一种多维工作流程：通过整合TIMS-PASEF与LC-HRMS技术以及基于生物转化的候选物与非靶标筛选方法，实现全面的异生物质组分析

《Analytical Chemistry》：A Multidimensional Workflow for Comprehensive Xenometabolome Profiling by Integrating TIMS-PASEF with LC-HRMS and Biotransformation-Informed Suspect and Nontarget Screening

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全面的异生物质组表征对于理解外源物质在生物系统中的影响至关重要。本研究提出了一种多维分析工作流程，整合了正交色谱分离、陷阱离子迁移谱（TIMS）、高分辨率质谱和基于生物转化的数据处理方法，以应对异生物质组评估中的挑战。本研究以暴露于4-甲基苯并三唑（4-MeBT）的斑马鱼幼体作为复杂案例进行研究。TIMS维度为异构体鉴定提供了正交的实验证据，其逆迁移率（1/K0）有助于确定主要O–S-4MeBT和O-G-4MeBT异构体的结合位点。TIMS与并行积累串联裂解（PASEF）采集技术的结合进一步降低了光谱复杂性，提高了信噪比，并提升了质谱/质谱（MS/MS）的覆盖率（70%），从而生成了对于结构解析至关重要的高质量分析证据。为了充分利用这些分析手段，我们开发了一种数据处理策略，该策略结合了基于计算机模拟的疑似化合物筛查和基于生物转化的非目标化合物筛查方法。在这方面，我们引入了两个新的框架：“构建模块”（Building Blocks，简称BB）概念，它将未知的生物转化产物（bio-TPs）解释为来自母体化合物和代谢途径的子结构的模块化组合；以及“光谱特征知识库”（Spectral Characteristics Knowledgebase，简称SCKB），该知识库利用已知的生物转化质谱/质谱模式来提供结构信息，从而帮助识别未知化合物。我们的结果证明了所有已知的4-MeBT生物转化产物的鉴定，并发现了12类生物转化产物中的29种新特征，这突显了该方法在解析复杂外源物质代谢中的有效性。其中，首次在斑马鱼中报告了一种假定的二聚体产物（4-MeBT-263）。总体而言，这一工作流程有助于深入理解异生物质组研究中生物转化产物的形成和解毒过程。

**引言**
异生物质组分析研究的是生物体在暴露于外源物质后产生的所有小分子代谢物，它是环境科学和毒理学中的强大工具。(1,2) 通过分析生物体内的外源物质及其生物转化产物（bio-TPs），异生物质组分析有助于阐明环境污染物与其对暴露生物体影响之间的复杂相互作用。(3,4) 生物转化在这一过程中起着关键作用，(5,6) 它影响着外源物质的体内浓度(Cint)、(7) 吸收、生物累积潜力，以及最终的毒性。(6,9) 在生物转化程度较高的情况下，(6,9) 异生物质组评估尤为重要，因为大部分母体化合物可能会发生转化。如果将生物转化产物排除在Cint的计算之外，可能会导致对外源物质总体暴露程度的低估及其毒理效应的误判。(6,9) 因此，进行全面异生物质组评估以彻底评估生物转化过程对于准确的环境风险评估至关重要。斑马鱼胚胎和早期幼体结合了多细胞生物的高通量分析能力，使其成为环境科学和生物医学研究等多个领域的热门模型。(10,11)

高分辨率质谱（HRMS）工作流程结合了疑似化合物筛查和非目标化合物筛查（NTS）策略，是确定外源物质及其生物转化产物的有效方法。(2,9,12) 然而，一些分析和数据处理挑战阻碍了异生物质组的全面解析。主要挑战在于潜在的生物转化反应数量庞大，其中一些反应仍在研究中。(13) 这需要开发强大的数据处理工作流程来识别尚未知晓的生物转化产物。此外，单一反应可能产生多种异构体生物转化产物，(6,12,14) 即使对于像羟基化这样已经充分研究的反应也是如此。(6) 分离和研究这些异构体对于环境风险评估至关重要，因为它们可能表现出不同的毒理特性。(15,16) 生物基质的复杂性以及众多内源性化合物中的低丰度生物转化产物进一步增加了分析难度。(17) 具体来说，灵敏度限制可能会阻碍低丰度生物转化产物的检测，(18) 阻碍了对代谢途径的全面理解。最后，在未知化合物鉴定方面，实验质谱/质谱（MS/MS）光谱的有限可用性是一个关键分析挑战，这突显了依赖数据采集（DDA）模式的重要性。(19)

