNN 0.92 0.93 0.91 0.93 0.84
PC6RF 0.91 0.96 0.86 0.96 0.83
SVM 0.90 0.92 0.87 0.92 0.80
CNN 0.87 0.87 0.88 0.87 0.74
Prot_bert_bfd 0.91 0.93 0.89 0.93 0.82

Antifp (2018) DNN 0.50 0.52 0.10 0.90
DeepAFP (2023) CNN+BiLSTM 0.47 0.45 0.23 -0.05

评估指标包括准确率 (Acc)、灵敏度 (Sen)、特异性 (Spe) 和 Matthews 相关系数 (MCC)。每个指标的最高值以粗体显示，第二高的值则以粗体和下划线标出。结果显示，结合了嵌入方法（Doc2Vec、PC6 和 BERT）的集成模型在多个指标上获得了最佳的整体性能，证明了其在抗真菌肽预测中的有效性。

总结来说，CNN 和 SVM 与 Doc2vec 编码方法的组合表现优于其他组合，其 MCC 分别为 0.85 和 0.88。这两种组合在 10 折交叉验证中的平均 MCC 也为 0.85。此外，Antifp 在我们收集的数据集上的预测效果相当差，是因为它们用于训练模型的数据集是多年前收集的，缺乏足够的 AFP 来代表整个 AFP 种群。

**集成策略增强 AI4AFP 的预测能力**
由于使用不同蛋白质编码方法和机器学习算法的多个模型表现相当，选择最佳模型来开发 AI4AFP 成为了一个挑战。我们应用了集成技术来整合多个模型并提高预测性能。表 2 展示了在收集的数据集的 20% 上测试的不同模型的结果。在各个模型中，Doc2Vec-SVM 达到了最高的 MCC（0.86），其次是 PC6-RF（0.83）和 BERT（0.82）。这表明不同的编码方法可能为分类性能带来独特的优势。

我们采用了堆叠集成策略来进一步提高预测准确性，将多个模型的输出结合起来并输入到一个基于神经网络的元学习器中（图 2）。结合了 Doc2Vec、PC6 和 BERT 特征的集成模型表现最佳，实现了 0.89 的 MCC、0.94 的准确率和 0.95 的灵敏度。这一结果优于所有单个模型，突显了整合多种编码方法的有效性。

尽管 DeepAFP 在表 1 中排名最高，但在我们收集的数据集上的表现较差（MCC = -0.058，准确率 = 0.47），这表明其 CNN+BiLSTM 架构可能难以很好地泛化到原始训练数据之外。类似地，Antifp（4）模型的表现也很弱（MCC = 0.01，准确率 = 0.50），这强调了在稳健的抗微生物肽预测中需要多样化的编码策略和集成学习。DeepAFP 的泛化能力有限的一个可能原因是其负样本数据集的组成；与我们的严格方法不同，我们的方法排除了包含 AMP 相关关键词的肽，而其负样本数据集可能包含未过滤的非抗真菌肽或其他活性的 AMP，导致模型学习了非特异性特征。此外，DeepAFP 和 Antifp 是在 DS2 数据集上训练的，其中大约一半的序列长度超过 50 个氨基酸。在我们的数据集中，序列长度从 10 到 50 个氨基酸不等，这为模型训练带来了额外的挑战，并可能进一步导致这两种模型的表现不佳。相比之下，我们更严格的负样本数据集构建产生了更具区分性的模型。总体而言，我们的七模型集成实现了 0.98 的 AUC，优于其他模型，证明了集成策略的价值（图 3）。

最终的人工智能抗真菌肽（AI4AFP）系统是使用这种集成方法开发的，堆叠集成模型的伪代码在表 S1 中提供。

**图 3**
图 3. 不同特征表示和分类器之间模型性能的接收者操作特征（ROC）曲线。ROC 曲线显示了使用不同特征表示（PC6 和 Doc2Vec）和分类算法（CNN、SVM、RF 和集成）的各种模型的性能。曲线下面积（AUC）值表示分类准确性，其中 Ensemble_all 模型实现了最高的 AUC，为 0.98。

