通过光化学诱导的动态核极化检测致癌物苯并[a]芘：将液态1H核磁共振与空间分辨成像技术相结合

《Analytical Chemistry》：Detection of the Carcinogen Benzo[a]pyrene through Photochemically Induced Dynamic Nuclear Polarization: Linking Liquid-State 1H NMR with Spatially Resolved Imaging

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苯并[a]芘（BaP）是一种具有显著环境存在性和毒理学意义的多环芳烃（PAH），被归类为1类致癌物。然而，在生物系统中无创地追踪BaP存在重大挑战。在这项研究中，我们介绍了一种新型的非侵入性NMR和MRI检测方法，该方法利用光诱导的动态核极化（photo-CIDNP）效应来增强信号，从而在灵敏度、对比度和空间分辨率方面达到新的极限。液态1H NMR显示，在存在荧光素（作为光敏剂）的情况下，BaP在光照下的photo-CIDNP信号显著增强，证实了超极化现象。此外，在模拟生物膜的十二烷基磷脂胆碱（DPC）胶束中，BaP信号的增强证明了在复杂、异质生物系统中使用photo-CIDNP的可行性。随后，该方法扩展到基于MRI的化学位移成像（CSI），以空间映射来自编码体素的自由基极化信号。CSI图像的映射表明，光诱导信号仅限于光照区域，从而证实了光照与信号强度增加之间的空间相关性，为将其作为1H MRI中的诊断工具奠定了基础。这项研究提供了1H photo-CIDNP MRI作为一种敏感方法的实际应用，可用于无创监测环境毒素，并建立了光化学与体内分子水平MRI可视化之间的牢固联系。

**引言**
苯并[a]芘（BaP）是一种多环芳烃（PAH），由于其明确的致癌性和广泛的环境存在性，被国际癌症研究机构（IARC）归类为1类人类致癌物。(1) 它主要通过不完全燃烧过程进入环境，包括工业排放、车辆尾气和生物质燃烧。(2) 人类暴露途径包括吸入受污染的空气、从受污染的表面皮肤吸收，或摄入受污染的食物和水。(3) 吸烟是BaP暴露的主要来源，其中侧流烟雾中的浓度为每支香烟52至95纳克，比主流烟雾中的浓度高出3倍。(4) BaP在体内通过细胞色素P450酶的代谢激活，形成7β, 8α-二羟基-9α, 10α-环氧-7, 8, 9, 10-四氢苯并[a]芘（BPDE），后者与DNA形成共价加合物，引发突变并启动致癌转化。(5) 此外，几种氧化的BaP衍生物，包括环氧物、二羟二醇和醌类，也可以在体内酶促生成，导致致癌异常。(6) 除了其已知的致癌性外，BaP及其氧化衍生物还会引起表观遗传毒性、神经毒性和致畸性，同时还会导致生殖毒性和氧化应激。(7) 在血清和其他生物流体中，BaP的毒性水平仅在纳克范围内（0.4–2 ng/mL）。(8,9) 在吸烟者中，其生物活性中间体BPDE作为蛋白质加合物的浓度检测范围为8.87–33.55 ng/mL，表明BaP衍生的基因毒性中间体的负担增加。(10) BaP及其生物活性代谢物可能随时间在各种组织和细胞区室中积累。然而，目前尚无法在体内无创地检测各种组织和器官中的BaP。

虽然磁共振方法（如核磁共振（NMR）具有独特的化学特异性，而磁共振成像（MRI）可以无创地检测体内的代谢物，但由于其固有的低灵敏度（受玻尔兹曼分布限制），生理相关浓度的BaP远低于传统NMR和MRI的检测限。(11) 然而，这些限制可以通过超极化技术来缓解，这些技术可以选择性地增强NMR谱中的特定峰，从而能够检测低丰度的生物相关分子。

**光诱导的动态核极化（photo-CIDNP）**是一种先进的NMR超极化方法，其中在可见光照射下会产生自旋相关自由基对（SCRPs）。在液态NMR中，增强通常是由于经典的自由基对机制（RPM），依赖于自旋分离并需要自由扩散。(12) Photo-CIDNP NMR已成功应用于各种氨基酸（例如色氨酸、酪氨酸、组氨酸、甲基化赖氨酸和甲硫氨酸）(13) 和蛋白质系统（例如黄素蛋白、牛α-乳白蛋白、胰蛋白酶抑制剂、磷酸甘油酸激酶和小牛γ II晶体蛋白）(14,15)。然而，迄今为止尚未证明Photo-CIDNP NMR在检测毒素（如BaP及其代谢中间体）方面的应用。