**应对异生物质组分析的挑战**
需要通过整合多种分析维度来扩展可用的分析空间。将互补的色谱模式与HRMS结合使用，对于全面识别未知化合物具有显著优势。(6,12) 此外，将离子迁移谱（IMS）与HRMS联用基于离子的形状和大小（碰撞截面，CCS）进行分离，具有独特优势。(20) 研究表明，漂移管IMS（DTIMS）和行波IMS（TWIMS）可用于外源物质分析，可提高分离效果、增强峰容量并降低化学噪声，(21?24) 但也存在与离子传输和占空比相关的挑战。(19,20) 陷阱IMS（TIMS）是一种不同的分离方法，它将离子固定在移动气体上，然后根据其迁移率释放它们。(25,26) timsTOF Pro平台最新的双TIMS配置(27)允许并行而非串联地积累和分析离子，显著提高了占空比。(28,29) 这一创新激发了并行积累串联裂解（PASEF）采集方案的发展，该方案将四极杆分离窗口与TIMS装置的离子洗脱同步，使得在一个离子洗脱周期内能够同时进行多个前体的分离和裂解。(30,31) 通过这种方式，TIMS-PASEF显著提高了MS/MS的覆盖率，同时不降低灵敏度，并简化了MS/MS光谱的复杂性。(31,32)

强大的数据处理工作流程对于充分利用先进分析工作的实验证据并实现全面的异生物质组评估至关重要。(12) 生物转化研究包含了关于母体外源物质结构和已知代谢反应的固有信息，这些信息可用于生物转化产物的鉴定。疑似化合物筛查是一种高效工具，可以利用这些生物转化知识预测和识别预期的生物转化产物。然而，疑似化合物筛查的预测能力受到所纳入特定反应的限制。(33) 非目标化合物筛查（NTS）通过揭示意外的生物转化产物，提供了关于新的生物转化途径的见解。(13) 尽管生物转化研究包含了关于未知生物转化产物潜在子结构的信息，但这些信息在当前的NTS工作流程中尚未得到充分利用。因此，未知化合物的结构解析通常从“零知识”起点开始，依赖于基于计算机模拟的质谱/质谱预测和专家的HRMS知识。(6,12,34) 因此，需要制定优先级和注释工作流程，系统地利用现有的实验证据和固有的生物转化信息，以提高生物转化产物的识别效率。

本研究旨在解决全面异生物质组分析中的分析和数据处理挑战。我们特别选择了暴露于4-甲基苯并三唑（4-MeBT）的斑马鱼幼体作为复杂案例进行研究，因为之前的研究(6)遇到了多个挑战，我们希望回答以下研究问题：(1) 如何生成广泛的多维分析证据以支持复杂识别案例；(2) 如何最好地利用这些分析证据以及固有的生物转化信息，以高置信度优先识别和注释未知生物转化产物。为此，我们结合了不同的色谱模式（TIMS和HRMS）来扩展可用的分析空间，并评估了TIMS-PASEF在克服异构体分离、光谱复杂性、灵敏度和MS/MS覆盖率方面的潜力。最终，建立了一种以生物转化为导向的数据处理工作流程，整合了序列相似性（SS）、非目标化合物筛查（NTS）和生物转化实验的固有特征，以高置信度识别生物转化产物。

**材料与方法**
所有化学品均购得最高纯度等级（>95%）。关于本研究中使用的化学品、溶剂和试剂的详细信息见支持信息。

**斑马鱼幼体的培养、暴露和提取**
斑马鱼（Danio rerio）幼体的暴露实验和提取方法已在我们的先前研究中详细描述。(6) 本研究中未进行额外的暴露处理。简而言之，斑马鱼幼体分别暴露于0.1%甲醇（对照组）和10 μg/mL的4-MeBT溶液中，暴露时间为30秒、2小时、4小时、8小时和24小时（当前研究中使用的样品即为这些暴露后的样本）。每个时间点的样本都是独立的暴露样本。包含时间点样本的目的是为了为生物转化产物的优先排序和筛选提供时间线索。此外，这种方法还可以提供关于生物转化反应顺序和/或生物转化产物之间关系的见解。在样品制备方面，斑马鱼幼体用两种不同的预冷有机溶剂混合物进行提取（第一次提取：甲醇/水（1:1）；第二次提取：二氯甲烷/甲醇（3:1）），从而得到“水相”和“有机相”提取物。水相提取物中含有超过90%的母体化合物（6），因此被用于本研究。使用无生物体的对照样本（不含斑马鱼的化合物）以确保生物转化产物仅通过生物转化过程产生。

**分析方法**
本研究使用超高效液相色谱（UHPLC，Elute LC系列，Bruker Daltonics，德国不来梅）系统与混合型TIMS-四极杆飞行时间质谱系统（TIMS-QTOF，timsTOF pro 2，Bruker Daltonics，德国不来梅）相结合，用于分析和鉴定潜在的生物转化产物。由于我们之前的研究已经专门评估了亲水相互作用液相色谱（HILIC）在识别不同苯并三唑生物转化产物方面的效果（例如减少了假阴性结果等），因此本研究中采用反相液相色谱（RPLC）进行LC-TIMS-HRMS分析。尽管如此，我们建议在RPLC和HILIC模式下都对斑马鱼幼体提取物进行解析，同时使用ESI极性进行全面的异生物质组评估。有关使用RPLC-ESI-TIMS-QTOF分析斑马鱼幼体的详细仪器参数见支持信息（SI-2）。

**数据处理工作流程——通过疑似化合物筛查和非目标化合物筛查识别生物转化产物**
我们介绍了一种专为生物转化研究设计的数据处理工作流程，特别是用于在复杂生物基质中全面表征外源物质生物转化产物。我们的方法结合了疑似化合物筛查和非目标化合物筛查，利用了生物转化研究的固有知识，即母体外源物质的已知结构和已建立的生物转化途径。

