基于水凝胶珠的检测方法，用于测量唾液中的蛋白质生物标志物

《ACS Measurement Science Au》：Hydrogel Bead-Based Assay for the Measurement of Protein Biomarkers in Saliva

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我们报告了一种基于聚乙二醇（PEG）水凝胶珠的新检测方法，该方法可以在不需要样品处理的情况下测量复杂样品（如唾液）中的蛋白质生物标志物，并且其检测限和动态范围与目前金标准方法——酶联免疫吸附测定（ELISA）相当或更优，且无需检测抗体和酶扩增。此外，与 ELISA 相比，分析时间缩短了2倍以上，工作流程也更加简单。基于 PEG 的水凝胶珠通过共价捕获预先浓缩蛋白质生物标志物，并通过分子量截留同时去除干扰蛋白，且不受盐的影响。在光化学释放过程中，捕获的蛋白质被荧光标记。释放的蛋白质与固定的抗体结合，通过测量荧光来确定其浓度。使用所报告的水凝胶珠，我们能够在约100分钟内从200微升未经处理的唾液中测量到白细胞介素6（IL6）和白细胞介素8（IL8）等蛋白质，其浓度达到皮克/毫升（pg/mL）级别。我们将这种水凝胶珠应用于测量口腔扁平苔藓（OLP）患者和健康个体的最小刺激唾液中的 IL6 和 IL8。

1. 引言
唾液是一种有前景的替代血液用于疾病诊断的液体。(1,2) 唾液采集是非侵入性的、简单的且快速的。(3) 这些优势增加了唾液在自我检测、(4) 大规模筛查、(5?7) 以及检测易感个体（例如儿童）中的应用。(8,9) 唾液含有盐分、黏蛋白、酶和蛋白质。(10) 关于使用唾液生物标志物检测慢性疾病（如口腔癌）的科学研究越来越多。(11) 例如，据报道，口腔癌前病变（OPMD）和癌症患者的唾液细胞因子（如 IL6 和 IL8）浓度高于健康个体。(12,13) 蛋白质生物标志物通常使用酶联免疫吸附测定（ELISA) 进行测量，(14) 其检测限（LODs）在皮克/毫升（pg/mL）到纳克/毫升（ng/mL）范围内。(15) 然而，ELISA 常常受到干扰物非特异性吸附到微孔板孔中的问题影响，(16) 因此需要优化的洗涤和封闭条件(17,18) 以及样品处理（例如离心、稀释、亲和捕获以去除干扰物)。(19) 此外，由于不同样品之间的干扰差异，通常需要针对每种样品类型优化实验方案。例如，为细胞培养上清液和血清/血浆中的生物标志物开发的 ELISA 试剂盒在用于唾液检测时可能会导致大于10%的实验间和实验内变异。(20) 同样，唾液粘度的变化也可能导致使用侧向和垂直流动免疫测定法时对生物标志物浓度的过高或过低估计。(21,22) 为了解决这个问题，已经提出了使用离心压力传输样品(23) 和样品预处理(24) 等方法，但这些方法会增加复杂性和仪器需求。

同样，使用纳米材料和/或水凝胶进行生物标志物测量的方法也越来越受欢迎。(25) 例如，有报道指出胶体金纳米颗粒在分析物存在下会聚集并改变颜色。(26) 然而，唾液中的干扰物可能会影响胶体纳米颗粒的聚集。(26) 水凝胶已被用作识别元件（例如抗体）的高负载固定基质(27?31)，或者作为积极参与传感过程的刺激响应材料。(32,33) 同样，水凝胶也被用作样品制备的树脂，通过亲和捕获(34) 或分子量截留（MWCO）去除高丰度干扰蛋白。(35) 作者之前已经报道了新型聚丙烯酰胺和聚乙二醇（PEG）水凝胶，可以同时实现蛋白质分析物的预先浓缩和干扰物的去除。(36,37) 蛋白质分析物的共价捕获是通过将荧光团连接到水凝胶骨架上的光解键实现的（见图1）。(36) 随着蛋白质从样品中被共价捕获，它们在水凝胶中的浓度逐渐增加，直到几乎所有的蛋白质都被水凝胶捕获。此外，由于水凝胶体积小于样品体积，蛋白质被预先浓缩。通过暴露于365纳米光下，可以释放预先浓缩的蛋白质，这会破坏荧光团与永久固定在水凝胶骨架上的光解基团之间的键。因此，如图1所示，荧光团仍然附着在蛋白质上，这意味着从水凝胶中释放的蛋白质被荧光标记。释放的蛋白质通过使用抗体包被的微孔板和荧光读数仪进行选择性捕获和测量。与聚丙烯酰胺相比，PEG水凝胶在单一样品中实现了亚纳克/毫升（sub ng/mL）级别的显著提高的检测限（LOD）和多分析物定量。(37) 此外，PEG水凝胶的分子量截留（MWCO）被调整以排除白蛋白、免疫球蛋白和其他高分子量干扰物，从而可以在未经处理的血清中测量低分子量蛋白质。(37)

