控制电极材料表面的核酸亲和相互作用及吸附动态，以应用于生物传感技术

《Accounts of Materials Research》：Controlling Nucleic Acid Affinity Interactions and Adsorption Dynamics on Electrode Material Surfaces for Biosensing Applications

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**概述**
核酸（NA）生物分子与电极表面材料之间的相互作用因其复杂的表面化学性质以及在电化学生物传感器开发中的广泛应用而具有极大的研究价值。通过各种表面分析技术，发现不同的NA碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶）与金电极表面的吸附亲和力各不相同。例如，仅含有腺嘌呤的寡核苷酸在金电极表面的吸附远强于其他NA碱基组成的寡核苷酸。因此，理解和操控这些NA亲和力相互作用因素使得能够在金电极表面实现特定且可控的NA吸附，从而应用于电化学生物传感，例如非硫醇化NA捕获探针的表面组装或直接将NA目标吸附到电极上进行生物传感。

在过去十年中，我们的研究重点是通过独特利用不同NA碱基与电极材料之间的吸附亲和力差异来开发多种新型NA电化学生物传感策略。本文总结了我们利用关于NA与电极材料亲和力相互作用的基本知识，开发基于吸附的电化学生物传感应用的研究项目，这些应用针对当前疾病相关的NA生物标志物类型，如DNA甲基化、微小RNA（miRNA）、融合基因mRNA（mRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）。这突显了我们在创新利用NA的物理化学性质以控制NA序列与电极材料之间相互作用方面的独特研究专长，为生物医学、临床和农业应用领域的发展做出了贡献。

在本文中，我们首先概述了影响NA吸附的不同分子间作用力（包括静电相互作用、疏水作用力、NA碱基堆叠和氢键）。随后，系统讨论了基于NA碱基亲和力相互作用的现代电化学NA生物传感应用的研究成果。具体来说，我们专注于基于NA吸附的电化学策略，以克服不同类型的DNA甲基化、miRNA、mRNA和lncRNA生物标志物在生物传感中的挑战，特别是在医疗和农业环境中应对癌症突变和入侵病原体的问题。最后，我们总结了基于高维NA结构与不同电极材料之间亲和力相互作用的现有研究，展望了这一领域电化学生物传感器的发展前景。

我们相信，本文强调利用基本的NA-电极材料吸附知识推动创新NA生物传感器技术的发展，对于促进未来实际生物传感解决方案具有重要意义。

**1. 引言**
核酸（NA）生物分子是生命的基础，提供了遗传信息的蓝图，并调控所有生命系统中的生化过程。鉴于其根本重要性，NA生物分子成为人类和农业领域众多疾病诊断应用中的主要生物传感目标。从纳米材料的角度来看，NA生物分子是由重复的化学碱基（腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）组成的纳米结构链。根据生物功能的不同，NA生物分子可以呈现为双链DNA或单链RNA，具有不同的长度和构象。然而，这些多样化的NA生物分子的基本构建单元始终是简单的腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）或尿嘧啶（U）碱基。因此，NA生物传感本质上依赖于NA碱基与表面传感器材料之间的化学性质。

NA碱基与金之间的亲和力相互作用已被广泛研究，以揭示不同NA碱基在金传感器表面吸附的机制。这些知识被用于设计具有优异分析灵敏度、特异性和速度的基于NA吸附的生物传感方法，适用于平面金或金纳米粒子表面。（1-5）此前，基于短DNA序列在金纳米粒子上的快速吸附，已经开发出了简单的比色NA生物传感器。（5,6）在这些基础研究之后，通过对单个NA碱基与金表面之间不同亲和力相互作用更深入的理解，进一步推动了生物传感器的设计。最近的研究表明，仅含有腺嘌呤的寡核苷酸在金电极表面的吸附远强于其他NA碱基组成的寡核苷酸，这一现象可以用于电化学NA生物传感。（7-9）

