揭示 Melissa officinalis 内生菌在促进植物生长和抗真菌方面的作用：基于培养和宏基因组的综合研究方法

《Plant Science》：Unveiling the Plant Growth-Promoting and Antifungal Potential of Melissa officinalis Endophytes: the Integrative Culture-Dependent and Metagenomic Approaches

　　维亚切斯拉夫·舒里金（Vyacheslav Shurigin）| 路晓轩（Xiaoxuan Lu）| 阿卜杜尔·拉希德·汗（Abdur Rashid Khan）| 穆拉德·穆罕默德（Murad Muhammad）| 伊巴德·乌拉（Ibad Ullah）| 迪尔富扎·埃甘贝尔迪耶娃（Dilfuza Egamberdieva）| 杨宇（Yang Yu）| 李莉（Li Li）

中国科学院新疆生态与地理研究所干旱地区生态安全与可持续发展国家重点实验室，乌鲁木齐 830011，中国

**摘要**

内生细菌在植物健康中起着核心作用，然而它们在药用植物中的多样性和功能仍然知之甚少。在这项研究中，我们结合了高通量测序、基于培养的分离方法、功能分析以及温室验证技术，来描述 Melissa officinalis L. 的内生微生物群落。高通量测序共鉴定出347种具有组织特异性的内生细菌。属于假单胞菌门（Pseudomonadota）的 Paucibacter 和 Pseudomonas 属细菌在所有植物组织中占主导地位。19株基于培养的分离菌株属于 Pseudomonas、Microbacterium、Plantibacter、Agreia 和 Kocuria 属，它们表现出多种促进植物生长的特性，包括磷酸盐溶解、固氮作用、1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶活性、吲哚相关化合物（IRC）的产生、铁载体的分泌以及水解酶（几丁质酶、蛋白酶和脂肪酶）的活性。Pseudomonas fluorescens XIEG-4RS14 对 Fusarium graminearum（50%）和 F. moniliforme（37%）表现出抗真菌活性；P. marginalis XIEG-4RS15 分别表现出100%和62%的活性；P. baetica XIEG-4RS18 分别表现出28%和42%的活性；P. fluorescens XIEG-4RS32 分别表现出45%和39%的活性；P. rhodesiae XIEG-4RS37 分别表现出58%和27%的活性。温室实验表明，Pseudomonas fluorescens XIEG-4RS14、P. fluorescens XIEG-4RS32、P. taetrolens XIEG-4RS19 和 P. poae XIEG-4RS27 能够分别使小麦根部和茎部的干重增加113%和60%。这些发现表明，Melissa officinalis 搭载了高度协作且功能有效的内生细菌，具有作为下一代生物 inoculants 的巨大潜力，可用于可持续农作物生产。

**1. 引言**

草本和芳香植物长期以来一直是人类健康和福祉的基石，因其治疗、烹饪和芳香特性而受到重视。其中，Melissa officinalis L.（柠檬香蜂草）是一种原产于南欧和地中海地区的唇形科多年生草本植物，因其药用价值和精油而在全球范围内广泛种植（Ba?dat 和 Co?ge 2006）。传统上，Melissa officinalis 被用于治疗失眠、焦虑、消化问题和炎症等多种疾病（Sawicka 等，2020；Ghazizadeh 等，2021）。这些生物活性归因于其丰富的植物化学成分，如精油（香茅醛、香叶醇和香芹醇）、黄酮类化合物、迷迭香酸和咖啡酸以及其他酚类化合物（Alizadeh Behbahani 和 Shahidi，2019；Awlqadr 等，2025）。尽管 Melissa officinalis 的药理潜力已得到充分认可，但对其相关的微生物群落（特别是植物组织内的细菌内生菌）知之甚少。内生菌包括不引起疾病的细菌和真菌，它们与宿主形成密切关系，影响植物的生长、代谢和抗逆性（van Overbeek 和 Saikkonen，2016；Hassani 等，2018）。其中，细菌内生菌因能够改善植物营养、促进植物生长以及增强对生物和非生物胁迫的抵抗力而受到越来越多的关注（Eid 等，2019；Khan 等，2025）。它们通过直接机制（如固氮、磷酸盐溶解和合成植物激素如吲哚-3-乙酸（IAA））和间接策略（如铁载体产生、分泌水解酶以及表达ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶）来实现这些效果，后者可以调节植物在胁迫下的乙烯水平（Li 等，2023）。