尽管具有潜力，但Photo-CIDNP技术在MRI中的应用仍大部分未被探索。MRI是一种多功能且无创的成像技术，由于其出色的空间分辨率和软组织对比度，在临床和研究环境中得到广泛应用。然而，其主要限制是灵敏度低，这是由于热极化下产生的核磁信号较弱，限制了其检测低浓度生物标志物或微妙分子变化的能力。产生自旋超极化，提供非玻尔兹曼自旋种群，可以克服这一问题。几种超极化方法，如动态核极化（DNP）、(16?25) 自旋交换光泵浦（SEOP）、(26?33) 和对氢诱导的核极化（PHIP），(34?37) 已被应用于MRI。Photo-CIDNP超极化方法可能提供一种利用光驱动过程增强核自旋极化的有前景的方法，并能在MRI中提供显著的信号增强。它们在温和条件下运行，无需低温或自由基引入，允许快速、可重复的极化循环，使其成为未来适应MRI的候选方法。之前已经使用3-氟-dl-酪氨酸(38,39) 和氟化药物法匹拉韦(40) 在涉及19F核的系统中展示了Photo-CIDNP增强的MRI。然而，到目前为止，仅有一项研究报道了1H Photo-CIDNP MRI，使用的是2,2-二吡啶和N-乙酰色氨酸的标准溶液(41)。

作为一种多环芳烃，BaP可能通过自由基对机制表现出Photo-CIDNP效应，在此过程中充当电子供体。本研究的目的是探讨BaP与光敏剂荧光素（RF）结合后是否可以在液态1H NMR实验中发生Photo-CIDNP并产生增强的信号强度，从而确定通过光诱导的核自旋超极化检测BaP的可行性。我们首先分析了BaP浓度和磁场强度的影响，以确定BaP和RF系统的最佳Photo-CIDNP条件。随后，将BaP和RF系统结合到DPC胶束中，模拟生物膜环境，研究在更接近生理条件的情况下是否可以发生BaP的信号增强。此外，首次使用Photo-CIDNP MRI方法通过化学位移成像来空间映射BaP的自由基极化信号。这种新方法代表了将分子自旋动力学与成像相结合的开创性尝试，可能为生物相关系统中的光响应MRI对比方法奠定基础。

**实验方法**
**化学品**
BaP从Supelco（美国）购买。除非另有说明，所有其他化学品均从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。

**样品制备**
对于液态1H Photo-CIDNP NMR实验，准备了10 mM的BaP储备溶液，溶解在二甲基亚砜-d6（DMSO-d6，99.9%）中。每次1H NMR和1H-MRI实验前，都准备了新鲜的2 mM RF溶液在DMSO-d6中。对于1H Photo-CIDNP NMR测量，通过将BaP和RF混合在DMSO-d6中制备样品，保持RF浓度为0.2 mM，同时调整BaP浓度，以实现BaP:RF的比例为1:1、2:1、3:1、5:1、7:1和10:1。基于系统的Photo-CIDNP效率选择的5:1比例进一步用于DPC基胶束系统的1H Photo-CIDNP NMR和MRI实验。

为了模拟生物膜环境，将BaP（1 mM）、DPC（5 mM）和DPC-d38（10 mM）溶解在约10 mL的氯仿中。使用旋转蒸发器在313.15 K、130 mbar和120 rpm下蒸发氯仿，获得均匀的BaP掺杂DPC胶束薄膜。使用质子和氘代DPC的混合物来超过临界胶束浓度，同时最小化1H NMR谱中的背景质子信号。通过向干燥的胶束薄膜中加入D2O中的RF（0.2 mM）水溶液，制备了最终的BaP、RF、DPC和DPC-d38混合物。轻轻涡旋混合物并在室温下平衡15分钟。

**光照设置**
对于液态1H Photo-CIDNP NMR，使用445 nm二极管激光器（MDL-III-445-1000 mW，Ultralasers Inc.，加拿大；输出功率：900 mW，多模，TTL调制）对样品进行光照。激光束通过Thorlabs（德国Bergkirchen）的光纤（1000 μm，FP1000URT-0.5 NA）引导进入溶液，该光纤可通过NMR管（Figure 1A）降低。激光以调制模式运行，并由NMR控制台直接触发。控制台的TTL信号通过逆变器路由，实现光照射与脉冲序列的精确同步（Figure 1B）。对于1H Photo-CIDNP MRI，使用445 nm、600 mW的激光束通过插入10 mm NMR管底部的光纤传递，以确保样品的局部光照。激光以连续波模式使用。该设置允许在整个CSI采集过程中不间断地照射，从而在空间分辨的体素上实现一致的光诱导极化效应。