**疑似化合物筛查**是我们工作流程的关键组成部分，包括两个主要步骤：(1) 使用代谢预测工具（Metabolite Predict，Bruker Daltonics）和Biotransformer（35）生成潜在生物转化产物的结构信息；(2) 通过MS/MS（MetFrag，36）和CCS预测（MetaboScape中的CCS-Predict Pro）将这些结构信息转化为预测的分析证据。然后利用这些预测证据在分析样品中搜索和注释疑似生物转化产物（见支持信息S3–2）。对于非目标化合物筛查，使用MetaboScape中的递归特征提取算法（T-Rex 4D）将原始数据转换为全面的特征表（见图S1）。建立了一个多步骤优先级工作流程，利用多种分析证据，包括：(i) 对照样本减法；(ii) 统计分析（例如PCA、PLS-DA）；(iii) 基于相关性的特征分组；(iv) 基于裂解模式、中性损失和质缺陷的MS/MS过滤（见支持信息S3–3，图S2）。采用以生物转化为中心的分子公式推导方法，并结合计算机模拟工具和专家指导的MS/MS解释，以自信地注释复杂的生物转化产物。

**注释标准**
当满足以下标准时，注释被视为有效：质量精度在5 mDa范围内，同位素模式偏差≤200 mSigma，CCS偏差在预测值的4%以内，保留时间偏差在预测值的2分钟范围内。鉴于现有的预测模型并未在特定的外源物质生物转化产物化学空间上进行广泛训练，保留时间合理性检查和ΔCCS主要用于支持位置异构体的洗脱顺序评估，而不是作为成功鉴定的严格过滤步骤。此外，还引入了基于TIMS的逆迁移率（1/K0）值作为额外的正交参数，以辅助异构生物转化产物的评估。对于每个色谱峰，在狭窄的保留时间窗口内提取离子迁移谱（EIM），并利用1/K0值和/或TIMS洗脱顺序的差异作为区分位置异构体和结合位点异构体的支持证据。这种方法假设反映3D构象的1/K0值主要由结合位点决定，而非具体的结合位置。这一假设对于像4-MeBT这样的紧凑型母体化合物是成立的。关于这些方法、工具和参数设置的更多细节见支持信息（SI-3–3, 4）。