内生细菌的组成和功能受到内在和外在因素的强烈影响，如宿主植物种类、组织类型（茎、叶和根）、发育阶段、环境条件以及次级代谢产物的化学性质（Alami 等，2024）。富含抗菌代谢产物的药用植物常常会对特定或耐胁迫的微生物类群产生选择压力（Sun 等，2024）。鉴于其复杂的植物化学组成，Melissa officinalis 为探索植物代谢产物如何影响内生细菌群落提供了理想的模型，并有助于识别在可持续农业、植物生物技术和环保生物 inoculant 开发中具有潜在应用的功能有效菌株。

传统上，基于培养的方法是内生菌研究的基础，可以用于表征具有生物肥料、生物控制剂或生物活性代谢物来源潜力的细菌分离株（Riva 等，2022；Toppo 等，2023）。然而，只有少量的微生物多样性能够在实验室条件下培养，导致对植物相关微生物群的认知不完整。相比之下，不依赖培养的方法，特别是高通量16S rRNA基因扩增子测序，能够全面分析优势和稀有类群，包括那些难以培养的类群（Hao 等，2016；Youseif 等，2021；Washburn，2022）。将这些互补方法结合起来，可以全面了解微生物多样性，并为将分类学身份与功能潜力联系起来提供实用途径。

小麦（Triticum aestivum L）是一种全球重要的主食作物，作为热量和蛋白质的主要来源对粮食安全具有重要意义。然而，Fusarium 物种，尤其是 F. graminearum 和 F. moniliforme，是导致赤霉病（FHB）的主要病原体，会造成严重的产量损失。除了降低作物产量外，这些病原体还会产生霉菌毒素（如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），这些毒素会污染谷物并对人类和牲畜构成严重的健康风险。鉴于这些挑战，迫切需要可持续、环保的生物控制策略。近年来，促进植物生长的内生菌作为有前景的生物 inoculants 出现，可以增加作物产量、提高养分利用效率并增强抗逆性，同时减少对化学肥料和农药的依赖（Adeleke 等，2022；Elnahal 等，2022）。一些细菌内生菌还发现具有通过竞争养分和空间或分泌抗真菌代谢物（Farzand 等，2019；Khan 等，2024）以及水解酶（如几丁质酶和葡聚糖酶（Admassie 等，2022）来对抗植物病原体的能力。在这方面，Melissa officinalis 成为一种有前景的独特细菌内生菌来源，可以作为环保型生物控制剂的替代品，替代化学杀菌剂。

尽管细菌内生菌的重要性已有记载，但对它们在 Melissa officinalis 中的多样性和功能特性的全面研究仍然不足。了解这些微生物群落对于研究它们的生态作用（Segrè 等，2023）以及利用其生物技术潜力实现可持续农业生产力非常重要（Raes & Bork，2008）。为填补这一空白，本研究采用了一种综合方法，结合基于培养的分离和表征技术与不依赖培养的16S rRNA高通量基因测序来探索 Melissa officinalis 的内生细菌多样性。分离出的菌株被评估了关键的生长促进特性，如 IRC 产生、固氮作用、磷酸盐溶解、铁载体产生、ACC脱氨酶活性以及水解酶（蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶）的产生。随后使用小麦（Triticum aestivum）作为模式作物，对功能活性菌株进行了原位测试，以评估其促进植物生长的效果。