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用于溶血预测的数据集来自 DBAASP。标签取决于我们检查的阈值。例如，如果一个序列杀死了 5% 的红细胞，在 5% 的阈值下它将被标记为溶血的，否则标记为非溶血的。表 S3 中用于溶血预测的数据集包括了不同溶血百分比（0%、10%、20%、30% 和 40% 等）的阳性 and 阴性氨基酸序列的数量。

首先使用 PC6 方法对带有相关浓度数据的肽序列进行编码，该方法结合了六个物理化学性质和一个浓度特征（6+1 编码，序列长度固定为 50 个氨基酸）。这些编码的表示作为输入，用于包含多个机器学习模型的集成学习框架，包括随机森林（RF）、k-最近邻（kNN）、支持向量机（SVM）、多层感知器（MLP）和 XGBoost。集成模型在经过实验验证的溶血数据上进行训练，以预测给定肽是否会在超过某个阈值时引起溶血（图 4）。

**图 4**
图 4. 基于集成的溶血预测模型的工作流程示意图。首先使用 PC6 编码方法对肽序列及其相应的浓度数据进行转换，该方法结合了六个物理化学性质和一个浓度特征（形成 6+1 方案，序列长度标准化为 50 个氨基酸）。然后将这些编码的向量输入到由多种机器学习算法组成的集成学习框架中，包括随机森林（RF）、k-最近邻（kNN）、支持向量机（SVM）、多层感知器（MLP）和 XGBoost。该模型在经过实验验证的溶血数据上进行训练，以预测肽是否可能超过预定义的溶血阈值。预测具有低溶血潜力（≤10%）同时保持抗真菌活性的肽将被优先用于后续的湿实验室验证。

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虽然 HAPPENN（10）模型在根据实验数据对溶血肽进行分类方面做出了有价值的努力，但它仍然依赖于简化的基于阈值的二分类。根据其原始出版物，表 1 中呈现的分类标准是从 DBAASP 和 Hemolytik 数据库收集的 3,738 个肽序列及其相应的溶血活性中得出的。尽管这些阈值基于实验观察，但研究本身承认了几项限制：不同研究中的检测条件存在变异性（例如，红细胞来源、孵育时间、温度）、最小溶血浓度（MHC）的定义不一致，以及关于如何选择阈值的透明度缺乏。值得注意的是，MHC 的定义差异很大——从导致 5%、10% 或 50% 溶血的浓度到最大非溶血剂量——使得难以在所有数据中应用一致的标准。此外，将溶血行为简化为二分类不可避免地掩盖了毒性的剂量依赖性，而毒性实际上存在于一个连续谱上。

相比之下，我们的溶血预测模型是第一个明确将肽序列及其相应的浓度作为连续输入的模型，从而能够更生物学地预测溶血潜力。我们没有施加任意的阈值，而是使用实际的实验溶血百分比作为训练标签，保持了剂量与毒性之间的定量关系。这种设计使 AI4AFP 能够更好地反映现实生活中肽安全性依赖于浓度的情况。此外，这种结构允许模型灵活地支持在不同安全阈值下的分层分类（例如，5%、10%、20% 溶血），如表 S4 所示。通过结合溶血活性的机制和上下文维度，我们的模型提供了更好的可解释性、生物学相关性和在早期肽筛选和优化中的实际应用性。

尽管我们为不同的溶血水平（5%、10%、20%、30% 和 40%）训练了单独的模型，但这里仅展示了 10% 的阈值以供说明和简化。预测为非溶血（≤10%）的肽被优先考虑作为安全的抗真菌候选物进行进一步开发（图 4）。我们的集成模型（10 折交叉验证）与 HAPPENN（原始验证集）在 5% 到 40% 的溶血阈值之间的准确率和灵敏度进行了比较。我们的方法在两个指标上表现更好，所有阈值下的平均值都更高（表 S4）。