电化学NA生物传感器主要利用电极传感器表面将分析物NA生物分子的生物存在转化为定量电信号。（10）常用的电极材料包括金或碳，它们主要用于将分析物NA生物分子固定在电极传感表面附近，并促进电子转移以实现信号传递。通过利用NA-金亲和力相互作用，研究人员能够在电极材料上实现特定且可控的NA吸附，用于生物传感应用。传统的NA荧光生物传感方法存在局限性，如易受光漂白/自荧光影响，以及由于需要荧光标记和复杂的波长过滤读出仪器而导致检测成本和时间增加。基于NA碱基亲和力吸附的电化学生物传感可以使用微型电极实现快速信号采集，从而经济、便携且可扩展地检测未修饰电极表面的多种核酸生物标志物。利用NA亲和力相互作用进行电化学生物传感的主要优势在于能够快速、简便且经济地将NA吸附到电极材料表面，用于NA探针的自组装或直接目标NA检测。

在本文中，我们重点介绍了通过独特利用NA-电极表面吸附现象开发新的NA生物传感器方法的研究。在我们的研究项目中，我们设计了基于NA目标在电极表面吸附的电化学生物传感方法。此外，通过在高表面积的可分散磁性纳米材料上合理设计探针，我们可以磁性分离具有不同生物标志物特征的NA目标，以便在未修饰的电极表面上进行基于吸附的电化学检测。例如，吸附的负电荷NA生物分子数量越多，[Fe(CN)6]3–离子远离电极表面的库仑排斥力越大，从而产生的法拉第电流比裸电极上的信号更小。

在过去十年中，我们在分析、生物医学和农业应用领域积累了大量的基于NA吸附的生物传感研究。我们研究的独特重点在于利用NA在传统金或碳基电极材料上的基本物理吸附特性进行生物传感应用，无需对材料表面进行任何化学修饰（例如硫醇化）。虽然已有关于NA-金电极表面亲和力相互作用及其相关生物传感应用的综述（1,3,11-14），但目前尚缺乏一个全面总结NA与电极材料之间分子间作用力基础知识的综合概述，并将其应用于多样化和具有影响力的电化学生物传感领域。本文独特地整合了这些基本相互作用及其在精确检测各种NA生物标志物类型方面的转化潜力，满足了现代生物传感应用的需求。

**2. 核酸-电极吸附的分子间作用力**
NA生物分子通过与电极材料的多种分子间作用力相互作用，包括静电相互作用、疏水相互作用、π-π碱基堆叠和氢键（图1）。这些分子间作用力在不同程度上影响NA在电极材料上的吸附，具体取决于NA碱基（A、T、G、C或U）的类型。无论基于NA探针的电化学检测设计（用于捕获NA目标）还是直接NA目标吸附，NA生物分子在电极材料上的吸附对于获得可解释的生物传感信号输出至关重要。因此，深入理解驱动NA在传统电化学生物传感器表面上的亲和力吸附的各种分子间作用力对于实现特定且可控的NA吸附至关重要。尽管NA生物分子会根据电极表面的化学性质、形态和尺度表现出不同的相互作用方式，但我们在本节中总结了控制NA与金或碳基材料电极材料之间亲和力相互作用的典型分子间作用力。

**图1**
图1. 核酸碱基与电极材料亲和力的基本知识可用于开发基于吸附的电化学生物传感技术。

**2.1. 静电相互作用**
在中性pH下，NA生物分子由于主链磷酸基团的负电荷而带有高度负电荷。因此，NA生物分子与带正电荷的电极材料之间可以直接发生静电相互作用。静电相互作用在NA吸附到电极传感器表面的初始结合和定向过程中起着重要作用。例如，NA在平面金电极（最常见的电极材料之一）上的吸附已被广泛研究，普遍认为腺嘌呤（A）对金的亲和力最强。（4,15-18）由于静电作用的存在，NA生物分子之间的电荷排斥以及NA生物分子与金表面之间的电荷排斥可以通过降低pH值（使A和C质子化）或添加盐来减弱。使用金纳米粒子进行的这项研究也发现，这种NA碱基吸附过程受静电作用控制，亲和力顺序通常为A > C ? G > T > U。（18-21）定量研究表明，由15个连续腺嘌呤碱基组成的聚腺嘌呤（poly-A15）序列可以在15分钟内快速吸附到金电极上并产生电化学信号变化。相比之下，聚胸腺嘧啶（poly-T15）或聚鸟嘌呤（poly-G15）即使在孵育数小时后也完全没有信号变化。（18）