图1. 使用PEG水凝胶珠进行蛋白质预先浓缩和荧光标记的示意图，同时排除体液（唾液）中的干扰物，随后从水凝胶中释放蛋白质以供抗体选择性捕获并通过荧光进行定量（预先浓缩因子，α = Vsample/Vrelease）。

这里介绍的工作是一种前所未有的报告，描述了一种具有预先浓缩、荧光标记和释放功能的水凝胶，以珠子形式制备，用于测量唾液中的蛋白质。更具体地说，这些珠子适用于测量患有口腔扁平苔藓（OLP）的个体和健康对照组的未经处理的唾液中的IL6和IL8。我们使用了最小刺激的唾液，这种唾液比受刺激的唾液具有更高的粘度、蛋白质、代谢物和微生物组含量。因此，由于样品的复杂性，最小刺激的唾液带来了显著的分析挑战。图1提供了使用水凝胶珠测量蛋白质的步骤示意图。关键步骤包括唾液采集、将唾液与水凝胶珠孵育以预先浓缩蛋白质并去除干扰物、释放荧光标记的捕获蛋白质、用抗体捕获选定的释放蛋白质以及通过荧光测量进行定量。

本工作中报告的水凝胶珠提供了皮克/毫升（pg/mL）级别的检测限（LOD），这比我们之前的工作提高了大约两个数量级。(37) 此外，本工作中使用的样品体积为200微升，而之前的工作为10毫升。(37) 这些改进非常重要，因为许多蛋白质生物标志物（包括IL6和IL8）的生理浓度在皮克/毫升（pg/mL）级别，而且200微升的最小刺激唾液样本可以在几分钟内通过简单吐入试管中收集到。(38) 我们证明60分钟的孵育时间足以将超过95%的蛋白质捕获在水凝胶珠中，同时去除唾液中的干扰物。同样，我们证明通过暴露于365纳米光下，蛋白质可以在10分钟内从水凝胶珠中释放。释放的蛋白质被荧光标记，其浓度可以通过与固定的初级抗体结合并测量荧光来确定，而无需像ELISA那样使用酶标记的二级抗体、酶底物和终止溶液。使用水凝胶珠进行蛋白质测量的总时间约为100分钟，这比常见的市售ELISA试剂盒快2倍以上。此外，使用水凝胶珠测量唾液蛋白质不需要样品处理，也不受唾液中干扰物的影响。最后，水凝胶珠可以干燥保存至少6个月，且在水凝胶珠中捕获的蛋白质比在唾液中更稳定。

2. 实验部分
2.1. 材料
四臂聚乙二醇-二苯并环辛炔（PEG-DBCO）（PSB-4071，分子量：5000 g/mol）从Creative PEGWorks购买。PEG双叠氮化物和FITC-NVOC-PEG-叠氮化物（分子量：约4105 g/mol）分别作为非活性和活性单体，按照之前报道的程序在实验室合成。(37) 更具体地说，合成了分子量为2050、6050、10050和20050 g/mol的PEG双叠氮化物。对于FITC-NVOC-PEG-叠氮化物单体，在用DCM提取后，使用分子量截留为3500 Da的SnakeSkin管（Thermo Fisher Scientific）进行3天透析，每6小时更换一次去离子水，然后冻干。磷酸盐缓冲液（PBS，J62036.K3）从Fisher Scientific购买。乙醇胺、分子量为300,000 g/mol的PEG和海藻糖从Merck购买。IL6的ELISA试剂盒（SimpleStep ab178013、ab46027和高灵敏度ab46042）从Abcam购买。IL8的ELISA试剂盒（DY208）和辅助试剂盒（DY008B）从Bio-Techne购买。

唾液是从伯明翰大学牙科医院（英国）的健康志愿者和OLP患者那里收集的，得到了当地研究伦理委员会的批准（伦理代码24/SW/0100，项目代码DRTB002.2029）。健康志愿者和OLP患者的年龄组分别为30–45岁和30–81岁。健康志愿者和OLP患者的男女比例分别为40:60和25:75。要求受试者向无菌容器中吐唾液约10分钟，以收集至少1毫升的唾液。样本收集后立即放在冰上，并分成500微升的体积。样品在使用前储存在-80°C的冷冻箱中。

2.2. PEG水凝胶珠的制备
通过将四臂PEG DBCO、PEG双叠氮化物和FITC-NVOC-PEG-叠氮化物溶解在去离子水中来制备水凝胶前体溶液。制备1毫升5%（w:v）前体溶液所需的量总结在表1中。PEG双叠氮化物与四臂PEG DBCO的摩尔比为约2:1。活性单体与总单体和交联剂的摩尔比为1:40。溶液立即使用。每个珠子是通过将4微升的水凝胶前体溶液滴在疏水表面上制成的。滴液在黑暗中放置约30分钟以促进聚合。制备好的珠子在黑暗中干燥保存，直到使用。