**基于生物转化知识的结构信息生成**
受疑似化合物筛查的启发，我们扩展了生物转化知识在生成未知生物转化产物结构信息中的应用。具体来说，我们开发了“构建模块”（Building Blocks，简称BB）和“光谱特征知识库”（SCKB）框架，以辅助未知特征的注释。根据“构建模块”框架，我们认为未知生物转化产物可以被视为由“构建模块”组成的模块化实体，这些模块部分可以从已知的生物转化途径和母体化合物中解释出来（见图1A）。编制了一份常见构建模块的列表，包括：(1) 母体化合物的完整结构（主要针对II期反应）；(2)...母体化合物的亚结构（例如，在第一阶段功能化之后）以及（3）生物转化反应产生的亚结构（例如，葡萄糖醛酸苷结合会引入175 Da的质量变化，而片段131和113通常出现在相应的MS/MS光谱中）（图1A）。未知特征被搜索为与这些构建块相对应的碎片离子和中性损失，从而限制了公式搜索空间并促进了鉴定。图1（A）。“构建块”框架及其在NTS中的附加价值与传统NTS方法相比。传统的NTS将生物转化产物（bio-TPs）视为完全未知的实体。通过“构建块”框架，我们认为未知生物转化产物的结构可以概念化为“构建块”的马赛克（A1），部分由母体化合物（A2i——无论是完整结构还是其部分）和生物转化反应（A2ii）解释。（B）“光谱特征知识库”（SCKB）框架建立的概念验证。SCKB利用通过可疑分子筛选（步骤1和2）获得的知识。可疑分子筛选利用母体化合物的结构（步骤1）和已知的生物转化反应（步骤2）来提出生物转化产物的结构。SCKB框架系统地从可疑生物转化产物的MS/MS碎片模式中提取与生物转化相关的光谱特征（步骤4）。这些特征来源于母体化合物、添加的生物转化基团或两者的组合（步骤3）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片SCKB基于这样的理念建立：未知的生物转化产物可能来源于可疑分子的进一步生物转化，或者共享共同的结构基序。SCKB利用从可疑分子筛选中获得的知识来识别表明特定生物转化反应和/或母体化合物修饰的特征MS/MS碎片和中性损失（图1B）。具体来说，对于通过可疑分子筛选识别的每个生物转化产物，我们记录了特征性的MS/MS碎片和中性损失。SCKB被组织成可搜索的表格/数据库格式（图S3）。通过将未知特征的实验MS/MS光谱与SCKB进行比较，我们可以推断出潜在的生物转化类型，并对复杂未知结构中的潜在亚结构有更深入的了解。这里介绍的数据处理工作流程旨在超越本研究中使用的特定化合物类别（BTs）。虽然某些工具（例如，同位素模式或质量缺陷过滤）的好处可能因母体化合物而异，但总体策略为全面的异生物质组学评估提供了强大的框架。结果和讨论：最大化异生物质组学评估的分析证据：TIMS（PASEF）在多维LC-TIMS-HRMS工作流程中的影响为了最大化异生物质组学表征的分析证据，本研究调查了结合正交色谱分离和TIMS-HRMS的多维LC-TIMS-HRMS工作流程的能力，以4-甲基苯并三唑（4-MeBT）作为案例研究。虽然RPLC-HRMS和HILIC-HRMS已经提供了几种异构生物转化产物的有价值色谱分辨率，但添加TIMS引入了正交的气相分离，为区分具有不同结合位点的异构体提供了额外的实验证据。这一点在4-MeBT的OH-硫酸酯（O–S）和OH-葡萄糖醛酸苷（O-G）结合体中尤为明显，TIMS洗脱行为（1/K0）支持了它们主要结合侧的选择（图2和3）。图2 使用RPLC-HRMS（a,b）、HILIC-HRMS（c）和RPLC-TIMS-HRMS（d1-d4）对O–S-4MeBT的结合侧和异构体分离进行多维评估。（a）RPLC中O–S-4MeBT的EIC：峰1和2代表苯环结合类，峰3代表三唑环结合类，这一点得到了保留时间预测的支持（b）。关于RPLC模式下O–S-4MeBT位置异构体的保留时间预测数据（c）HILIC中O–S-4MeBT的EIC：洗脱顺序颠倒，并观察到了额外的异构体（d）评估TIMS维度以检查O–S-4MeBT的结合侧（d1）EIC峰1的EIM（d2）EIC峰2的EIM（d3）N–S-4MeBT的EIM。正交色谱（RPLC/HILIC）和TIMS（1/K0分析）的结合提供了连贯的多维证据，以支持结合位点和位置异构体的分配。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片图3 评估了检测到的不同位置异构体O-G-4MeBT的结合侧。（a）RPLC中O-G-4MeBT的EIC：峰1和2代表苯环结合，峰3代表三唑环结合，这一点得到了保留时间预测的支持（b）。关于RPLC模式下O-G-4MeBT位置异构体的保留时间预测数据（c）评估TIMS维度以检查O-G-4MeBT的结合侧（c1）N–S-4MeBT的EIM（c2）EIC峰3的EIM（c3）EIC峰2的EIM（c4）EIC峰1的EIM。Rt预测和TIMS维度数据的结合提供了证据，表明O-G-bioTP的主要异构体的结合发生在三唑环上。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片图2显示了O–S-4MeBT主要异构体的结合侧的多维评估。在色谱维度上，RPLC-HRMS的洗脱顺序结合保留时间预测（图2a,b）支持将主要峰（EIC峰1）分配给苯环结合，将后洗脱峰（3）分配给三唑环结合。互补的HILIC-HRMS分析提供了这些洗脱趋势的正交确认（图2c）。在HILIC条件下，洗脱顺序与RPLC相反，这是由于色谱机制的变化所预期的。值得注意的是，通过HILIC部分解析了同一结合侧内的额外位置异构体。这种正交行为加强了支持所提出的结合位点分配的色谱证据。基于这种色谱证据，TIMS维度提供了额外的实验数据用于结合侧评估。通过RPLC-TIMS-HRMS对O–S-4MeBT的分析揭示了色谱峰1和2与峰3之间的不同迁移率峰值（1/K0）（图2 d1和3）。这里，使用逆向的降低迁移率（1/K0）作为正交气相洗脱参数，基于这样的假设：共享相同结合侧的位置异构体预计会显示相似的1/K0值，而改变结合侧会引起更大的构象变化和更显著的1/K0变化。为了支持这一解释，使用了N-硫酸酯结合体作为参考1/K0“指南针”（图2d4）。