特别是，腺嘌呤对金电极的强亲和力在电化学NA生物传感开发中得到了广泛应用。Li及其同事开发了纳米平衡聚腺嘌呤发夹探针（polyA-HP），这些探针基于中心聚腺嘌呤片段与金电极材料之间的强亲和力有效组装在金电极表面。（7）通过在polyA-HP末端设计发夹结构，显著提高了对不匹配NA目标序列的分析选择性和特异性。Tong等人还开发了一种电化学生物传感器，该传感器利用经过金纳米粒子改性的电极表面和自组装的聚腺嘌呤适配体结构来实现信号变化。（8）这种电化学生物传感器在复杂生物样本中表现出高稳定性和抗干扰能力。最近，Jiang及其同事提出了一种可编程电化学发光生物传感器，该传感器采用聚腺嘌呤三嵌段探针结构，在金电极上定位两条部分互补的链。（22）两条链之间的侧向间距被精确设计以调节目标NA的结合。

**2.2. π-π碱基堆叠**
NA碱基堆叠指的是相邻NA碱基的芳香环之间的吸引性静电和疏水相互作用，这对NA的整体结构稳定性和紧凑性至关重要。在电解质溶液的水环境中，NA生物分子的非极性区域与疏水电极表面之间可以发生疏水相互作用。化学上，NA碱基（A、T、G、C或U）含有非极性芳香环，它们倾向于相互结合以减少与水的接触，从而增加整体的疏水性。疏水相互作用还可以通过较长NA链上的多价相互作用进一步增强。虽然不是主导的分子间作用力，但疏水相互作用可以通过促进NA碱基堆叠来帮助NA在电极材料上的吸附。

当NA碱基（A、T、G、C或U）的芳香环是平面的，并且每个环上的π电子是离域的时，会在平面上方和下方产生部分负电荷（即电子云）。当NA碱基的芳香环通过疏水相互作用紧密堆叠在一起（大约3.4 ?）时，π电子云的重叠导致NA结构通过π-π碱基堆叠而稳定。有趣的是，这些π-π堆叠相互作用在整体NA结构稳定性中的强度取决于所涉及的NA碱基类型，通常嘌呤-嘌呤（如G-G）或嘌呤-嘧啶（如G-A）碱基对的稳定性优于嘧啶-嘧啶（如C-T）碱基对。

在含有富含π的芳香结构的碳基电极材料（如碳纳米管、石墨、氧化石墨烯）上，可以通过π-π碱基堆叠相互作用促进NA的吸附。（23-25）为了最大化π-π堆叠相互作用，NA碱基可以以其芳香环平贴在电极表面上进行吸附。与NA序列中的π-π碱基堆叠相互作用类似，嘌呤碱基（A和G）由于更强的π-π相互作用，对碳基电极材料的吸附亲和力高于嘧啶碱基（C、T和U）。Iliafar及其同事使用单分子力谱技术测量了从单壁碳纳米管中移除单链同聚物DNA序列所需的力。（26）他们得出结论，DNA在中性碳纳米管表面的吸附是由π-π堆叠驱动的，其结合亲和力顺序为A > G > T > C。Li等人通过在氧化介孔碳纳米球表面吸附NA适配体探针序列构建了一种适配体传感器。（27）通过π–π碱基堆叠相互作用，将氧化介孔碳纳米球与NA适配体探针在37°C下孵育10分钟即可快速制备出传感器表面。吸附后，这些适配体序列能够特异性结合癌细胞上的MUC1靶标。

2.3. 氢键
氢键代表质子供体和质子受体之间的吸引力。在NA生物分子中，互补碱基对（例如DNA中的A–T或RNA中的A–U通过两个氢键，或G–C通过三个氢键）之间的氢键确保了结构稳定性。关于NA在电极表面的吸附，由于电极材料上存在可接近的氢键受体/供体位点，因此可以发生氢键作用。然而，由于氢键容易形成和断裂，它不被认为是NA-电极表面吸附的主要分子间作用力。相反，NA碱基与电极材料之间的氢键被认为有助于NA的初始附着和定向，通常与其他更强的NA吸附力（如静电相互作用或π-π碱基堆叠）共存。此外，氢键也可以很容易地被破坏，从而将NA生物分子从电极表面洗脱出来用于生物传感。Park及其同事证明，氢键是单链NA生物分子在氧化石墨烯纳米材料上吸附的关键驱动力。（28）他们设计了一种简单策略，通过监测荧光淬灭和恢复来检测单链NA序列在氧化石墨烯上的吸附和解离。通过尿素破坏氢键，单链NA生物分子可以从氧化石墨烯表面容易地解离出来。