表1. 1毫升5%（w:v）水凝胶前体溶液的组成
化学物质 分子量（g/mol）
2050 6050 10050 20050
四臂PEG DBCO（交联剂） 27.4 14.9 10.2 5.7
PEG双叠氮化物（非活性单体） 21.1 34.3 39.2 44.0
FITC-NVOC-PEG-叠氮化物（活性单体） 1.5 0.8 0.6 0.3
H2O 1.0 1.0 1.0 1.0

2.3. 实验程序
干燥的水凝胶珠在 Nutating shaker（BCM1610，Generon）中孵育，同时进行搅拌。除非另有说明，否则使用5%（w:v）前体溶液制备的4个水凝胶珠，蛋白质溶液为溶解在PBS缓冲液中的IL6，IL6浓度为50 pg/mL，样品体积为200微升。孵育后，水凝胶珠在200微升PBS中洗涤5分钟，然后浸入50微升PBS中，并暴露于365纳米光（Relybo 30 W可充电紫外线手电筒，Amazon）10分钟，以将蛋白质从水凝胶珠中释放到缓冲液中。珠子在溶液之间手动转移。含有蛋白质的释放缓冲液被转移到涂有捕获抗体的微孔板中。30分钟后，移除释放缓冲液，并用200微升PBS缓冲液洗涤三次。然后使用CLARIOstar Plus微孔板读数仪（BMG Labtech）在490纳米的激发波长下测量微孔板的荧光光谱。使用相同的方法测量IL8的水凝胶珠。通过将100微升4微克/毫升的抗体溶液滴在微孔板上制备抗IL8包被的微孔板，并密封后过夜孵育。随后按照制造商的方案清洗和封闭微孔板以备使用。

为了进行IL6和IL8的ELISA，遵循制造商的方案。这包括将分析物溶液孵育到抗体包被的微孔板上，然后用生物素标记的检测抗体和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育，并进行中间洗涤。接着加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物溶液孵育20分钟，然后加入硫酸终止溶液。进行缓冲液洗涤，最后在450纳米处测量每个孔的吸光度。ELISA的典型时间为约225分钟，其中与检测抗体孵育的时间最长。

使用A&D Weighing SV-100粘度计测量溶液的粘度，使用Nanodrop 1000分光光度计测量280纳米处蛋白质溶液的吸光度，使用BioTek ELx800微孔板读数仪测量微孔板中溶液的吸光度。为了摇动微孔板中的溶液，使用了带有微孔板支架的涡旋混合器（S0200-230 V-UK，Labnet）。使用Motic BA310 LED显微镜成像水凝胶珠，并使用ImageJ 1.54p分析图像。图表使用SigmaPlot 10.0或OriginPro 2024绘制，插图使用Inkscape 1.4创建。

3. 结果和讨论水凝胶珠子的特性

这些水凝胶珠子是通过应变促进的叠氮-炔烃点击化学（SPAAC）反应在4臂PEG DBCO交联剂和单体之间形成的。交联剂和单体的化学结构如图2a所示。PEG双叠氮和FITC-NVOC-PEG-叠氮分别用作非活性和活性单体。与我们的先前工作相比，使用4臂PEG DBCO作为交联剂使得水凝胶可以通过无铜的点击反应形成。因此，本研究中报道的水凝胶珠子不含细胞毒性的过渡金属，这使它们适用于诸如体内捕获蛋白质生物标志物等应用，这可能在未来进行探索。在本研究中，水凝胶珠子被用于捕获体外样品中的蛋白质。蛋白质通过与水凝胶珠子中活性单体上的异硫氰酸酯反应而共价捕获在珠子中。异硫氰酸酯和胺之间的反应不会产生任何副产物。蛋白质通过FITC和NVOC之间的碳酸酯键的光解断裂从水凝胶珠子中释放出来，释放出带有荧光素的蛋白质，如图2b所示。与另一种常用的光化学可断裂键——氨基甲酸酯相比，碳酸酯具有优势，因为释放缓冲液中不需要添加有毒和致癌的半卡巴肼。

图2
(a) 用于形成水凝胶珠子的交联剂和单体的化学结构（m = 21, n = 45或136或227或454，p = 76），
(b) 显示荧光素标记蛋白质从珠子中光解释放的反应方案，
(c) 干燥后和在PBS中重新水化24小时后的珠子的显微镜图像，
(d) 水凝胶珠子的半径与PBS中重新水化时间的关系（误差条是基于10个珠子计算得出的，插图显示了在71.3分钟内每秒保存一次图像的珠子的重新水化曲线）。

通常一次制备0.5毫升的水凝胶前体溶液。SPAAC反应足够缓慢，可以将0.5毫升的水凝胶前体溶液以4微升的液滴形式分配到疏水表面上形成珠子。因此，一次大约可以形成125个珠子。我们尝试使用≤3微升的前体溶液来制备珠子，但从移液器尖端将如此小的体积转移到疏水表面上具有挑战性。因此，在本研究的剩余部分中使用了分配4微升前体溶液制备的珠子。聚合后，珠子在黑暗中干燥保存直到使用。图2c显示了干燥后的珠子和在PBS中重新水化24小时后的珠子的显微镜图像。图像经过转换为灰度并设定阈值后，使用ImageJ的粒子查找功能进行分析。干燥后的珠子和重新水化24小时后的珠子的半径分别为491 ± 27微米和1029 ± 46微米。因此，干燥后的珠子和重新水化后的珠子的半径变化分别约为5.5%和4.4%。使用液滴微流控技术可以大量制造出半径更小的珠子，并将在未来的研究中进行探讨。