**2. 材料与方法**

**2.1. 植物采集、储存和处理**

2024年，从乌兹别克斯坦的 Ugam-Chatkal 生物圈保护区（41°15'27.7"N, 69°54'41.4"E）采集了 Melissa officinalis 植物，该地区以其生态独特性和丰富的特有物种而闻名。采集了三株相距20-30米的单个植物，存放在低温条件下（4°C）的无菌密封塑料袋中，并在48小时内进行处理。植物材料由中国科学院新疆生态与地理研究所干旱地区生态安全与可持续发展国家重点实验室的维亚切斯拉夫·舒里金博士进行了分类鉴定。采集的植物样本用自来水仔细清洗以去除附着的土壤碎片。使用无菌手术刀分离根、茎和叶，然后用99.9%的乙醇表面消毒2分钟，接着用10%（v/v）次氯酸钠处理，再用无菌蒸馏水冲洗五次，按照已有的协议进行（Coombs 和 Franco，2003；Shurigin 等，2021）。为了确认表面消毒成功，将最终冲洗液100 μL接种在营养琼脂上，并在28°C下培养3-5天以检测微生物生长。

**2.2. 高通量16S核糖体RNA基因测序及相关生物信息学分析**

使用 TGuide S96 Magnetic Soil /Stool DNA Kit（Tiangen Biotech Co., Ltd.，北京，中国）根据制造商的说明从九个样本（三个来自叶片，三个来自根，三个来自茎）中提取总基因组DNA。使用 NanoDrop? One 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）检测DNA的质量和浓度，仅选择OD260/280比值为1.8到2.0的样本进行测序。使用引物27F（AGRGTTTGATYNTGGCTCAG）和1492R（TASGGHTACCTTGTTASGACTT）扩增16S rRNA基因的V1-V9高变区域。所得扩增子被量化并标准化为等摩尔浓度，然后合并并在PacBio Sequel II平台（Beijing Biomarker Technologies Co., Ltd., 北京，中国）上进行测序。16S rRNA基因测序采用环状一致性测序（CCS）模式获得全长16S rRNA读取序列。使用USEARCH（v 10.0）将≥97%相似性的高质量序列聚类为操作分类单元（OTU）。OTU/ASV的分类注释在QIIME2中使用Naive Bayes分类器进行，参考数据库为SILVA（Quast 等，2012）（版本138.1），置信阈值为70%。在QIIME2中计算α-多样性指数以评估样本内的多样性，而β-多样性则通过主成分分析（PCA）来分析细菌群落组成的样本间多样性。使用在线平台BMKCloud（https://www.biocloud.net）进行单因素方差分析（ANOVA）来比较不同组织间的细菌丰度和多样性。所有原始测序数据均存储在NCBI序列读取档案（SRA）中（补充材料表S1）。

**2.3. 内生细菌的分离**

将表面消毒的植物部分（根、茎和叶）使用无菌电动研磨机（咖啡豆研磨机）研磨成小块。每次使用前，研磨机腔室通过用75%乙醇冲洗并浸泡在10%（v/v）NaOCl中两小时进行消毒（Shurigin 等，2022a）。将研磨后的植物组织（1克）悬浮在9毫升无菌蒸馏水中进行系列稀释（10^-1-10^-5），并用Vortex Biosan B-1振荡1分钟。从每个稀释液中取100 μL量接种在含有M1-M10培养基的Petri平板上（以分离不同的细菌群，例如放线菌、假单胞菌、芽孢杆菌；补充材料表S2），并在28°C下有氧条件下培养4-7天。培养后观察细菌生长情况，形态不同的细菌菌落根据颜色、形状和质地进行纯化培养。为了确认表面消毒的有效性，将两块未切割的根和茎放置在R2A培养基上，96小时后如果没有细菌菌落出现，则证明消毒成功。