2.3. 基于吸附的电化学核酸生物传感在生物医学、临床和农业应用中的应用
通过独特地利用对NA碱基-电极表面吸附亲和力的基本理解，我们过去十年的研究项目专注于开发针对不同类型NA生物标志物的新电化学生物传感方法。设计此类基于吸附的电化学检测方法的关键挑战在于考虑NA生物标志物的多样性特征（例如，单碱基区分、靶标长度、二级结构、丰度）以及生物基质干扰。在我们的研究项目中，我们避免了使用阻断剂或钝化层，以最小化非特异性吸附。这是通过在裸露的未修饰电极表面进行NA靶标的磁预分离来实现的。磁预分离可以物理分离NA靶标，以便在最佳缓冲液中重新悬浮，从而实现一致的NA-电极吸附和电化学信号传导。这样，我们可以避免由于电极表面修饰使用阻断剂或钝化层而导致的电化学信号变异性和稳定性问题。虽然传统的磁分离方法仍可能因珠子聚集和非特异性结合而产生测量变异性，但磁性纳米材料的创新可以提供潜在的解决方案（例如，更高的溶液相稳定性或更大的表面积以捕获特定靶标）。

在本节中，我们介绍了我们围绕控制NA碱基-电极表面吸附亲和力和吸附动力学的研究。利用对传统电极材料上不同NA碱基吸附亲和力的基本理解，我们可以增强NA吸附，并解决典型基于吸附的检测方法中常见的脱附和稳定性问题。我们描述了不同NA生物分子（DNA甲基化、mRNA、microRNA（miRNA）和长非编码RNA（lncRNA）的特性，以及如何利用它们与电极材料的碱基亲和力进行分析、生物医学和农业生物传感应用（表S1）。

3.1. DNA甲基化生物标志物
DNA甲基化是指在双链DNA生物分子的特定C碱基上添加甲基，这是一种调节基因表达和细胞分化的基本表观遗传机制。基因启动子区域的不规则DNA甲基化在导致疾病（包括癌症）中起着关键作用，使其成为多个领域中的关键生物标志物。通过依赖NA碱基对裸露金电极的不同吸附亲和力，我们首次报道了一种称为“eMethylsorb”的简单电化学方法来检测DNA甲基化。尽管DNA甲基化不涉及DNA序列的变化，但可以通过亚硫酸盐处理轻松转化为NA碱基的变化：未甲基化的C被转化为U，而甲基化的C保持不变。然后使用不对称聚合酶链反应（PCR）将甲基化的C转化为G，将亚硫酸盐转化的U转化为A。所得扩增子直接吸附在金电极上，由于A具有更高的金吸附亲和力，因此富含A的未甲基化DNA在电极上的吸附量比富含G的甲基化DNA更多。吸附的DNA量通过使用[Fe(CN)6]3–/4–氧化还原系统进行差分脉冲伏安法进行量化。（29）利用NA碱基对金的不同吸附亲和力（A > C ≥ G > T），我们随后在一次性且成本效益高的丝印金电极材料上测试了eMethylsorb，发现10分钟的吸附时间可以更好地区分乳腺癌中甲基化和未甲基化DNA生物标志物之间的电化学响应。（30）

3.2. 基于吸附的电化学核酸生物传感在生物医学、临床和农业应用中的应用
通过独特地利用对NA碱基-电极表面吸附亲和力的基本理解，我们过去十年的研究项目专注于开发针对不同类型NA生物标志物的新电化学生物传感方法。设计此类基于吸附的电化学检测方法的关键挑战在于考虑NA生物标志物的多样性特征（例如，单碱基区分、靶标长度、二级结构、丰度）和生物基质干扰。在我们的研究项目中，我们避免了使用阻断剂或钝化层，以最小化非特异性吸附。这是通过在裸露的未修饰电极表面进行NA亲和吸附电化学生物传感之前先进行磁预分离来实现的。磁预分离可以物理分离NA靶标，以便在最佳缓冲液中重新悬浮，从而实现一致的NA-电极吸附和电化学信号传导。通过这种方式，我们可以避免由于电极表面修饰使用阻断剂或钝化层而导致的电化学信号变异性和稳定性问题。尽管传统的磁分离方法仍可能因珠子聚集和非特异性结合而产生测量变异性，但磁性纳米材料的创新可以提供潜在的解决方案（例如，更高的溶液相稳定性或更大的表面积以捕获特定靶标）。