接下来，我们研究了水凝胶珠子的膨胀动力学。为此，我们制备了10个珠子，将其干燥过夜，然后取显微镜图像。之后，我们将珠子浸入PBS中重新水化，并在10到1080分钟之间拍摄图像。使用ImageJ分析图像以确定其面积，从而得到直径。图2d提供了珠子的标准化直径与重新水化时间的图表，表明珠子在大约10分钟内基本完全水化。为了更详细地研究膨胀动力学，我们选择了其中一个干燥的珠子，并在PBS中重新水化，同时每秒记录一次图像，总持续时间为71.3分钟。数据被拟合为五参数双指数函数。选择双指数函数是因为，从珠子图像可以看出，珠子内部的膨胀速度比表面慢。第一个和第二个时间常数分别确定为1.7分钟和10.6分钟。

3.2. 测定方法开发

使用水凝胶珠子进行蛋白质测定是一种总量测定方法；即，该方法适用于确定样品中的蛋白质含量或已知样品体积中的蛋白质浓度。每个水凝胶珠子中的活性单体摩尔数远大于样品中的蛋白质摩尔数。这意味着可以使用以下公式确定样品中的蛋白质浓度：
$$
c_{\text{sample}} = \frac{c_{\text{release}}}{V_{\text{sample}}
$$
其中 $c_{\text{release}}$ 是释放缓冲液中的蛋白质浓度，$V_{\text{sample}}$ 和 $V_{\text{release}}$ 分别是样品和释放缓冲液的体积。由于从水凝胶珠子中释放的蛋白质带有荧光标记，因此通过让释放的蛋白质与抗体结合并随后测量荧光强度来确定 $c_{\text{release}}$。公式1表明，如果 $V_{\text{release}} < V_{\text{sample}}$，则 $c_{\text{release}}$ 可能高于 $c_{\text{sample}}$。这意味着预浓缩因子（$\alpha$）由以下公式给出：
$$
\alpha = \frac{V_{\text{sample}}{V_{\text{release}}
$$
在本研究中，$V_{\text{sample}}$ 和 $V_{\text{release}}$ 分别为200微升和50微升。因此，$\alpha$ 的值为4。使用水凝胶珠子进行蛋白质测定的关键性能参数包括测定时间、检测灵敏度、LOD（最低检测限）以及排除干扰物影响的能力。这些将在下面讨论。

3.2.1. 测定时间

测定时间由孵育时间、释放时间和结合时间决定。这些时间都是使用在PBS缓冲液中制备的50 pg/mL IL6溶液来确定的，如下所述。

孵育时间：孵育时间是干燥的水凝胶珠子应浸入样品溶液中以捕获IL6的时间。如果孵育时间较短，则捕获的IL6较少，因此释放缓冲液中的蛋白质浓度也会较低。此外，由于从水凝胶珠子中释放的IL6带有荧光标记，释放缓冲液中IL6的浓度越低，荧光强度也会越低。正如预期的那样，随着孵育时间从10分钟增加到60分钟，从水凝胶珠子中释放的IL6的荧光强度增加（见图3a）。随后，随着孵育时间的增加，荧光强度的增加不再显著，因为所有IL6都在60分钟内被捕获。图3a的插图中显示的荧光强度峰值与孵育时间的图表被拟合为指数上升至最大值，表明95%的IL6在52.5分钟内被水凝胶珠子捕获。因此，使用60分钟的孵育时间以确保水凝胶珠子捕获超过95%的蛋白质。

释放时间：释放时间由光可去除的保护基团和光可断裂键的选择决定，分别是硝基戊炔衍生物和碳酸酯（见图2b），以及365纳米光源的功率密度。与我们的先前工作相比，我们使用了更高的功率密度光源（本研究中约为2100 mW/cm2，而先前研究中约为210 mW/cm2）。如支持信息中的图S1所示，90%的蛋白质在约7.2分钟内释放，而先前研究中约为23.4分钟。因此，为了确保超过90%的蛋白质从水凝胶珠子中释放，释放时间被设定为10分钟。

结合时间：为了直接比较水凝胶珠子和ELISA的性能，我们使用了带有IL6 ELISA试剂盒的抗体包被微孔板来捕获从水凝胶珠子中释放的IL6。释放缓冲液中的IL6被允许与抗IL6包被的孔结合30分钟，然后测量荧光以量化IL6。