**图1**
图1. 用于Photo-CIDNP NMR研究的光照设置和脉冲序列。(A) 溶液中浸入的NMR管和玻璃插件；(B) Photo-CIDNP设置的示意图。光纤插入含有液体样品的NMR管中，使光可以直接传递到NMR光谱仪。激光由NMR控制台通过逆变器触发，确保光闪与NMR脉冲序列之间的同步；(C) 用于1H Photo-CIDNP NMR的脉冲序列，包含一个预饱和脉冲序列（极化消除（PE）块，用于在光激发前抑制背景。 (42) 使用每秒一次的破坏性相位循环进行1H Photo-CIDNP NMR光谱的采集。

**液态1H Photo-CIDNP NMR**
在400和600 MHz（Bruker Biospin GmbH，德国）下进行了BaP和RF在DMSO-d6中的1H Photo-CIDNP NMR测量，分别配备了5 mm宽带逆向（BBI）和三重共振宽带逆向（TBI）探针。在400 MHz光谱仪上进行了BaP和RF在DPC基胶束系统中的1H Photo-CIDNP NMR测量。每次实验前都进行手动探针调谐和匹配（摆动），以确保最佳射频（rf）性能。所有测量均在293 K下使用Bruker BVT3000控制单元进行。

用于1H Photo-CIDNP NMR的脉冲序列如图1C所示。该序列包括一个极化消除块，其中包含一个预饱和脉冲序列，随后是一个z梯度，用于抑制自旋回波的形成。(42) 预饱和用于在光激发前消除样品中的所有初始玻尔兹曼极化。为了避免从单独实验中获得的明暗光谱相减时产生的误差，直接使用破坏性相位循环记录Photo-CIDNP差分光谱，在每次扫描时施加激光照射，以直接生成暗减去光的1H Photo-CIDNP差分光谱。(42) 每个1H Photo-CIDNP NMR光谱通过32次扫描获得，其中16次扫描有光照，16次扫描无光照，每次光照扫描的激光曝光时间为0.5秒。进行了10次重复的多扫描采集，最终1H Photo-CIDNP NMR光谱是通过总结所有10次实验得到的。