在本节中，我们展示了我们关于控制NA碱基-电极表面吸附亲和力和吸附动力学的研究。利用对传统电极材料上不同NA碱基吸附亲和力的基本理解，我们可以增强NA吸附，并解决典型基于吸附的检测方法中常见的脱附和稳定性问题。我们描述了不同NA生物分子（DNA甲基化、mRNA、microRNA（miRNA）和长非编码RNA（lncRNA）的特性，以及如何利用它们与电极材料的碱基亲和力进行分析、生物医学和农业生物传感应用（表S1）。

3.1. DNA甲基化生物标志物
DNA甲基化是指在双链DNA生物分子的特定C碱基上添加甲基，这是一种调节基因表达和细胞分化的基本表观遗传机制。基因启动子区域的不规则DNA甲基化在导致疾病（包括癌症）中起着关键作用，使其成为多个领域中的关键生物标志物。通过依赖NA碱基对裸露金电极的不同吸附亲和力，我们首次报道了一种称为“eMethylsorb”的简单电化学方法来检测DNA甲基化。虽然DNA甲基化不涉及DNA序列的变化，但它可以通过亚硫酸盐处理轻松转化为NA碱基的变化：未甲基化的C被转化为U，而甲基化的C保持不变。然后使用不对称聚合酶链反应（PCR）将甲基化的C转化为G，将亚硫酸盐转化的U转化为A。所得扩增子直接吸附在金电极上，由于A具有更高的金吸附亲和力，因此富含A的未甲基化DNA在电极上的吸附量比富含G的甲基化DNA更多。吸附的DNA量通过使用[Fe(CN)6]3–/4–氧化还原系统进行差分脉冲伏安法进行量化。（29）利用NA碱基对金的不同吸附亲和力（A > C ≥ G > T），我们随后在一次性且成本效益高的丝印金电极材料上测试了eMethylsorb，发现10分钟的吸附时间可以更好地区分乳腺癌中甲基化和未甲基化DNA生物标志物之间的电化学响应。（30）

3.2. 基于吸附的电化学核酸生物传感在生物医学、临床和农业应用中的应用
除了在常规金电极材料上的NA吸附外，（31?37）我们还探索了甲基化DNA对碳基电极材料的优先亲和力。我们开发了一个平台，利用甲基化DNA与未甲基化DNA在石墨烯修饰电极上的不同吸附行为，从而实现了高特异性的DNA甲基化生物标志物分析。（38）由于NA碱基对石墨烯的亲和吸附顺序为G > A > T > C，因此经过亚硫酸盐处理的富含G的甲基化DNA在石墨烯修饰的丝印碳电极上吸附量更大。通过监测吸附DNA的差分脉冲伏安电流来量化甲基化程度，该方法被用于高精度地检测食道癌组织样本中的DNA甲基化水平。（38）

为了进一步扩展NA在丝印金电极上的应用，我们最近设计了用于电化学DNA甲基化生物传感的聚合物纳米珠。（39,40）这些纳米珠被功能化，以便选择性地磁富集目标甲基化DNA。甲基化DNA通过NA碱基-金亲和作用直接且快速地吸附在未修饰的丝印金电极上，并通过计时安培法进行电化学量化。目前，DNA甲基化生物标志物的检测仍然主要依赖于亚硫酸盐转化。尽管我们已经利用这种反应在金和石墨烯电极材料上实现了基于NA吸附的电化学生物传感，但亚硫酸盐转化是一个耗时且会损伤DNA的过程。未来，尝试使用新的无亚硫酸盐方法（如酶促DNA甲基化转化）来设计更快的基于NA吸附的电化学生物传感器将是明智的选择。