模型预测反映了抗真菌的普遍潜力，而不是物种特定的效力。为了评估所提出的 AFP 预测模型的泛化能力，代表性的高分肽针对三个系统发育和临床不同的真菌物种进行了实验测试，包括白色念珠菌 SC5314（表 3）、光滑念珠菌 CBS138（表 S5）和新生隐球菌 H99（表 S6）。在白色念珠菌的情况下，排名前 11 位的肽中有 3 个表现出可测量的抗真菌活性，这表明在对这一单一物种进行评估时出现了明显的假阳性率。我们认识到这一点，并强调该模型是作为二分类器开发的，用于估计普遍的抗真菌潜力，而不是物种特定的效力。

**表 3. 模型预测的 AFP 候选物对白色念珠菌 SC5314 的抗真菌活性**
| 肽 | AFP 预测得分 | MIC | MFC | MHC10 |
|----------------|-----------|-------------|----------------|----------------|
| GAN-pep10 | 0.97 | 64 | >64 | Y/Y |
| GAN-pep20 | 0.99 | >64 | -N/- | 25.7 |
| GAN-pep4 | 0.76 | >64 | -N/- | 12.7 |
| GAN-pep5 | 0.76 | >64 | -N/- | 34.0 |
| GAN-pep6 | 0.81 | 32 | 2 | Y/Y |
| Pep-9m_g | 0.99 | 44 | Y/Y |
| AMP_23_gag_2 | 16 | 46 | N/N | 11.6 |
| AFP_23_gag_18 | 1 | >64 | -N/- | ND |
| DamAVP_23_gag_2 | 0.99 | >64 | -Y/- | 60.6 |
| ACP_23_gag_2 | 1 | 16 | Y/Y | ND |

预测得分反映了从肽序列特征推断出的普遍抗真菌潜力，并不代表物种特定的效力。MIC 和 MFC 值表示在测试条件下的实验测量抑制活性。提供了溶血预测和实验确定的引起 10% 溶血的最小浓度（MHC10），以提供浓度依赖性的毒性背景，并未用于评估预测准确性。

**表 S3**
与模型设计一致，预测的抗真菌得分反映了普遍的抗真菌潜力，而不是物种特定的效力。因此，预测得分高的肽在不同真菌物种中表现出不同的抑制谱型，突出了抗真菌活性的上下文依赖性。值得注意的是，几种对白色念珠菌表现有限的肽对光滑念珠菌或新生隐球菌表现出明显的抑制作用，这表明对单个物种没有活性并不意味着预测错误。相反，这些结果支持了模型优先考虑具有广泛抗真菌潜力的肽的能力，这些肽的选择可能取决于真菌的生物学特性。

同时，使用结合预测和实验验证的补充策略评估了溶血风险。在每个肽-真菌组合的实验确定的 MIC 或 MFC 下评估了溶血预测，反映了浓度依赖的毒性。此外，确定引起 10% 溶血的最小浓度（MHC10）提供了经验性的安全阈值。总的来说，多物种验证表明所提出的模型作为一个通用的 AFP 优先级工具，能够筛选出具有抗真菌潜力的肽。同时，效力和毒性应该以物种和浓度依赖的方式解释，而不仅仅是预测得分的大小。

**未来方向：迈向更安全和更智能的 AFP 发现**
为了进一步提高 AI4AFP 的预测能力，未来的工作应考虑集成更先进的序列编码技术，包括新兴的蛋白质和肽大语言模型，如 ProtT5、ESM-2、peptideBERT 和 ProtGPT-2。通过增加额外的结构特征和生物学相关属性来增强模型输入，并通过仔细的负样本选择和生成新的肽候选物来扩展训练数据集，预计将大大提高模型的鲁棒性。重要的是，当前的 AI4AFP 框架被设计为一个通用的抗真菌肽（AFP）优先级工具，旨在捕捉广泛的抗真菌潜力，而不是物种特定的效力。由于抗真菌活性本质上依赖于上下文和物种，因此针对特定病原体（如白色念珠菌、光滑念珠菌或新生隐球菌）的进一步开发特定物种的分类器可能会提高预测准确性。在此框架内，可以利用迁移学习或微调策略将通用 AFP 模型适应特定真菌物种。