**2.4. 内生细菌的鉴定**

**2.4.1. DNA分离和聚合酶链反应（PCR）**

使用Dashti等人（2009）描述的热处理方法提取细菌基因组DNA。新鲜细菌菌落悬浮在1.5毫升无菌MQ水中，并涡旋10秒。试管在干燥块加热器（IKA Works，德国）中于90°C下加热20分钟，然后在12,000 rpm下离心5分钟。含有DNA的上清液收集后储存在-20°C直到进一步使用。通过水平琼脂糖凝胶电泳（0.8% w/v）验证基因组DNA的存在和完整性，并使用NanoDrop? One分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）进行定量。DNA纯度通过OD260/280比值在1.8到2.0之间进行确认。

从内生菌中提取的DNA用于16S rRNA基因的扩增。使用通用细菌引物27F（5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'）（Lane 1991）进行PCR扩增。每个25 μl的反应混合物含有2 μl（15–40 ng）基因组DNA、12.5 μl 2x Easy Taq PCR SuperMix（+染料）（TransGen Biotech，中国）、1 μl每种引物（Sangon Biotech，中国）和8.5 μl无核酸酶水（TransGen Biotech，中国）。PCR扩增在C-1000热循环仪（BioRad，美国）中进行，程序如下：最初在94°C下变性30秒；30个循环在94°C下变性15秒，55°C下退火30秒，68°C下延伸1.5分钟；最后在68°C下延伸20分钟。扩增的PCR产物在含有Golden View（Biomed，中国）的0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，并在紫外光下观察（Gel Doc XR + System，Biored）。使用DL 2000 DNA梯片（TransGen Biotech）确认扩增子的大小。

**2.4.2. 细菌分离物的测序和系统发育分析**

PCR扩增的16S rRNA基因产物的测序由Sangon Biotech有限公司（上海，中国）完成。获得的序列是使用EMBOSS Explorer界面（https://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/）的手动组装的，该界面的“revseq”选项用于将序列转换为5’到3’方向的反向互补序列，“merger”选项用于合并两个序列。分类鉴定是使用基本局部比对搜索工具（BLAST）针对美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank核苷酸数据库中的参考序列进行的（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。使用EMBL-EBI Job Dispatcher序列分析工具框架（Madeira等人，2024年）生成了多个序列比对。将FASTA格式的比对序列使用MEGA X软件（Kumar等人，2018年）进行处理，以进行进化分析并构建系统发育树。下面给出了在MEGA X软件中使用的分析和方法的详细信息。进化历史是使用邻接连接（NJ）方法推断的（Saitou和Nei 1987年）。通过500次重复的自助法测试评估了树拓扑的稳健性（Felsenstein，1985年），并在相应的节点上标出了自助值。树是根据比例绘制的，分支长度表示使用最大复合似然方法计算的进化距离（Tamura等人，2004年）。此分析涉及38个核苷酸序列，使用成对删除选项移除了每个序列对中的所有不确定位置。最终数据集包含1547个位置，进化分析以及最后阶段的系统发育树的构建是在MEGA X软件中进行的（Kumar等人，2018年）。分离的细菌菌株的16S rRNA基因序列已存放在GenBank（NCBI）中，登录号为PQ565593-PQ565611。