3.2. DNA生物标志物
DNA是一种双链生物分子，由两条NA链缠绕在一起形成双螺旋结构。DNA生物分子包含使每种物种独特的生物指令，这些指令由A、T、G和C碱基的独特组成构成。鉴于它们无与伦比的物种特异性信息，DNA生物分子在许多应用领域中都是普遍存在的生物标志物。为此，我们开发了DNA电化学生物传感器，将DNA生物标志物与电极材料之间的相互作用机制转化为可量化的电流信号。（41）对于植物病原体DNA生物标志物的检测，我们开发了一种基于吸附的现场可部署的电化学检测方法，用于检测引起甘蔗叶枯萎病的细菌Xanthomonas albilineans（Xalb）。（42）该方法利用煮沸裂解法提取粗DNA，通过磁珠捕获目标序列，并通过电化学信号读出来直接检测甘蔗叶片、分生组织和汁液样本中的Xalb DNA。无需复杂的电化学传感器制造，该方法可以在资源有限的条件下实现无扩增的定量检测Xalb DNA，具有fM级别的灵敏度，为现场诊断提供了潜在的解决方案。这是通过NA-金亲和作用在1分钟内将Xalb DNA靶标吸附在金纳米粒子修饰的电极表面上实现的。这种基于植物病原体DNA在金纳米粒子修饰的丝印金电极材料上的吸附原理的工作电化学检测方法也被单独用于检测引起甘蔗茎秆矮化的细菌Leifsonia xyli subsp. xyli。（43）

3.3. 信使RNA生物标志物
RNA生物分子是由A、C、G或U碱基组成的单链序列，可以呈现不同的构象和长度。我们设计了无需酶促扩增的电化学生物传感器，利用它们在电极材料上的集体NA碱基吸附能力来检测这些不同类型的RNA。在这些不同类型的RNA中，mRNA携带来自DNA的信息，指导细胞制造蛋白质，并可作为多种生理和病理途径中的生物标志物（例如，基因融合、表达水平、甲基化）。我们最初展示了分离的mRNA靶标在裸露金表面的高效直接快速吸附。（45）由于所有mRNA自然都具有3′ polyA尾序列，这种mRNA检测方法利用了A碱基与金之间的高亲和力。这种检测原理（图5）最初用于检测前列腺癌基因融合mRNA生物标志物。基因融合mRNA生物标志物通过互补捕获探针进行磁纯化，然后从捕获探针中释放出来并吸附在丝印电极的裸露金表面上。吸附的基因融合mRNA的定量电化学检测基于[Fe(CN)6]3–/4–氧化还原系统，产生可检测的法拉第电流读数，反映了吸附的mRNA量。除了避免繁琐的电极表面修饰外，该方法还提供了出色的检测灵敏度（10个细胞）和特异性，同时避免了传统方法中使用的PCR扩增策略。我们还分别使用这种mRNA-金吸附电化学检测方法分析了细胞系和临床样本中的食道癌mRNA生物标志物。（46）经许可转载自参考文献（45）。版权所有：美国化学学会，2016年。高分辨率图像。下载MS PowerPoint幻灯片。

为了增强探针与mRNA的杂交动力学，我们在一个带有金微电极的单一纳米设备上实现了基于mRNA-金吸附的电化学生物传感检测方法（47）。通过使用不对称的金微电极设计来产生流体运动，我们在10分钟内实现了探针与mRNA目标在体溶液中的加速杂交。随后，mRNA目标通过其内源性polyA尾部（即A-金亲和相互作用）从探针上释放出来，并迅速吸附到金微电极表面。这无需任何先前的酶扩增步骤即可实现毫摩尔级别的检测灵敏度，并对前列腺癌尿液样本中的TMPRSS2:ERG基因融合mRNA生物标志物进行了无创分析。

对于基于碳的电极材料，我们引入了一种无需扩增的电化学检测方法，用于检测卵巢癌基因融合mRNA生物标志物，该方法利用了一类新型超顺磁性氧化石墨烯负载氧化铁纳米粒子的电催化活性（48）。在分离和纯化后，目标mRNA通过mRNA-氧化石墨烯亲和相互作用直接吸附到纳米粒子表面（图6）。通过将[Ru(NH3)6]3+/2+与[Fe(CN)6]3–/4–氧化还原报告剂耦合来实现电催化信号。如图6所示，[Ru(NH3)6]3+可以与带负电的NA磷酸骨架发生静电相互作用。通过与[Fe(CN)6]3–的耦合，电化学还原的[Ru(NH3)6]2+可以被重新氧化。这种循环过程触发了[Ru(NH3)6]3+的多次转化，从而显著增强了电化学信号。我们成功地在来自高级别卵巢癌患者的临床血浆样本中检测到了FGFR2:FAM76A基因融合mRNA生物标志物。