所有光谱均使用12000和8000 Hz的谱宽在600和400 MHz下获得，接收器增益为101，人工线宽为2 Hz，循环延迟为4秒，光照后的延迟为0.5秒。

**DFT计算**
所有量子化学计算均使用ORCA程序包（版本6.1）进行。(43) 几何优化使用UKS B3LYP-D4方法（44?46）和RIJCOSX近似（47）以及pcJ-3基组进行。(48) 采用CPCM溶剂模型包括DMSO的溶剂效应。(49) 对SCF程序（TightSCF）和几何优化（TightOpt）应用了严格的收敛标准。使用ORCA的EPRNMR模块在优化后的几何结构上进行单点计算，获得超精细耦合常数和g-张量。对于超精细耦合，所有氢核的集合都被明确包括在内（Nuclei = ALL H {AISO, ADIP, Rho, AOrb}），确保了各向同性费米接触项、偶极贡献、核处的自旋密度和轨道贡献的计算。g张量计算使用了GTensor True关键字。BaP和RF在DMSO-d6中的photo-CIDNP MRI1H实验使用了Bruker 300 MHz垂直孔径NMR系统（Bruker Biospin GmbH，德国）进行。使用了一个内径为10毫米的鸟笼式发射/接收射频线圈。工作站连接到一个运行ParaVision 5.1成像软件的Linux操作系统（Bruker Biospin GmbH，德国）。在数据采集之前，通过磁屏蔽优化了磁场均匀性，然后进行了共振频率校准和发射器及接收器增益的调整。所有测量都在293 K下进行。对于MRI，使用了BaP和RF比例为5:1的溶液。每次测量都从多切片正交梯度回波序列开始，以确定样品的位置并选择所需的区域。使用快速采集与松弛增强（RARE）序列（50）来获取参考图像。RARE通过每次重复获取多条k空间线，从而实现更快的图像采集。（50）RARE序列使用的测量参数如下：回波时间（TE）= 8.5 ms，有效回波时间= 18.06 ms；重复时间（TR）= 1000 ms；扫描次数（ns）= 1；总扫描时间= 128 s；RARE因子= 4。视野（FOV）为4 cm，矩阵大小为256 × 256。使用CSI在自旋回波层选择模式下获取多体素MR光谱信息。CSI采用两个正交相位编码步骤和脉冲梯度，在采集过程中捕获纯光谱回波，这与成像中使用的常规读出梯度不同。（51）通过同时获取空间和光谱信息，获得了空间分辨的多体素光谱，从而得到空间分布图。自旋回波序列包含90°和180°脉冲以及x和y方向的阶梯式相位编码梯度脉冲，用于确定像素位置。水抑制射频脉冲的带宽较窄，集中在水峰的共振频率上，以饱和水信号。测量参数如下：TE = 15 ms；TR = 1000 ms；矩阵 = 32 × 32；FOV = 40 × 40 mm2；切片厚度 = 4 mm。多体素MR光谱信息是使用CSI在自旋回波层选择模式下获取的。CSI采用两个正交相位编码步骤和脉冲梯度，在采集过程中捕获纯光谱回波，这与成像中使用的常规读出梯度不同。（51）通过同时获取空间和光谱信息，获得了空间分辨的多体素光谱，从而得到空间分布图。自旋回波序列包含90°和180°脉冲以及x和y方向的阶梯式相位编码梯度脉冲，用于确定像素位置。水抑制射频脉冲的带宽较窄，集中在水峰的共振频率上，以饱和水信号。测量参数如下：TE = 15 ms；TR = 1000 ms；矩阵 = 32 × 32；FOV = 40 × 40 mm2；切片厚度 = 4 mm；ns = 256。数据被重建为32 × 32矩阵，并进行线性平滑处理以便显示。对于激发和重新聚焦，使用了带宽为5645.5 Hz的Sinc3脉冲。从2048个点的回波采集中获得了8 kHz的谱宽和每点1.96 Hz的谱分辨率，持续时间为255.59 ms。使用水共振磁屏蔽来实现选定体积内的最佳磁场均匀性。应用了持续时间为625 ms的可变功率射频脉冲和优化的松弛延迟（VAPOR）抑制方案，以有效饱和水信号。使用了7个Hermite形状的CSI模块，脉冲间的射频延迟分别为150、80、160、80、100、37.2和15 ms。激发偏移为?75 Hz（?0.1 ppm），射频带宽为900 Hz。使用ParaVision 5.1成像软件（Bruker Biospin GmbH，德国）的CSI可视化工具对每个体素的CSI光谱和光诱导信号进行了映射。

结果与讨论
BaP的1H Photo-CIDNP NMR
首要目标是确定在RF光敏剂存在的情况下，BaP是否在光激发下表现出photo-CIDNP效应。图2A显示了在445 nm激光照射下，使用相位破坏性脉冲序列测量的BaP和RF的1H photo-CIDNP NMR光谱。该图表明，BaP的光谱显示几乎所有质子都表现出吸收极化。在光照下的信噪比分别约为49（H-6）、15（H-1和H-7）、8（H-12）和11（H-3）。通过2D COSY和1H–13C异核单量子相干（HSQC）实验确认了BaP的1H NMR信号（见补充图S1）。RF质子的photo-CIDNP模式与之前报道的异噁嗪系统的结果一致。（42,52?54）
图2
（A）在400 MHz和293 K下，使用445 nm（900 mW）激光照射（光谱红色）和黑暗中（光谱黑色）记录的BaP（1 mM）和RF（200 μM）在DMSO-d6中的1H photo-CIDNP NMR光谱。标出了BaP的特定质子共振的分配，突出了photo-CIDNP光谱中的超极化效应。在7.7 ppm处出现了一个归因于RF光降解产物的信号，并用向下三角形（▼）标记。在5.4至6.3 ppm范围内观察到的信号仅来自BaP的氧化产物，在黑暗中无法检测到，用向上三角形（▲）标记。
（B）涉及BaP和RF系统photo-CIDNP中的自由基对机制的可能反应途径。