2.5. 体外植物生长促进
所有内生细菌菌株的植物生长促进（PGP）特性通过生化测定进行了体外评估，包括磷酸盐溶解、固氮、ACC脱氨酶活性、吲哚相关化合物（IRC）的产生、铁载体分泌以及水解酶活性（几丁质酶、蛋白酶和脂肪酶）。磷酸盐溶解的测试是在添加了Ca3(PO4)2（5 g/L）和Bromophenol Blue（0.025 g/L）的Pikovskya固体培养基上进行的（Paul & Sinha，2017年）。在28°C培养7天后，黄色晕圈的形成或颜色变化表明了磷酸盐的溶解。固氮反应是在无氮的Ashby’s mannitol琼脂和NFC培养基上通过评估28°C培养5-7天后的菌落生长来检测的（Liu等人，2016年）。ACC脱氨酶活性是通过在基础培养基（BM）（Lugtenberg等人，1999年）中培养细菌菌株并添加3.0 mM ACC作为唯一的氮源来测定的，使用(NH4)2SO4和无氮培养基作为阳性和阴性对照。IRC的检测是在含有0.1% (w/v) L-色氨酸的TY肉汤中培养细菌4天后，使用Salkowski试剂进行的；在黑暗中培养30分钟后出现粉红色和在530 nm处的吸光度确认了IRC的合成（μg mL?1）（Khan等人，2023年，Saadaoui等人，2024年）。铁载体的产生是在chrome azurol S（CAS）琼脂培养基上筛选的（Gu等人，2021年），其中菌落周围的橙色或透明晕圈表明了Fe螯合作用。几丁质酶活性是在胶体几丁质琼脂上通过形成有色或透明区域来评估的（Ferrari等人，2014年），而蛋白酶和脂肪酶活性则分别在5%脱脂牛奶琼脂和改良的sierra lipolysis琼脂上通过观察透明晕圈或白色沉淀来测试的（Rasmey等人，2017年，Marathe等人，2018年）。所有测定都进行了三次重复，晕圈直径或颜色强度被记录为酶或代谢活性的定性指标。视觉数据被记录下来，所有的晕圈区域都进行了拍照。

2.6. 体外抗真菌活性
内生细菌菌株的拮抗潜力是针对两种植物病原真菌Fusarium graminearum和Fusarium moniliforme进行了筛选，这些真菌来自中国科学院新疆生态与地理研究所生态安全与可持续发展国家重点实验室的收集。这些真菌最初是从感染了Fusarium graminearum（小麦Triticum aestivum L.）和Fusarium moniliforme（玉米Zea mays L.）的植物中分离出来的，这些植物具有由这些真菌引起的特定疾病症状。真菌病原体在28°C下在土豆葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养了七天。从活跃生长的培养物中取出直径为5毫米的菌丝块，放置在新的PDA Petri平板的中心。细菌菌株在R2A液体培养基中预培养过夜，直到OD??? = 0.6（10? CFU mL?1），以便适应，然后在培养基边缘相等的四个点（20 μL）处划线，中心留出空间供真菌菌丝生长（Nishioka等人，2016年）。所有测定都进行了三次重复，平板在28°C下培养了七天。抗真菌活性是通过以下公式计算的：
Radial growth inhibition (%) = [(Rcontrol ? Rtreatment) / Rcontrol] ×100，
其中Rcontrol是对照平板中真菌菌丝的半径，Rtreatment是处理平板中真菌菌丝的半径。

2.7. 内生细菌在温室中的PGP效果评估
内生细菌菌株的植物生长促进效果是在现场使用小麦（Triticum aestivum L.）品种Xindong No15进行评估的，这种小麦是从中国乌鲁木齐的当地种子市场获得的。小麦种子通过浸泡在20% (v/v) H2O2中2分钟并进行三次无菌蒸馏水冲洗来进行表面消毒（Qin等人，2021年，Shurigin等人，2022b）。消毒后的种子在密封有聚膜以防止蒸发的湿滤纸上发芽，并在25±1°C下培养3-4天。发芽的幼苗被无菌转移到装有由泥炭、堆肥、沙子和珍珠岩（1:1:1:1，v/v）组成的低营养土壤的塑料盆中（8.5厘米高×10厘米直径）。盆在自然光和室温条件下（25±1°C）的温室中维护。所有细菌菌株在28±1°C的R2A肉汤中培养了四天。细胞悬浮液以5000 rpm离心10分钟，然后将细胞团重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，得到大约108 CFU/mL的最终浓度（OD 600 ≈ 1.0）。一旦幼苗露出土壤表面，就在每株植物的根区附近施用10 mL的细菌悬浮液（108 CFU/mL），以允许在自然条件下根部的定殖。对照植物在没有细菌接种的相同条件下生长。每个处理包括三个盆，每个盆中有五株植物，并重复三次。生长60天后，植物被收获并轻轻清洗以去除附着的土壤。记录了生长参数，包括茎长、根长以及根和茎的新鲜重量和干重。