因为N-结合发生在三唑环上，其1/K0值为“三唑环硫酸化”迁移率提供了可靠的估计。将O–S-4MeBT峰的1/K0值与N-硫酸酯进行比较，支持将主要异构体分配给苯环结合（图2 d1和4）。结合保留时间预测（图2a,b），这些TIMS数据为结合位点的分配提供了连贯的实验证据。同样，结合保留时间预测和TIMS 1/K0洗脱数据为O-G-bioTPs的主要异构体中的三唑环结合提供了证据。这种额外的分析证据将O–S-4MeBT和O-G-4MeBT的主要异构体的鉴定信心水平提高到了2b级，展示了结合正交色谱和TIMS在注释异构生物转化产物方面的强大能力。图4（a）使用MetaboScape中的Biotransformer进行可疑分子筛选时的生物转化产物预测。从左到右展示了母体4Me-BT、第一代生物转化产物OH-4MeBT和第二代生物转化产物O-G-4MeBT的结构（b）。（c）对疑似生物转化产物的注释结果总结。（c）使用MetFrag基于计算机的预测工具和提出的生物转化产物结构的MS/MS光谱解释结果。d1, d2。4Me-BT暴露样品（d1）和对照样品（d2）中O-G-4MeBT的时间轮廓（d1）和（d2）中不存在这种情况（d2）的评估。（e1）O-G-4MeBT不同位置异构体的注释结果总结（e2）。不同O-G-4MeBT异构体的结构，e3 使用基于计算机的预测工具（MetFrag和CCSPredictPro）的MS/MS得分和ΔCCS%注释结果。MS/MS得分支持葡萄糖醛酸苷结合发生在苯环而不是三唑环。尽管ΔCCS%作为额外的评估标准，但在不同位置异构体之间观察到的变化小于0.1%。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片除了分离异构体外，我们的工作流程还显著提高了光谱质量。TIMS过滤有效减少了背景干扰和噪声，从而获得了更清晰的质量光谱（图S5和S6）。这种更清晰的光谱信息有助于识别生物转化产物，特别是在许多化合物可能共洗脱的复杂环境样品中。此外，我们观察到由于“源内”碎片化导致的假阳性鉴定减少。例如，在分析O-G-4MeBT时，由于O-G-4MeBT的“源内”碎片化，观察到一个额外的色谱峰（Rt = 3.75 min）（图S7）。这一点通过TIMS得到了确认，其中O-G-4MeBT的第二个峰与O-G-4MeBT显示出共同的迁移率峰，证明这个O-G-4MeBT峰是在TIMS洗脱后形成的“源内”片段。最小化此类假阳性对于防止数据误解和确保生物转化产物鉴定的可靠性至关重要。总体而言，TIMS的引入使得光谱更加清晰、信息更丰富，提高了我们异生物质组学分析的准确性和可靠性。除了我们的具体发现外，值得注意的是，离子迁移率过滤还可以为HRMS数据提供额外的好处。例如，它可以提供特定异构体的MS/MS光谱，尽管在我们的研究中，4-MeBT的异构生物转化产物产生了相同的碎片模式，这可能是由于母体化合物的结构紧凑。我们的4D工作流程与之前的LC-QTOF方法相比显示出灵敏度的提高。这在几个方面都很明显。最重要的是，改善的信噪比（S/N）使得能够检测到29个新的、之前未检测到的4-MeBT生物转化产物（表S3–S29，对应于12个生物转化产物类别，表明存在多个异构体）。这是一个关键发现，因为这些新检测到的生物转化产物有助于理解ZFL中BTs的完整代谢命运。当前分析工作流程的扩展检测能力允许对异生物质组进行更全面的评估，包括可能具有重要生物学或环境意义的低丰度生物转化产物。这些新的生物转化产物将在单独的研究中进一步调查和表征。除了新的生物转化产物外，我们还观察到已知生物转化产物的信噪比也有显著提高。例如，在LC-TIMS-HRMS工作流程中，O-G-4MeBT的信号强度提高了一个数量级（图S8），这有助于提高下面讨论的鉴定信心。最后，与之前的LC-QTOF数据集相比，检测到的特征总数增加了25%。这种更广泛的覆盖进一步突显了4D LC-TIMS-HRMS工作流程的灵敏度和分离能力。观察到的灵敏度提升可以归因于TIMS操作（捕获能力）和仪器优化。具体来说，据报道TIMS减轻了其他IMS实现中经常遇到的离子传输限制，这可能导致灵敏度损失。此外，离子捕获将信号浓缩成狭窄的（2–5 ms）IMS峰，而噪声则分布更广，从而提高了信噪比（图S9）。除了TIMS的固有特性外，我们还采用了优化的升降条件来促进离子的更广泛质量和迁移率传输（表S2）。这种方法旨在提高灵敏度，特别是在低质量范围内，这在小分子研究中往往具有挑战性。最后，TIMS-QTOF系统与我们之前研究中使用的QTOF系统（离子通过玻璃毛细管后的90°弯曲）之间的离子传输设计差异也可能有助于提高灵敏度。LC-TIMS-HRMS工作流程使用PASEF采集，实现了>70%的MS/MS覆盖率（图S10），包括即使对于低强度前体的MS/MS光谱（图S11b和S12），支持了现有文献。这比我们之前的LC-QTOF研究有了显著改进，之前的研究仅实现了35%的MS/MS覆盖率。这种增加的MS/MS覆盖率在O-G-4MeBT的鉴定中得到了清晰体现。在我们之前的研究中，没有获得该生物转化产物的MS/MS光谱，而4D工作流程提供了一个高质量的MS/MS光谱（图S13a）。葡萄糖醛酸苷基团的诊断性中性损失和葡萄糖醛酸特征片段的检测将其鉴定信心提高到了2b级。O-G-4MeBT的高质量MS/MS光谱归因于PASEF模式下增强的灵敏度和快速的MS/MS采集。最后，改进的光谱质量可以归因于TIMS的分离，它增强了前体分离，减少了共碎片化（嵌合光谱），从而得到了更清晰的MS/MS光谱，这是LC-HRMS DDA工作流程中的一个已知挑战。总体而言，结合RPLC、HILIC和TIMS扩展了可用的分析空间，并加强了生物转化产物注释的实验基础。在这个框架内，TIMS提供了用于分配主要O–S和O-G异构体结合位点的诊断证据。此外，TIMS过滤减少了背景干扰，从而得到了更清晰、更具信息量的MS和MS/MS谱图。另外，增强的灵敏度和PASEF支持的MS/MS覆盖范围有助于检测新的低丰度生物转化产物（bio-TPs），支持更全面的异生物质组（xenometabolome）评估。这些结果突显了将正交色谱与TIMS和PASEF结合在复杂环境工作流程中提高生物转化产物检测和注释的潜力。