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观察到的液态photo-CIDNP的起源可以通过经典自由基对机制（RPM）来解释，（39,55），该机制发生在BaP作为电子供体和RF作为电子受体时形成自由基对（图2B）。在光照下，RF首先被转移到其激发单重态，然后发生系统间跃迁到三重态，在那里它随后与BaP发生光诱导的电子转移，从而生成一个由三重态产生的自由基对。在通气环境中，RF的三重态也可以将能量转移到3O2，产生单态氧（1O2，II型途径），这与电子转移竞争并可能降低自由基对的产率。根据Kaptein的符号规则（Γ = μ·ε·Δg·a），（56）从BaP观察到的photo-CIDNP效应表明自由基对是由三重态前体形成的（μ > 0），并且偶联重组占主导地位（ε > 0）。密度泛函理论（DFT）计算（见补充表S1）得出了几乎所有BaP质子的负超精细耦合常数（HFCCs）（a < 0）和Landé g因子值2.0026，小于RF的g因子（Δg < 0）。这些参数预测BaP的质子H-1、H-3、H-4、H-5、H-6、H-7、H-9、H-10和H-12表现出吸收极化，而质子H-2、H-8和H-11表现出发射极化。
观察到的BaP中的photo-CIDNP增强的幅度通常遵循HFCCs的趋势。进行了DFT计算以确定HFCCs，结果表明质子H-6、H-12、H-1和H-3由于相对较大的HFCCs而显示出强烈的正信号，而H-2、H-5和H-4显示出较弱的效果，这与较小的耦合一致。质子H-10和H-11没有极化，这与它们接近零的HFCCs（分别为?0.68和0.12 MHz）相符。未观察到H-9的预期正极化，因为其共振与H-8和黄素质子的共振重叠，两者都表现出发射极化，导致CIDNP光谱中的信号抵消（图2A）。有趣的是，在photo-CIDNP NMR光谱中，我们在δH ≈ 5.4–6.3 ppm范围内观察到额外的强烈发射信号，这些信号无法归因于BaP或RF（图2A）。在光照下，这些发射信号的信噪比分别在6.3 ppm处约为60，在5.35 ppm处约为36。为了合理解释这些信号，考虑BaP的氧化行为是重要的。已知BaP会氧化生成各种氧化衍生物，包括环氧物、二羟二醇、酚类和醌类。根据Miller和Ramos的研究，（6）几种氧化的BaP物种可以在体内通过酶的作用形成。然而，在我们的系统中，RF的光照可能通过黄素激发态到三重态氧分子的能量转移促进单态氧（1O2）的形成。已经证明，单态氧可以在没有酶的情况下氧化BaP，生成致突变产物。（57）之前，Lee-Ruff等人（58）表明，醌类衍生物可以通过光氧化和单态氧介导的反应从BaP产生。因此，图2A中观察到的未分配的发射photo-CIDNP信号很可能来源于BaP的一个或多个光氧化产物。这些发射峰仅出现在photo-CIDNP光谱中，并且随着照射时间的延长而增强，如补充图S3所示。这种时间增长表明在测量过程中样品内逐渐形成了光生成的氧化产物，这与它们在持续光照下的积累一致。当在光照前通过氮气吹气对BaP-RF溶液进行脱气时（补充图S4），没有观察到这些发射photo-CIDNP信号，这与氧依赖的氧化过程一致。
为了确定这些额外发射信号的来源，我们检查了一系列可能的BaP氧化产物（见补充图S5），并选择了几种可能在δH 5.4–6.3 ppm范围内引起质子共振的候选物。对于这些物种，使用DFT计算了HFCCs（见补充表S1和图S2）。根据Kaptein的符号规则，对于具有正HFCCs的质子，预期会有发射photo-CIDNP效应，且信号强度应与耦合常数的大小成比例。（56）因此，特别是较大的HFCC值负责观察到的不同物种的信号。在检查的各种二醇和氢醌衍生物中，benzo[a]pyrene-1,6-hydroquinone（H-1: 104.08 MHz和H-6: 63.67 MHz）、benzo[a]pyrene-6,12-hydroquinone（H-6: 19.75 MHz和H-12: 128.25 MHz）和benzo[a]pyrene-3,6-hydroquinone（H-3: 76.72 MHz和H-6: 48.18 MHz）与观察到的发射photo-CIDNP信号最为吻合（见补充图S5）。提出的光化学途径通过反应（方程式1–5）合理解释了这些观察结果，连接了单态氧的形成、BaP的氧化、自由基对的产生和自旋选择性反向电子转移。这一序列可以示意性地表示如下（缩写：BaPhq= BaP的氢醌衍生物；BaPox = BaP的其他可能氧化产物；1O2/3O2 = 单态/三重态氧）：
RF3+O23→RF+O21
RF3+O23→RF+O21
(1)O21+BaP→BaPhq+BaPox
O21+BaP→BaPhq+BaPox
(2)RF3+BaPhq→[RF3•??BaPhq•+]
RF3+BaPhq→[RF3•??BaPhq•+]
[RF3•??BaPhq•+]?[RF1•??BaPhq•+]
[RF3•??BaPhq•+]
[RF1•??BaPhq•+]
→RF1+BaPhq
[RF1•??BaPhq•+]→RF1+BaPhq
(5)
为了检查氧化产物是作为少量污染物存在还是在光照过程中形成的，我们使用传统的单脉冲（zg）序列比较了BaP和RF在黑暗中的热极化1H NMR光谱，在光照前和光照后。在黑暗中，使用32次扫描记录的光谱（补充图S6A）中未检测到对应于BaP的氢醌衍生物的信号。然而，当扫描次数大幅增加（ns = 4096）后，在光照后的黑暗中可以检测到BaP的氢醌衍生物的信号（补充图S6B）。我们的结果表明，这些氧化衍生物是在光照过程中形成的，并且含量非常低。信噪比和积分分析表明，光生成的氧化产物的浓度约为4 μM（1.1 μg/mL）。尽管含量很低，但仅使用32次激光调制扫描获得的photo-CIDNP光谱仍显示出这些光生成氧化产物的明显发射信号增强（图2A）。这种显著的光学放大与DFT计算预测的具有非相邻位置羟基的氢醌型BaP衍生物的异常大的HFCCs完全一致（1,6-、3,6-和6,12-取代的物种），其耦合范围约为50–130 MHz。预测强耦合的质子将在δH 5.4–6.3 ppm范围内共振，这与实验中的photo-CIDNP观察结果非常吻合（补充图S5）。
由于氢醌型BaP代谢物是BaP代谢中的关键氧化中间体，（58）通过photo-CIDNP检测到它们在生物学上具有重要意义，因为这些代谢物参与氧化还原循环并产生亲电物种，这些物种可以加成DNA或生成活性氧物种，这与BaP诱导的突变和致癌作用有关。（59,60）因此，我们的工作为不仅在低浓度下检测BaP，而且还能通过photo-CIDNP信号增强在生物学相关样品中检测其代谢物提供了新的机会。