尽管已经成功地展示了利用mRNA polyA尾部来促进不同电极材料上的NA碱基亲和吸附，但需要认识到某些（组蛋白或母体）mRNA生物标志物没有polyA尾部。因此，设计出将polyA序列引入这些mRNA生物标志物的方法以促进其在电极材料上的吸附是至关重要的。

3.4 微RNA生物标志物
作为一种RNA生物分子，miRNA是大约20个碱基长的单链序列。由于miRNA在调控RNA沉默中的作用，其表达水平可以作为多种疾病的生物标志物。由于它们较短的引物长度和缺乏内源性polyA尾部，miRNA通常难以用传统的基于PCR的方法检测。为了解决这个问题，我们首先开发了一种基于聚腺苷酸化的电化学检测平台，通过酶法在miRNA生物标志物上添加polyA尾部，从而实现基于吸附的检测而无需miRNA扩增（图7）（9）。这一额外的简单3′ polyA尾部序列合成步骤在15分钟内即可完成，并允许以与mRNA目标相同的方式实现更高A碱基亲和吸附的电化学检测。我们将这项技术应用于miR-107前列腺癌生物标志物的检测，在细胞系和患者尿液样本中实现了高fM级别的检测灵敏度和特异性。这项研究为基于miRNA吸附的电化学生物传感技术的进一步创新奠定了基础。

特别是，使用纳米结构顺磁性材料显著提高了NA-电极材料亲和吸附性能和电化学信号生成（11,49）。我们描述了使用负载金的纳米多孔氧化铁立方体来检测miRNA的方法（50）。通过利用miRNA-金亲和相互作用以及涉及[Ru(NH3)6]3+/2+/[Fe(CN)6]3–/4–氧化还原循环的多个信号增强步骤，我们使用食管鳞状细胞癌细胞系和组织样本实现了毫摩尔级别的检测灵敏度。在此基础上，我们引入了一种无需酶的电化学平台，能够直接从人血清中检测另一种类型的生物标志物（外泌体miRNA）（51）。外泌体miRNA通过促进细胞间通讯和靶向细胞生长分子途径来促进癌症转移。使用预先功能化的磁性珠子分离外泌体miR-21生物标志物，然后通过miRNA-金亲和相互作用将其直接吸附到金电极表面进行差分脉冲伏安法测量。这种策略在各种癌细胞系和结直肠腺癌患者的血清样本中提供了1 pM的优异检测灵敏度。

在基于碳的电极材料设计和合成方面的并行创新也改变了基于miRNA吸附的电化学生物传感技术。我们展示了使用激光诱导的自掺杂多孔石墨烯构建具有fM级别miRNA检测灵敏度的电化学生物传感器的方法（图8）（52）。激光诱导的石墨烯是通过在商用聚酰亚胺上直接激光书写并利用计算机辅助设计系统图案化而成的电极。先兆子痫特异性miRNA hsa-miR-486-5p生物标志物通过磁分离后直接吸附到激光诱导的N掺杂石墨烯电极表面，通过miRNA-石墨烯亲和相互作用进行检测。研究发现，激光还原聚酰亚胺后形成了氮掺杂的多孔石墨烯，其导电性和对吸附的NA生物分子的电化学检测灵敏度得到了提高。

由于miRNA生物标志物通常由异常过表达或低表达的miRNA组成，因此准确的定量是必要的。这将需要对电极材料上的NA亲和吸附过程进行精确控制，以实现具有宽线性动态范围的电化学生物传感。因此，进一步了解不同类型电极材料上的NA碱基亲和吸附机制至关重要。