通过嫌疑物筛查整合分析证据和生物转化见解——利用生物转化背景来促进生物转化产物的识别
通过嫌疑物筛查，在斑马鱼中检测到了12种4-MeBT的生物转化产物。这些生物转化产物来源于母体化合物的羟基化、硫酸盐结合和葡萄糖醛酸结合。内源性基团的结合既可以直接发生在4-MeBT的氮原子上（N-结合），也可以在母体分子羟基化之后发生（O-结合）。值得注意的是，嫌疑物筛查成功识别了所有先前报道的在4-MeBT暴露下斑马鱼中存在的生物转化产物。与我们的先前工作相比，对几种生物转化产物的识别信心得到了提高，其中O-葡萄糖醛酸-4MeBT（O-G-4MeBT）是一个典型的例子，下面将进行讨论。这可以归因于改进的分析工作流程，它提供了额外的分离能力和全面的MS2覆盖范围，即使对于低强度的生物转化产物也是如此。然而，除了分析上的进步外，嫌疑物列表本身的完整性在这里也起到了关键作用，特别是在识别N-结合产物方面。

O-G-4MeBT的识别展示了本研究中实现的识别信心的提高。在我们之前的工作中，缺乏MS/MS数据影响了其识别。在这里，增强的灵敏度（图S8）结合PASEF功能使得能够获得高质量的MS/MS谱图（图4c）。基于生物转化预测，O-G-4MeBT被认为是由4-MeBT的羟基化后进行葡萄糖醛酸结合产生的生物转化产物（图4a）。这种结构信息通过计算机模拟的MS/MS和CCS预测转化为预测的分析证据。所提出的结构通过检测到诊断性碎片m/z 150和132得到了实验验证，分别对应于OH-4MeBT和4MeBT（图4c）。葡萄糖醛酸基团碎片（例如，113）进一步支持了所提出的结构。此外，应用生物转化特异性过滤器也提供了对O-G-4MeBT的支持，即其在对照组中的缺失以及存在有意义的时间趋势（图4d1和2）。这些数据共同证实了羟基化后进行葡萄糖醛酸结合的假设，与之前的研究相比提高了识别信心。尽管成功识别了O-G-4MeBT的潜在生物转化反应，但由于母体分子上生物转化的位置多种多样（图4e2），仍可能存在几种位置异构体。为了评估这些异构体，采用了两种互补的方法。首先，嫌疑物筛查通过预测的分析证据比较了候选结构，包括计算机模拟的MS/MS和CCS值（图4e3）。然而，在这种情况下，预测和实验MS/MS及CCS值之间的差异太小，无法确定特定的异构体。这可以归因于母体化合物的紧凑结构，导致不同生物转化位置的3D构象相似。其次，考虑了保留行为和TIMS洗脱的正交实验灵敏度（1/K0）。如前一节所讨论的，通过将预测的保留时间与TIMS洗脱实验数据结合，提供了支持主要O-G-4MeBT异构体三唑环结合的证据（图3），将识别水平提升到了2b。因此，在这种情况下，嫌疑物筛查和计算机模拟工具对于生成和评估异构体假设很有价值，而主要异构体的确切位置分配主要依赖于正交实验证据。

除了计算机模拟的结构生成和分析证据的预测之外，还评估了嫌疑物/未知生物转化产物与母体或前一生物转化产物在生物转化序列中的CCS差异（ΔCCS %）作为注释过程中的辅助正交指标。例如，N-硫酸盐结合导致ΔCCS差异为15.2 ?，而N-葡萄糖醛酸化导致的差异为54.8 ?，这与近期文献中的趋势一致。由于生物转化引起的CCS变化取决于母体结构和修饰位点，ΔCCS并未被用作严格的过滤标准，而是作为辅助的信心支持参数，以减少误报注释。

尽管利用生物转化知识对于嫌疑物筛查至关重要，但代谢预测工具可能存在局限性。这些局限性包括它们依赖于预定义的生物转化规则，可能会遗漏某些反应；而在其他情况下，微小的结构差异可能会阻止预测。这在我们的先前研究中显而易见，尽管文献中报道了N-结合反应，但N-结合产物并未出现在嫌疑物列表中。在这种情况下，所使用的预测工具（Metabolite Tools, Bruker Daltonics）要求N-结合需要NH2基团，而母体BTs具有N–H基团。这种微小的结构差异阻止了对BTs最强烈生物转化产物的预测，该产物后来通过非目标分析才被识别出来。同样，某些结合反应，如涉及各种氨基酸的结合反应，也没有被预测到。这些局限性突显了专家评估的重要性，以识别缺失但合理的生物转化反应，并支持结合使用计算机模拟工具的速度和异构体预测能力以及专家知识和对目标生物体内已报道反应的彻底搜索。