BaP在1H Photo-CIDNP NMR中的浓度依赖性
为了分析photo-CIDNP的效率作为BaP浓度的函数，在400 MHz（9.4 T）下，使用DMSO-d6，在BaP和RF的摩尔比为1:1、2:1、3:1、5:1、7:1和10:1的情况下，保持RF浓度恒定（200 μM），获得了光照下的1H photo-CIDNP NMR光谱，如图3所示。在BaP浓度从200到1400 μM的范围内，观察到RF质子在7.9 ppm处的发射信号。然而，当BaP浓度增加到2000 μM时，这些射频信号逐渐消失。在较高BaP浓度下射频发射信号的丧失可能是由于与相反相位的BaP极化发生重叠所致。图3显示了在400 MHz和293 K下，使用445 nm激光（0.9 W；每次扫描0.5秒）记录的BaP和RF（200 μM）在DMSO-d6中的1H photo-CIDNP NMR光谱。光谱从下到上排列，对应BaP:RF的摩尔比为1:1、2:1、3:1、5:1、7:1和10:1。信号分配与BaP分子结构中的质子编号相对应（见图1）。一个归属于RF光降解产物的信号出现在7.7 ppm处，并用向下三角形（▼）标记。在5.4–6.3 ppm处观察到的信号仅由BaP的氧化产物产生，用向上三角形（▲）标记。

有趣的是，BaP的整体photo-CIDNP信号强度并没有像预期的那样在10:1的比例下继续增加（见图3和补充图S7）。相反，与中间比例（2:1、3:1、5:1和7:1）相比，信号强度略有下降。此外，假设归属于BaPhq的5.4–6.3 ppm处的发射photo-CIDNP信号显示出与BaP相似的光CIDNP强度趋势。对于所有物种，随着BaP浓度的增加，BaP的极化首先增强，这是由于自由基对形成的量子产率增加，从而更有效地与其他3RF衰变途径竞争。BaP浓度的进一步增加加速了BaP自由基阳离子和中性BaP之间的简并电子交换（自交换），这种交换在较高BaP浓度下变得更快，使得CIDNP抵消效应更加明显。可以写出如下反应：

BaP•++ → BaP+ + BaP• + BaP•++ → BaP+ + BaP•

观察到photo-CIDNP效应有一个明显的浓度依赖性限制：在电子供体分子的高浓度下，超极化转移变得效率低下，导致photo-CIDNP信号强度降低。然而，在生物学相关的系统中，分析物的浓度通常在微摩尔到纳摩尔范围内，此时photo-CIDNP实验显示出更高的效率。