**湿实验室验证仍然是一个必不可少的组成部分**
湿实验室验证不仅是确认抗真菌效果的必要步骤，也是评估安全性的关键。特别是，溶血和细胞毒性检测应该以浓度依赖的方式解释，因为溶血风险受到肽序列特征和有效抗真菌浓度的共同影响。一贯的确定引起 10% 溶血的最小浓度（MHC10）提供了实用的安全参考，而不是绝对的毒性阈值，强调了在考虑抗真菌活性的同时考虑上下文的重要性。

我们目前正在开发一个增强框架，该框架将基于序列的溶血预测器与功能性的抗真菌活性分类器结合起来，以实现更全面的肽候选物评估。这个集成系统将在 AI4AFP 中实施，使用强化学习（RL）策略同时促进高抗真菌潜力和低溶血风险。通过明确优化这两个目标，该框架旨在加速发现既有效又生物上更安全的 AFP。这种基于强化学习（RL）的改进方法建立在我们之前基于GAN的肽生成研究的基础上（29），当时几种生成的抗菌肽成功地破坏了多种细菌病原体的膜，包括大肠杆菌（E. coli）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。受到这些结果的鼓舞，我们现在将这一策略扩展到针对真菌病原体的抗生素活性肽（AFP）的发现上，这些病原体包括白色念珠菌（C. albicans，SC5314）、光滑念珠菌（C. glabrata，CBS138）和新生型念珠菌（C. neoformans，H99）。通过在强化学习框架内结合通用AFP预测、物种特异性的优化以及浓度依赖的安全性评估，AI4AFP为下一代具有更好疗效和安全性特征的抗生素活性肽的合理设计提供了一条可扩展的路径。

**结论**
我们开发了AI4AFP，这是一个基于集成方法的框架，它结合了多种肽编码策略（PC6、Doc2Vec和ProtBERT-BFD）以及多种机器学习模型，在独立的验证集上实现了稳健的抗生素活性肽（AFP）预测性能。重要的是，预测的AFP分数反映了普适的抗菌潜力，而不是特定物种的效力，这与不同真菌物种间观察到的环境依赖性活性一致。为了补充疗效预测，我们引入了一个溶血分类器，该分类器通过同时考虑肽序列和应用浓度来将毒性建模为剂量依赖性属性，从而实现了超越二元分类的灵活安全性阈值。所有组件都集成在一个用户友好的Web服务器中，可以综合评估抗生素活性和溶血风险。预计未来的扩展，包括针对物种的微调以及基于强化学习的优化，将进一步加速更安全、更有效的AFP的发现。所有模型都实现在一个用户友好的Web服务器AI4AFP中（图5），从而能够全面评估抗生素活性肽的疗效和安全性。

**图5**
图5. AI4AFP Web门户的概览，用于同时预测抗生素活性和溶血安全性。(A) 用户可以以FASTA格式提交肽序列（每个序列最多50个氨基酸）或上传.txt文件。每个输入可以包含一个浓度值（例如，Conc = 16，表示16 μg/mL）用于溶血预测。可选字段如任务标题和电子邮件可用于个性化任务跟踪。(B) 对于每个提交的序列，集成模型会输出一个分类分数、AFP预测结果、溶血程度、用于评估的浓度以及该肽是否具有溶血性。这一综合结果允许同时解释抗生素活性和细胞毒性风险。(C) 预测结果通过交互式可视化（例如，显示AFP分布的饼图）和可下载文件进行总结，包括处理后的输入数据、结果报告和未识别的序列。这一功能便于结果的解释和批量分析。

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