2.8. 统计分析
所有统计分析都是使用开源统计语言R（RStudio v1.4.1717，马萨诸塞州波士顿）进行的。使用Duncan检验（LSD，P=0.05）进行处理之间的方差分析。Shapiro-Wilk检验用于评估数据的正态性，而Levene检验用于验证同方差性。如果数据不满足正态性或同方差性的假设，则应用适当的非参数检验，如用于处理之间比较的Kruskal–Wallis检验，随后进行Dunn检验用于成对比较。图表使用“ggplot2”包绘制。计算了每次观察的IRC产生、抗菌活性的平均值及其相应的标准差。

3. 结果
3.1. 细菌群落组成和分类分布
高通量16S rRNA测序显示了栖息在M. officinalis叶片（L41-L43）、茎（S41-43）和根（R41-R43）中的多样化细菌群落。共鉴定出347种细菌，属于233个属、123个科、71个目、32个纲和19个门（补充材料表S3）。其中，48种细菌在所有组织中都有存在，而25种、40种和6种细菌分别仅在根、茎和叶片中检测到（补充材料图S1），表明内生微生物组在组织间的特异性很强。分类谱分析揭示了植物器官之间微生物群落的显著差异（图1）。在门级别（图1A），Pseudomonadota在所有样本组中占主导地位，占总细菌社区的80%以上。Bacillota和Bacteroidota是次丰富的群组，尽管它们的相对丰度在组织间有所不同。在叶片样本中，Bacteroidota和Bacillota共存，而在茎中Bacillota占优势。相比之下，根样本中Pseudomonadota的比例更高，Bacillota的比例较低，这表明了植物内部栖息地的组成复杂性。

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图1. M. officinalis中内生细菌的分类分布：(A) 根、茎和叶片中占主导地位的门类的相对丰度；(B) 所有样本中主要细菌属的相对丰度。相对丰度基于16S rRNA测序以百分比显示。
在属级别（图1B），Paucibacter在所有组织中始终是最主要的属，突显了其在M. officinalis中的广泛内生适应性。然而，次级属表现出组织依赖性变化。Unclassified_Muribaculaceae在L43中更为丰富，而Pseudomonas在根（R41, R42, 和 R43）中更为普遍。Lachnospiraceae_NK4A136_group、Uncultured_rumen_bacterium、Eubacterium、Colidextribacter和Coprococcus属仅存在于L43中，表明植物内生生境中有少量但多样的低丰度细菌群体。总体而言，M. officinalis微生物组主要由Pseudomonadota和Paucibacter主导，每个植物器官都有独特的微生物生态位。

3.2. 分类热图聚类揭示了特定于器官的细菌群落
热图聚类分析揭示了M. officinalis中细菌群落结构的明显组成差异（图2）。在门级别（图2A），主要类群的分布在不同样本间有显著差异。Pseudomonadota在所有样本中始终占主导地位，但它们的相对贡献有所不同。根样本（R41-R43）显示出更高的Actinobacteriota和Bacteroidota比例，同时还有次要的丰富群组如Verrucomicrobiota、Acidobacteriota、Patescibacteria和Bdellovibrionota，表明根内生境具有代谢多样性。叶片样本（L41-L43）分开聚集，主要是由于Pseudomonadota、Campylobacteriota和Fusobacteriota的丰度较高，而茎样本（S41-S43）显示出一个中间聚类，门类代表性相对平衡。