因此，使用水凝胶珠子测量蛋白质的总测定时间约为100分钟，包括60分钟的孵育时间、10分钟的释放时间和30分钟的结合时间。使用水凝胶珠子的总体测定时间显著低于高灵敏度ELISA（例如本研究中使用的ab46042），后者需要225分钟，但提供了相当的LOD（下面讨论）。同样，IL8 ELISA的测定时间为280分钟。

3.2.2. 检测灵敏度和LOD

检测灵敏度和LOD受珠子数量、抗体选择和样品体积（或预浓缩因子$\alpha$）等因素的影响，如图3b–d所示。这些因素的影响将在下面讨论。

珠子数量：图3b显示，随着珠子数量从2个增加到10个，释放的IL6的荧光强度增加，这是出乎意料的。这种荧光信号的增加不能归因于IL6的捕获量增加。这是因为对于200微升的50 pg/mL IL6溶液，IL6的摩尔数为480阿摩尔，远少于每个珠子中活性单体的异硫氰酸酯的摩尔数（1.5纳摩尔），因此单个珠子就足以捕获样品溶液中的所有IL6。为了解释观察到的荧光信号随珠子数量增加而增加的现象，我们假设荧光信号的增加是由于标记程度的增加。当水凝胶珠子暴露在365纳米光下时，未反应的FITC会与蛋白质中的胺反应。为了防止这种情况并“清除”未反应的FITC，可以在蛋白质释放之前用含胺的缓冲液清洗珠子。图S2和图4显示了在蛋白质释放前后，将珠子浸入PBS中并加入0.1%乙醇胺时，4个到10个珠子的荧光比较。图4表明，当珠子在释放IL6之前浸入含有0.1%乙醇胺的PBS中时，荧光与珠子数量无关。然而，当缓冲液中不含乙醇胺时，荧光随珠子数量线性增加，这证实了荧光信号的增加是由于荧光标记程度的增加。同样，图4表明可以通过改变水凝胶珠子的数量来控制IL6的标记程度。由于最多只能使用10个珠子完全浸入50微升的释放缓冲液中，因此无法使用更多的珠子。使用更多的珠子来增加标记程度可能会影响蛋白质与抗体的结合。虽然增加标记程度可以提高检测灵敏度，但可能不会提高LOD。

抗体选择：我们使用了商业ELISA试剂盒中提供的抗IL6抗体来选择性地捕获和定量从水凝胶珠子中释放的IL6。我们使用了三种类型的IL6 ELISA试剂盒：SimpleStep、普通灵敏度和高灵敏度试剂盒。如图3c(i)所示，从水凝胶中释放并与SimpleStep中的抗体结合后的IL6的荧光强度明显低于高灵敏度试剂盒中的荧光强度，这表明SimpleStep中的抗体对IL6的亲和力较低。因此，SimpleStep中提供的抗体与水凝胶珠结合后仅适用于测量ng/mL范围内的IL6。通过比较高灵敏度和正常灵敏度ELISA试剂盒中释放的IL6与抗体结合的荧光光谱，发现它们的结合亲和力存在微小差异（见图3c(ii)）。图3c(ii)中的插图提供了从水凝胶珠释放并绑定到高灵敏度和正常灵敏度ELISA试剂盒抗体的IL6的校准曲线。校准曲线的总结见表2。t检验表明，在95%的置信水平下，使用高灵敏度ELISA试剂盒中的抗体获得的检测灵敏度与使用正常灵敏度ELISA试剂盒中的抗体显著不同。此外，如表2所示，使用高灵敏度试剂盒中的抗体获得的LOD比正常灵敏度试剂盒中的抗体好约2.3倍。

总之，SimpleStep中提供的抗体不适合测量生理水平的IL6，因为它们产生的LOD在ng/mL范围内。虽然使用高灵敏度试剂盒中的抗体获得的LOD优于正常灵敏度试剂盒中的抗体，但由于高灵敏度试剂盒更容易获得，因此在本研究的其余部分使用了后者。

样本体积：随着IL6溶液体积的增加，溶液中的蛋白质含量也会增加。因此，水凝胶珠捕获的IL6量应该会随着样本体积的增加而增加。这意味着释放缓冲液中的IL6浓度和检测灵敏度预计会与样本体积成线性增长。为了研究这一点，我们准备了不同浓度的IL6溶液，并将4个珠子分别与不同体积的IL6溶液在搅拌条件下孵育60分钟。在每种情况下，IL6被释放到50 μL的缓冲液中，使用抗IL6包被的微孔板捕获，然后测量荧光光谱。不同样本体积释放的IL6溶液的荧光光谱显示在支持信息中的图S3–S5中。随后将不同样本体积下的峰值波长处的荧光与IL6浓度绘制在一起，结果图表显示在图3d中。表3总结了每个样本体积的校准曲线。表3和图3d中的插图表明，正如预期的那样，检测灵敏度随着样本体积的增加而增加。然而，检测灵敏度与样本体积之间的关系并非线性，并且似乎达到了一个饱和值。这可能是因为释放缓冲液中的IL6浓度足够高，开始使抗体饱和。此外，尽管200 μL样本体积的检测灵敏度较低，但其LOD优于500 μL和1000 μL样本体积（见表3）。因此，本研究的其余部分使用了200 μL样本体积。