磁场依赖性：在400 MHz（9.4 T）和600 MHz（14.1 T）下获得的BaP和RF的1H photo-CIDNP NMR光谱显示在补充图S8中。在400 MHz下获得的1H photo-CIDNP光谱显示，与600 MHz相比，BaP的质子信号强度更强。在一个简化的场景中，所有自旋-自旋相互作用都是各向同性的，并且交换常数Jex = 0，当电子塞曼频率差Δωe = ΔgμBB等于有效超精细耦合的一半时，即BLC ≈ a/(2μB|Δg|），会发生相关的高场能级交叉（LC），这会关闭仅继承纯自旋向上或自旋向下配置的状态的相干演化。（62,63）这是液体中Δg驱动的S-T0混合的经典高场“匹配条件”。（64）远高于这个匹配场强（如这里的9.4–14.1 T）时，Δωe ? a，相干S-T0混合变得不那么有效，因此Δg对CIDNP的贡献随着B的增加而减少。此外，在较高场强下，由例如g张量的各向异性驱动的电子-自旋松弛变得更加显著，这会破坏电子-自旋相干性，（63）可能会进一步降低14.1 T相对于9.4 T时的自旋排序效率。这些松弛机制增加了自旋系统本征态之间的种群转移，导致整体种群更加均匀，没有偏好特定的1H自旋态。（63,65）这可能是14.1 T时photo-CIDNP信号减弱的原因。

为了研究在更接近生理环境的条件下是否可以实现BaP的photo-CIDNP信号增强，将BaP/RF系统掺入十二烷基磷脂胆碱（DPC）胶束中。DPC胶束被广泛用作磷脂酰胆碱双层的良好表征模型，这是人类细胞膜中最丰富的磷脂类别，并且可以容易地掺入小亲水分子。（66?68）基于这些原因，选择DPC作为类似磷脂胆碱的胶束宿主来溶解BaP并再现两性离子膜界面。在本研究中，表面活性剂浓度保持在15 mM，远高于报道的DPC的临界胶束浓度（cmc）约1.1 mM。（69）假设DPC胶束的聚集数为75–80，（70）1 mM的BaP浓度大约相当于BaP相对于胶束的5倍化学计量过量。由于BaP的π电子系统引起的环电流效应，DPC质子的NMR信号可以根据环相对于单个DPC片段的质子的方向和距离而向上或向下移动。诱导的化学位移变化的幅度可以用来估计胶束中芳香环的平均位置。

对单个DPC片段（沿表面活性剂分子的长轴绘制；见图4）的分析表明，BaP分布在疏水核心和靠近F和H片段的界面“屏障”层之间。与疏水核心中的变化（Δδ ≈ 0.01 ppm）相比，DPC脂质质子的F和H基团的相对较大位移（Δδ = 0.04和0.03 ppm）表明BaP在界面区域的浓度较高。没有检测到DPC脂质质子的头基团E和D的化学位移变化，表明BaP与DPC的极性头基团没有显著相互作用。核黄素对所有DPC片段引起的化学位移变化比BaP大得多且更广泛（见图4；Δδ ≈ 0.07–0.11 ppm），表明涉及疏水链和头基团区域的更强相互作用。与其他胶束和囊泡系统类似，（71,72）这种模式与核黄素在DPC胶束的界面区域定位一致，介于极性头基团和疏水核心之间，尽管化学位移分析仍然是半定量的，并不提供唯一的结构模型。

在DPC-d38（约66.66%）胶束中嵌入BaP和RF的1H photo-CIDNP NMR在400 MHz下进行。图5显示了在没有（上）和有（下）DPC胶束的情况下BaP的photo-CIDNP信号强度的比较。BaP在几乎所有质子信号中都表现出强烈的极化，并且在胶束环境中吸收信号增强。将BaP和RF嵌入DPC胶束中，导致BaP的photo-CIDNP信号增强了约5倍，相比于在均匀水溶液中的BaP/RF系统。这种增强表明DPC胶束的脂质相促进了SCRP的形成和稳定，通过提供一个受限且部分有序的环境，促进了BaP和RF之间的紧密接近和有利取向，并限制了它们的相对平移扩散，从而延长了自由基对的寿命。（73）在DPC胶束存在下观察到的BaP芳香质子的向上位移表明磁屏蔽增加。类似的胶束诱导的向上位移也已在非离子胶束中的其他多环芳烃和芳香探针中报告，并被解释为更深入渗透到表面活性剂层或胶束核心的标志。（74?77）

先前的研究已经证明了胶束环境对蛋白质中photo-CIDNP增强的影响。（78,79）值得注意的是，一项关于LytA衍生物肽的研究调查了DPC胶束浓度增加对酪氨酸残基photo-CIDNP信号强度的影响，表明胶束微环境调节了特定芳香侧链的局部可访问性和动态行为，导致LytA衍生物肽的β-发夹结构向α-螺旋结构的转变。（80）这些发现支持了基于脂质的组装可以通过空间限制反应伙伴并影响它们在胶束内的取向和移动性来改变自旋动力学的观点。因此，胶束微环境可能作为一种催化基质，促进更有效的自旋极化转移，使其成为生物系统中膜辅助超极化研究的有希望的模型。