总体而言，这些发现表明，当基于结构的计算机模拟预测与正交分析证据和专家评估相结合时，嫌疑物筛查可以支持全面的生物转化产物注释。通过嫌疑物筛查成功识别N-结合产物以及提高O-G-4MeBT的识别信心，展示了这种综合方法的价值。

生物转化信息驱动的非目标筛查：用于优先处理和注释未知生物转化产物的工作流程，以进行全面的异生物质组分析
实验设计和数据处理工作流程旨在利用可用的分析和生物转化证据的不同维度。如图S2所示，优先处理工具被依次应用，层层叠加证据以突出未知生物转化产物的生物转化相关性。控制样本的减去是第一步，对于识别暴露相关特征至关重要。图S14展示了该工具在4-MeBT样本上的应用。许多峰的强度较低（图S14d），但该工具也有潜力优先识别上调/下调的内源性化合物（图S14b）。在这种情况下，实验设计中包含对照组和时间间隔样本是有意为之，以提供生物转化证据来过滤潜在的生物转化产物。具体来说，应用了“对照组缺失”过滤器，确保只保留暴露样本特有的特征（图S14c）。“存在有意义的时间趋势”过滤器基于这样一个事实：生物转化产物的形成是生物体努力解毒外源物质的结果。

在通过控制样本减去进行初步优先处理之后，已通过嫌疑物筛查识别的特征被从进一步评估中移除。移除这些嫌疑生物转化产物后，剩下20个峰，表明可能存在新的未知生物转化产物。嫌疑物筛查被有意放置在工作流程的早期，以建立光谱特征知识库（图1B），随后支持了优先处理和注释。虽然在本研究中没有广泛使用，但该工作流程还包括了其他优先处理工具，如质量缺陷和同位素模式过滤。这些工具在特定情况下很有价值，例如在处理卤化化合物和/或具有独特同位素特征的化合物时。这类工具的加入增强了工作流程的灵活性，使其适用范围更广，而不仅仅局限于4-MeBT。

工作流程的一个关键组成部分是MS/MS谱图的评估。这一步提供了关于未知生物转化产物的宝贵生物转化证据和结构见解，有助于它们的优先处理和注释。通过将实验MS/MS数据与从1. 构建模块框架、2. 光谱特征知识库、3. 文献和4. 之前识别的生物转化产物中编译的特征片段进行比对，我们能够确定未知生物转化产物的潜在结构特征。例如，在4MeBT-439的情况下（图S17），观察到175 Da的中性损失，这是葡萄糖醛酸结合的特征，同时检测到与葡萄糖醛酸基团相关的片段（m/z 175、129、113、89和59），为葡萄糖醛酸化提供了有力证据。这种类型的MS/MS光谱过滤在优先处理过程中得到了BB和SCKB框架的指导，利用了关于母体化合物的现有知识、已知的生物转化反应和之前识别的生物转化产物，从而识别出未知生物转化产物中的子结构。

总体而言，优先处理工作流程的应用导致了29个特征的检测，这些特征无法通过嫌疑物筛查解释，代表了12个不同类别中的潜在新生物转化产物（表S3）。这些发现扩展了异生物质组的覆盖范围，并表明通过开发的平台可以揭示更多的低丰度生物转化产物。新生物转化产物的多种异构体的存在，如图S18所示，进一步突显了异生物质组的复杂性以及需要先进的分析和数据处理方法来进行它们的分离和识别。全面调查所有新的生物转化产物超出了本研究的范围，本研究的重点是开发一个用于全面异生物质组覆盖的稳健工作流程，以4-MeBT实验作为案例研究。相反，提供了选定的示例来展示工作流程在解决分析和数据处理挑战方面的有效性。虽然工作流程的几个组成部分设计为具有广泛的适用性，但需要进一步应用于其他外源物质，以完全确立其在更广泛化学领域的适用性。