3.3. 减轻干扰物的影响
唾液中蛋白质的测量可能会受到物理和化学干扰物的负面影响。例如，蛋白质测量可能受到唾液粘度的影响，唾液粘度可以在1.5 mPa·s到23 mPa·s之间变化，（42），这主要取决于大分子糖蛋白（如黏蛋白）的浓度。唾液中的主要化学干扰物包括盐类、酶和其他非生物标志物蛋白质。我们之前已经证明，使用PEG水凝胶测量蛋白质不受盐类的影响。（37）下面，我们将讨论一些方法来减轻粘度和蛋白质干扰物对使用水凝胶珠测量蛋白质的影响。

物理干扰——粘度：为了研究样本粘度的影响，我们在含有不同浓度粘度增强物质（300,000 g/mol PEG）的PBS中准备了50 pg/mL的IL6，这种物质模拟了唾液中的大分子糖蛋白。不同浓度PEG溶液的粘度总结在支持信息中的表S1中。不同浓度PEG溶液中制备的IL6的荧光光谱显示在支持信息中的图S6中。图5a显示了IL6的峰值荧光强度与PEG溶液粘度的关系。图5a表明，从粘稠溶液中捕获IL6时，蛋白质浓度被低估了。我们假设这种低估是由于溶液粘度较高，减慢了珠子的移动和蛋白质（在这种情况下是IL6）在溶液中的扩散。图5b的数据证实了这一假设，该图显示，当水凝胶珠与23 mPa·s的IL6溶液孵育18小时与2小时相比，从粘稠溶液中捕获的IL6的峰值荧光增加。

化学干扰物——蛋白质：唾液中含有黏蛋白和酶（例如淀粉酶）等蛋白质，这些蛋白质的含量非常高（分别为1.2 mg/mL（43）和0.04–0.4 mg/mL（44））。这些蛋白质可能会干扰细胞因子等蛋白质生物标志物的测量。由于细胞因子的分子量较低，而干扰蛋白质的分子量较高，因此可以通过分子量排除（MWCO）来去除干扰蛋白质。例如，IL6和IL8的分子量分别约为20,000 g/mol和8,900 g/mol，而黏蛋白和淀粉酶的分子量分别为106 g/mol和6,000 g/mol。可以设计水凝胶来排除高分子量蛋白质，同时捕获能够扩散到珠子中的蛋白质。为此，我们研究了水凝胶的总重量与体积百分比以及PEG双叠氮的分子量对不同分子量蛋白质回收率的影响。百分比排除率是（100 - 蛋白质回收率）。我们之前研究了水凝胶的总重量与体积百分比对不同分子量蛋白质回收率的影响，但当时的水凝胶是盘状的，（37）并且没有研究PEG双叠氮的分子量的影响。表征珠子的蛋白质回收率很重要，因为它们的表面积与体积比高于盘状珠子，分别为每珠2.9 mm–1和1.5 mm–1。这意味着无法扩散到珠子中的蛋白质仍然可以捕获在珠子表面，从而影响其回收率。

我们研究了不同分子量蛋白质从水凝胶珠中的回收率。为此，我们在PBS中准备了每种蛋白质的0.1 mg/mL溶液，并测量了其在280 nm处的吸光度。将四个由选定总重量与体积百分比的水凝胶制成的珠子与200 μL的每种蛋白质溶液在搅拌条件下孵育60分钟。孵育后，将珠子在PBS中洗涤5分钟，然后浸入200 μL的PBS中，并暴露于365 nm的光线下10分钟以释放蛋白质。测量了含有每种蛋白质的释放缓冲液在280 nm处的吸光度。释放缓冲液与原始蛋白质溶液的吸光度之比提供了蛋白质回收率，这些数据总结在支持信息中的表S2–S5中。图6a显示了含有2050 g/mol PEG双叠氮的水凝胶珠的百分比蛋白质回收率与蛋白质分子量的关系。图6a表明，对于5%（w:v）和10%（w:v）的水凝胶珠，蛋白质的回收率与分子量无关，且大于90%。这与水凝胶盘状珠子的情况相反，在水凝胶盘状珠子中，分子量大于60,000 g/mol的蛋白质回收率显著降低。（37）20%（w:v）、30%（w:v）和40%（w:v）水凝胶珠的数据被拟合为双参数指数衰减，以确定MWCO。MWCO定义为蛋白质回收率降至最大值的约63%时的分子量。