3.5 长链非编码RNA生物标志物
曾经因为缺乏蛋白质编码潜力而被视为基因组的“暗物质”，但现在已知lncRNA分子作为分子信号在响应各种刺激时调节转录。lncRNA分子通常是单链的，长度超过200个碱基。在癌症中，异常的lncRNA表达水平是几种不同类型癌症的有希望的诊断或预后生物标志物。我们首次报道了一种基于NA吸附的电化学检测方法，用于检测前列腺癌lncRNA生物标志物SChLAP1，该方法使用DNA导向的铜纳米结构组装（53）。该检测首先涉及在磁分离的lncRNA目标上酶法添加poly(AT)延伸。这些poly(AT)延伸用于快速简便地合成具有固有荧光和电化学特性的铜纳米块（图9）。基于NA碱基-金亲和相互作用，lncRNA目标随后被方便地吸附到未经修饰的丝印金电极材料上。最后，吸附的铜纳米块在电极表面被诱导催化过氧化氢还原，产生与lncRNA目标数量相对应的电化学电流响应。这种现代界面生物传感技术实现了SChLAP1的fM级别检测。

同样，通过使用酶合成的polyA尾部，我们在定制的纳米设备上促进了A碱基-金吸附，用于电化学检测SChLAP1生物标志物（图10）（47）。该纳米设备独特地利用微流控混合力在直接检测天然RNA目标之前增强探针-目标杂交，无需lncRNA扩增或电极表面功能化。在磁富集和酶法3′ polyA延伸后，SChLAP1 lncRNA目标从探针上释放出来并迅速吸附到金微电极表面。为了量化吸附的SChLAP1生物标志物数量，使用了[Fe(CN)6]3–/4–氧化还原系统来生成可检测的法拉第电流信号。

目前lncRNA生物标志物的关键检测挑战源于其长度的多样性，范围可以从200到100,000个碱基不等。现有的吸附机制研究主要限于短NA序列，可能无法真正反映实际lncRNA生物标志物的吸附行为。因此，在未来关于电极材料上NA亲和相互作用的研究中，必须考虑lncRNA生物标志物的不同长度。

4. 结论与未来展望
在本报告中，我们展示了从关于NA碱基-电极材料亲和相互作用的基础研究到适用于人类或植物样本矩阵的实际电化学生物传感器的演变。我们强调了NA生物传感在生物医学和农业领域的扩展范围，以及我们的基于NA吸附的生物传感器设计在实现快速、灵敏和选择性检测方面的优势，这些传感器非常适合多种NA生物标志物类型。这些研究表明了一个共同的生物传感器设计概念，即利用基本的NA碱基-电极材料亲和机制来操纵和促进最佳NA生物标志物在金/碳基电极材料上的吸附，以进行电化学测量。无论不同DNA或RNA生物分子的独特特性（例如，NA碱基类型、单链/双链、长度、甲基基团的存在），我们的基于电化学吸附的生物传感器都具有独特优势，因为它们能够提供无需传统DNA检测方法（如PCR）的简单分子扩增替代方案。通过了解不同NA生物标志物的不同特性（第3节），我们可以更好地设计用于实际应用的电化学吸附生物传感器。在考虑和克服不同NA生物分子的特定检测挑战时，将与电极材料的内在NA碱基亲和相互作用转化为医疗和农业行业的实际效益。特别是对于快速便捷的NA生物标志物吸附过程在即时电化学传感中的应用至关重要。未来，我们将提供关于可能的未来研究方向的见解，以推动基于NA吸附的电化学生物传感器领域的发展。

除了影响与电极材料亲和作用的NA碱基类型（A、T、G、C和U）之外，高维NA构象也可以改变NA碱基-电极材料吸附所涉及的分子间力。长单链NA链更有可能形成高维结构，特别是RNA（54?57）生物分子，它们已知采用复杂的构象，如参与蛋白质合成的tRNA（tRNAs）或具有共价闭合环结构的环状RNA（circRNAs），以调节细胞功能。了解参与高维NA结构NA亲和相互作用的主要分子间力将非常有趣，特别是比较不同线性NA序列的吸附强度、吸附过程中的具体接触点或吸附/解吸过程中的构象变化。这种理解有助于设计具有优异检测性能的基于吸附的电化学生物传感器。

考虑到电极纳米材料合成、表面工程和电化学生物传感器整合方面的突破性进展，研究不同NA碱基在新型电极纳米材料上的吸附机制将至关重要。新兴的电极纳米材料（具有优异的表面积、导电性和大规模制造潜力）包括混合金属-有机框架（MOFs）、纳米针或MXenes（58?60）。对这些NA碱基-电极材料相互作用的详细机制研究可以扩展生物传感在分析分析、生物医学诊断和农业生物安全中的应用。