从未知特征到新型生物转化产物结构：以4MeBT-263为例的注释工作流程
4-MeBT-263被选为代表性示例来演示注释工作流程。准确的分子式分配是这一过程中的关键第一步。将质量精度阈值从5 mDa降低到2 mDa显著减少了候选分子式的数量，从20个减少到7个，突显了分子式分配对质量精度的敏感性（表S4 A, B）。此外，我们采用了一种策略性的原子选择和子结构考虑方法，利用了生物转化研究的独特背景。这涉及对各种原子组合的系统性评估，考虑了潜在的生物转化反应，如硫酸盐中的硫结合、谷胱甘肽（GSH）、牛磺酸和半胱氨酸结合，或氨基酸结合中的氮结合。值得注意的是，在4-MeBT-263的情况下，缺乏指示含硫结合或其他已知II期反应的特征片段或中性损失（表S1），帮助排除了这些可能性。环和双键等效值（rdbe）作为额外的合理性标准，因为大多数生物转化反应会保持或增加rdbe值，与母体化合物及其子结构相比。BB和SCKB框架进一步通过突出未知生物转化产物中的潜在已知子结构来简化分子式分配。关于4-MeBT-263，优先处理工作流程已经通过MS/MS谱图和BB框架的评估指出了整个母体结构的保留（图5a,b）。更具体地说，特征性母体化合物片段（m/z 119和104）的存在以及质量差异（28 Da (?N2) 和 14 Da (?CH2) 强烈表明了该生物转化产物中保留了母体结构。检测到m/z 132，与母体化合物的m/z相对应，进一步强化了这一假设。结合这一结构约束，将可能的分子式进一步缩小到唯一一个（C14H12N3），满足定义的标准（表S4 C）。这证明了整合生物转化知识以细化分子式分配的有效性。尽管4-MeBT-263的体积显著大于母体分子，但在MS/MS谱图中未观察到典型的II期反应的特征片段或中性损失。这些观察结果，加上提出的分子式，强烈表明形成了4-MeBT二聚体。MS/MS谱图的详细分析（图5c）进一步支持了这一假设。

图5. 基于MS/MS的优先处理和4-MeBT-263在生物转化信息驱动的NTS工作流程中的结构阐明。(a) 4-MeBT的MS/MS谱图，突出显示了纳入光谱特征知识库（SCKB）的特征片段和中性损失。(b) 未知生物转化产物4-MeBT-263的MS/MS谱图。将此谱图与SCKB进行比对，揭示了关键的母体相关特征，包括母体m/z（132）、m/z 119和104的片段，以及28 Da (?N2) 和 14 Da (?CH2) 的诊断质量差异，共同表明了4-MeBT核心结构的保留。(c) 4-MeBT-263的MS/MS谱图解释。与m/z 132和104相关的结构（蓝色框）是在MS/MS过滤过程中推断出来的。详细的光谱分析支持了4-MeBT二聚体的形成。（*碎片化模式无法明确区分C–C和C–N键合；展示了一个代表性的二聚体结构。）高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

为了验证这一结构假设，我们进行了全面的文献搜索，以确定之前关于二聚体形成作为生物转化反应的报告。值得注意的是，有研究报道了双酚A类似物在人肝和鼠肝组分中的氧化二聚化（43），以及2-苯基噻吩S-氧化物在大鼠肝微粒体和体外CYP1A1孵育中的二聚化（44）。此外，还有报道指出GDC-0994通过C–C和C–N键合在大鼠胆汁和粪便中形成同源二聚体（45）。将所提出的反应与现有文献进行跨物种评估，进一步增强了4-MeBT二聚化的可能性。据我们所知，这项研究首次报道了斑马鱼胚胎中的二聚体形成。虽然这种生物转化途径不是观察到的主要途径（例如与N-磺化或N-葡萄糖醛酸化相比），但它有助于更全面地了解斑马鱼的异生物质代谢组，并强调了该物种执行此类反应的能力。总体而言，4-MeBT-263的阐明展示了如何通过集成工作流程优先处理并结构解析未知的外源代谢物，即使它们来源于不常见的生物转化途径（如二聚化）。

结论

本研究提出了一种多维分析和数据处理工作流程，用于更全面地表征暴露于外源物质的生物体的异生物质代谢组。通过结合正交分离模式（RPLC、HILIC和TIMS）与高分辨率质谱（HRMS）和面向生物转化的数据处理工具，该工作流程提高了生物转化产物的检测和注释效率。可疑化合物的筛选是我们方法的核心要素，它不仅有助于自信地识别生物转化产物，还促进了“构建模块”和“光谱特征知识库”框架的开发。这些框架为未知生物转化产物的分析提供了模块化视角，并提供了有助于其优先级排序和注释的结构信息。同时，所提出的分子式分配策略通过结合生物转化相关的结构约束进一步简化了注释过程。

以4-MeBT为例，该工作流程提高了先前确定的4-MeBT生物转化产物的识别信心（6），这得益于TIMS带来的信噪比提升以及PASEF提供的全面MS/MS覆盖范围。此外，通过利用TIMS的1/K0洗脱顺序作为色谱保留时间的正交标识符，实验结果支持了我们之前关于O–S-4MeBT和O-G-4MeBT异构体结合位点的结构假设。至关重要的是，基于TIMS的工作流程的灵敏度和过滤能力的提升，使得29种先前未检测到的生物转化产物得以发现，从而扩展了我们对4-MeBT代谢途径的理解。此外，本文首次报道了4-MeBT二聚体（4-MeBT-263）作为斑马鱼中的生物转化反应，说明了该工作流程解析较少见生物转化途径的能力。

总体而言，这些结果展示了整合多维分析证据、实验中的生物转化背景以及IMS-HRMS方面的专家知识在揭示外源物质复杂代谢转化中的重要作用。该工作流程为改进复杂生物系统中的生物转化产物发现和注释提供了实用基础，并可能有助于更深入地研究生物转化产物的形成、解毒过程和外源物质风险评估。将该工作流程应用于其他外源物质将有助于进一步明确其在不同化学类别和生物转化场景中的广泛适用性。