对于含有其他分子量PEG双叠氮的珠子也观察到了相同的趋势（即水凝胶珠中的非活性单体）。图6b显示了水凝胶的总重量与体积百分比与PEG双叠氮的分子量之间的关系。图6b表明，水凝胶的总重量与体积百分比对MWCO的影响比PEG双叠氮的分子量更强。此外，对于高总重量与体积百分比的水凝胶珠，PEG双叠氮的分子量对MWCO的影响较小。例如，当PEG双叠氮的分子量从2050 g/mol变化到20,050 g/mol时，20%（w:v）和40%（w:v）水凝胶珠的MWCO分别变化了约40%和约15%。因此，可以通过调整水凝胶的总重量与体积百分比和PEG双叠氮的分子量来排除大于分析物的分子量的干扰物。例如，含有2050 g/mol PEG双叠氮的20%（w:v）水凝胶珠的MWCO约为24,000 g/mol。这意味着这些水凝胶珠可以渗透IL6和IL8，但可以排除黏蛋白和淀粉酶。因此，使用含有2050 g/mol PEG双叠氮的20%（w:v）珠子进行了唾液IL6和IL8的测量。

3.4. 唾液中细胞因子的测量
我们使用含有2050 g/mol PEG双叠氮的20%（w:v）水凝胶珠测量了OLP个体和健康对照组唾液中的两种细胞因子IL6和IL8的浓度。首先，确定了使用水凝胶珠和ELISA测量这两种蛋白质的校准曲线。校准曲线显示在支持信息中的图S7–S10中，并在表4中总结。表4显示，使用水凝胶测量的IL6的LOD为10.1 pg/mL，是ELISA的两倍。对于IL8，水凝胶珠提供了更宽的动态范围，但LOD更高。ELISA需要50 μL的样本量，而水凝胶珠使用了200 μL的样本量。

表4. 使用水凝胶珠和ELISA测量的IL6和IL8的校准曲线总结（A和F分别是吸光度荧光强度，单位为AU，c是浓度，单位为pg/mL）
蛋白质 | 方法 | 最佳拟合线（决定系数） | 灵敏度（AU/(pg/mL） | LOD（pg/mL） | 样本体积（μL） | 动态范围（pg/mL）
------|--------------|------------------|------------------|--------------|----------------|
IL6 | 水凝胶珠 | F = 15.5 + 1.02×c (0.9984) | 1.02 ± 0.02 | 10.1 | 2000–500 | ELISA |
| | A = 0.09 + 5.53 × 10–3×c (0.9928) | 5.53 × 10–3 ± 0.20 | 21.4 | 500–500 |
IL8 | 水凝胶珠 | F = 15.0 + 0.94×c (0.9912) | 0.94 ± 0.04 | 33.3 | 2000–500 | ELISA |
| | A = 0.04 + 6.80 × 10–3×c (0.9954) | 6.80 × 10–3 ± 0.30 | 15.3 | 500–250 |

使用水凝胶珠测量的OLP和健康个体的唾液IL6和IL8浓度显示在图7中。

图7. 使用水凝胶珠测定的OLP和健康个体唾液样本中的IL6和IL8浓度（使用了未经处理的唾液样本）。

使用未经处理的唾液样本；即样本既没有稀释，也没有离心或以其他方式处理。如图7所示，OLP和健康个体的唾液中IL6的中位浓度分别为101.5 pg/mL和56.6 pg/mL。同样，使用水凝胶珠测定的OLP患者和健康个体的唾液中IL8的中位浓度分别为187.3 pg/mL和62.1 pg/mL。OLP个体的唾液中IL6和IL8浓度高于健康对照组，这与文献结果一致。（45,46）需要注意的是，由于本研究中使用的样本数量较少，这些结果应谨慎解读。然而，这项工作的目的是证明水凝胶珠可以测量唾液中的蛋白质，而不是发现或验证口腔扁平苔藓（OLP）的唾液生物标志物。接下来，我们将使用水凝胶珠测定的唾液IL6和IL8浓度与使用金标准方法ELISA测定的值进行了比较。图8a显示了使用水凝胶珠和ELISA测定的IL6浓度，图中箭头标出了两个唾液样本的IL6浓度明显超出预期范围。这表明本研究中使用的水凝胶珠没有受到唾液中的干扰物的影响，但在某些情况下，ELISA受到了干扰。为了得到图8b，排除了这两个受到干扰的样本，最佳拟合线的斜率为0.91 ± 0.08（n = 14个样本）。图8c提供了使用水凝胶珠和ELISA测定的唾液IL8浓度的类似图表，该图的最佳拟合线斜率为1.06 ± 0.05（n = 8个样本）。根据t检验，在95%的置信度下，使用水凝胶珠和ELISA测定的唾液IL6和IL8浓度存在显著差异。

我们假设使用水凝胶珠和ELISA测定的蛋白质浓度存在差异是因为ELISA受到了唾液中的干扰。为了验证这一假设，我们将唾液样本稀释10倍，然后使用ELISA测定IL6的浓度，并将测得的IL6浓度乘以稀释因子以获得原始唾液样本中的蛋白质浓度。将经10倍稀释后使用ELISA测得的IL6浓度与未经处理样本使用水凝胶珠测得的IL6浓度进行比较，结果如图S11所示，最佳拟合线的斜率为0.99 ± 0.08（n = 14个样本）。根据t检验，在95%的置信度下，使用水凝胶珠和ELISA测得的未经处理唾液中的IL6浓度没有显著差异。因此，我们得出结论，本研究中基于水凝胶珠的检测方法适用于无需样本预处理即可测量IL6和IL8等唾液蛋白质，而ELISA则需要对唾液样本进行10倍稀释。