应该注意的是，在含有表面活性剂的photo-CIDNP NMR实验中，没有检测到氧化BaP物种的形成。（5）众所周知，脂肪酸和磷脂是单线态氧1O2的有效物理淬灭剂，（81,82）在脂质环境中显著缩短了其寿命，与在体D2O中相比。（83）在DPC胶束中，核黄素和BaP都位于疏水胶束域内，因此预计单线态氧主要在脂质域内产生，（84）在那里周围的酰基链的快速淬灭超过了扩散到其他目标的能力。（85）

作为下一步，我们将photo-CIDNP诱导的信号增强与MRI结合起来，以实现来自BaP的自由基极化信号的空间分辨映射。为此，我们应用了自旋回波薄片选择模式下的化学位移成像（CSI），以获得图像上的多体素光谱的同时空间和光谱分辨率。选定的峰值图提供了图像上单个信号的空间分布。图6显示了在含有BaP（1 mM）和RF（200 μM）的DMSO-d6溶液中照明下获得的图像和光谱矩阵。从每个体素获得了高分辨率光谱，每个体素大约为18.75 μL。从突出显示的体素中获取的代表性光谱显示在图6B中。从光谱中可以看出，在连续光照下，与黑暗条件相比，BaP质子信号（位于1H位置6、7、1和3）明显增强。叠加在T2加权RARE图像上的体素图显示了来自BaP位置6的质子的信号强度在光投影区域内的局部增加，在CSI颜色图（图6A中心）中清晰可见。相比之下，在黑暗条件下，残余的DMSO-d6信号在3.36 ppm处保持均匀，没有增强，作为非photo-CIDNP效应的内部参考，导致整个样品中的信号模糊（图6A右侧）。这些信号与BaP的指定质子位置相符，表明成功检测和映射了光诱导的核自旋极化。

图6显示了在含有BaP（1 mM）和RF（200 μM）的DMSO-d6溶液中记录的photo-CIDNP增强CSI的结果，记录在300 MHz和293 K下。（A）T2加权RARE图像和光（445 nm，0.6 W，连续照明）的投影（左）以及照明下位置6的BaP增强信号的CSI体素强度阈值（中），以及黑暗条件下残余DMSO-d6的非photo-CIDNP信号（右），这些信号被重建为颜色图并叠加在T2加权RARE图像上使用Bruker CSI可视化工具。（B）在照明下的CSI光谱矩阵显示（左）和在黑暗和光照条件下放大的突出显示体素（光投影位置）的光谱（分别用黑色和红色表示）。信号分配对应于BaP和RF的质子位置。残余的DMSO-d6信号用黑色星号标记。归属于光降解产物的信号出现在1.9 ppm处，用黑色三角形标记。CSI数据记录的TR = 1000 ms；TE = 15 ms，切片厚度为3 mm。使用的光谱宽度为8 kHz（26.7 ppm），16 × 16矩阵被重建为32 × 32体素。

我们的结果表明，CSI与photo-CIDNP结合使用，可以在1H-MRI中实现光激活自旋极化的空间分辨映射。在突出显示的体素中观察到的局部信号增强与预测的照明位置直接相关，这表明光诱导的CIDNP（Photo-CIDNP）的产生是空间上受限的，并且对光照非常敏感。能够在如此微小的体积（约18.75微升）内检测到光诱导的CIDNP信号增强，为未来利用MRI技术检测生物系统中的毒素开辟了令人兴奋的应用前景。

**结论**
本研究展示了光诱导的CIDNP在BaP和RF体系中的效应，揭示了在DPC胶束存在下更为明显的极化模式。胶束环境促进了更有效的自由基对相互作用，从而显著增强了信号强度。通过密度泛函理论（DFT）计算得到的超精细耦合常数和自旋密度分布表明，氢醌类物质可能是导致光照下出现额外发射峰的氧化衍生物。值得注意的是，这些物质在浓度极低的情况下仍能通过光诱导的CIDNP被清晰地检测到，这得益于其识别瞬态光化学中间体的卓越敏感性。此外，通过化学位移成像（CSI）进行的空间映射提供了光诱导核极化分布的独特可视化结果，凸显了光诱导的CIDNP MRI作为研究生物系统中光驱动自由基机制的强大工具的潜力。