我们设想向最终用户（例如社区健康中心）提供干燥的水凝胶珠，用于捕获唾液中的蛋白质生物标志物。因此，我们研究了水凝胶珠在干燥状态下储存的持续时间，以确定其测量蛋白质的能力是否受到影响。此外，我们还研究了捕获蛋白质后的水凝胶珠在干燥状态下送往中心实验室进行蛋白质定量分析的可行性。为此，我们研究了水凝胶珠中捕获的蛋白质的稳定性。

**水凝胶珠的储存稳定性：**使用5%（w:v）前体溶液制备了一批水凝胶珠。其中一个新制备的珠子被干燥后用于测量PBS中的IL6浓度。剩余的珠子保持干燥状态，每月取出一个珠子进行IL6测量，这一过程持续了6个月。整个研究过程中，使用的是储存在-20°C下的相同IL6 PBS储备液。不同储存时间的水凝胶珠释放的IL6荧光光谱见支持信息中的图S12。图9a显示，干燥储存长达6个月的水凝胶珠测得的IL6荧光强度没有变化，因此水凝胶珠可以在干燥状态下储存至少6个月而不影响其测量蛋白质的能力。

**水凝胶珠中捕获的蛋白质的稳定性：**在这项研究中，我们将4个由20%（w:v）前体溶液制成的水凝胶珠在100 μL唾液样本中振荡孵育60分钟。然后用水PBS洗涤珠子5分钟。首先研究了以下两种情况：（1）唾液样本中的蛋白质被珠子捕获，并将含有蛋白质的珠子储存在室温下的黑暗环境中；（2）相同的唾液样本在室温下储存。储存不同时间后测定IL6的浓度，数据总结在图9b中。图9b清楚地表明，在室温下储存的唾液中，IL6的荧光强度在6天内下降了约4%，而在水凝胶珠中捕获的IL6荧光强度在6天内仅下降了约65%。这表明，干燥状态下储存的蛋白质比在室温下的唾液中的蛋白质更稳定。

随后，我们进行了另一项研究，将含有从5个不同唾液样本中捕获的蛋白质的水凝胶珠分别浸入PBS或1 M海藻糖中振荡60分钟，然后置于室温下干燥。两种情况下的IL6浓度均进行了测定，数据总结在表5中。平均而言，在PBS中浸泡后干燥7天的水凝胶珠中储存的IL6荧光强度分别下降了约77%（唾液样本=5个）和约89%（唾液样本=5个）。根据t检验，在储存前将水凝胶珠浸入缓冲液或1 M海藻糖中处理后，IL6的荧光强度存在显著差异。因此，将含有蛋白质的水凝胶珠先浸入1 M海藻糖中再干燥，可以略微提高蛋白质的储存稳定性。

**结论：**本研究报道了通过一种基于聚乙二醇（PEG）交联剂和单体的叠氮-炔烃点击化学反应制备的水凝胶珠。活性单体包含连接到光解性碳酸酯-硝基间苯三酚基团的FITC，该基团永久性地固定在PEG水凝胶上。异硫氰酸酯基团通过表面胺基捕获蛋白质，而光解性基团使得捕获的蛋白质及其附带的荧光素能够在365 nm紫外光照射下按需释放。通过将蛋白质释放到比原始样本更小的体积中，实现了蛋白质的预浓缩。因此，这些水凝胶珠能够预浓缩并荧光标记蛋白质，从而通过结合到固定化的抗体上选择性地捕获蛋白质，随后通过荧光测量进行定量。整个检测过程（包括孵育、释放和结合时间）大约需要100分钟。检测灵敏度和检测限受到水凝胶珠数量、抗体选择和样本体积等因素的影响，这些因素在本研究中都进行了优化。通过延长孵育时间，减轻了样本粘度对蛋白质测量的影响。此外，水凝胶珠还起到了分子量截留滤器的作用，去除了高分子量干扰蛋白。通过调整水凝胶的总重量与体积比或非活性单体的分子量，可以调节珠子的分子量截留范围。

我们展示了水凝胶珠在200 μL最小刺激的口腔扁平苔藓（OLP）和健康个体的唾液样本中测量白细胞介素6（IL6）和白细胞介素8（IL8）的实用性，其浓度可达到pg/mL水平。同样，这些蛋白质也使用ELISA进行了测量。与ELISA的对比表明，水凝胶珠没有受到唾液中的干扰，并且能够处理未经处理的唾液，且检测时间更短。我们设想向最终用户提供干燥的水凝胶珠，用于预浓缩唾液中的蛋白质生物标志物并去除干扰物。之后，含有蛋白质的干燥水凝胶珠可以送往中心实验室进行分析。研究表明，水凝胶珠可以在黑暗环境中干燥储存至少6个月，并且在相同条件下，干燥储存于室温下的水凝胶珠中捕获的蛋白质比在唾液中的蛋白质更加稳定。