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图2. 包含M. officinalis组织的內生细菌群落的聚类热图。(A) 基于Bray-Curtis距离的分门级相对丰度聚类；(B) 基于属级的聚类。两个面板都显示了基于颜色方案的层次聚类。
在属级别（图2B），细菌聚类显示出明显的组织特异性，进一步受到局部微环境的影响。根样本（R41-R43）主要由Rhizobium、Pantoea、Paucibacter和Sphingomonas等属主导，这些属通常与养分循环和根部定殖相关。叶片样本（L41-L43）显示出不同的组成，富含Methylobacterium、Sphingomonas和Actinobacillus。相比之下，样本L43显示出较高的Lachnoclostridium、Lactobacillus、Roseburia和Ruminococcus水平，表明叶片相关的微生物群落更为异质。茎相关社区（S41-S43）的特征是Limosilactobacillus、Turicibacter、Romboustia Ligilactobacillus和Staphylococcus等属的存在，表明了独特的内生生态位组成。
z分数标准化强调了这些组织特异性变化，突出了按组织类型而不是处理方式明显的聚类。这种模式表明M. officinalis中的微生物定殖主要由宿主组织特性决定，而环境或生理因素对细菌群落结构的影响是次要的。

3.3. Alpha多样性指数揭示了植物组织间的细菌多样性模式
Alpha多样性分析表明M. officinalis的叶片（L4）、茎（S4）和根（R4）组织间的细菌群落丰富度和系统发育多样性存在明显差异（图3A）。ACE和Chao指数估计物种丰富度，在组织间显示出大致相似的值，表明整体微生物物种数量在植物组织间相似。然而，叶片样本（L4）显示出更广泛的范围和更高的中值，表明叶片相关细菌群落的异质性更大，潜在的丰富度更高。PD_whole_tree指数反映了系统发育多样性，在叶片样本中也最高，其次是茎和根组织，表明叶片中的细菌群落具有更大的进化多样性。相比之下，茎（S4）和根（R4）组织显示出相对较低的PD_whole_tree值，与系统发育上更受限制的群落一致。Shannon指数同时考虑了物种丰富度和均匀性，显示出叶片组织保持了最高的多样性，而茎和根样本显示出更均匀但多样性较低的细菌种群。这表明M. officinalis的叶片微生物组支持更大且系统发育上更多样化的细菌群落。** Melissa officinalis 内生细菌群落的 Alpha 多样性和 Beta 多样性分析**
(A) 盒形图显示了叶（L4）、茎（S4）和根（R4）样本的 ACE、Chao1、PD_whole_tree 和 Shannon 指数。点代表单个重复实验，盒子代表四分位数范围及中位数。使用 Student’s t 检验来确定不同组织之间的差异。
(B) 基于 Bray-Curtis 距离的主成分分析（PCA）显示了细菌群落在不同组织中的变化。每个点代表一个单独的样本。茎样本（S4）在原点附近形成紧密的簇，表明组内变异性较低。根样本（R4）沿 PC 轴呈现定向分布，表明中等且结构化的变异。相比之下，叶样本（L4）表现出更大的分散性，反映了更高的异质性。百分比值表示 PC2 对变异性的贡献。椭圆显示了每个组织组的 95% 置信区间，突出了组织间的组成差异。

3.4. Beta 多样性分析揭示了由组织驱动的细菌群落分离
主成分分析（PCA）确认了与 Melissa officinalis 组织相关的细菌群落的明显聚类（图 3B）。第一个主成分（PC1）解释了 99.59% 的总方差，代表了组织类型之间的主要分离，而第二个成分（PC2）解释了 0.36% 的方差，显示出较小的组内差异。样本沿 PC1 的明显空间分布显示了特定组织微生物组的显著组成差异。PC1 分析显示样本类型之间存在不同的聚类模式。与茎相关的样本（S4）在原点附近形成紧密的簇，表明组内组成相似性高且变异低。根样本（R4）沿 PC1-PC2 轴呈现定向分布，表明中等且结构化的变异。相比之下，叶样本（L4）表现出更大的分散性，反映了更高的异质性。每个组周围的 95% 置信区域揭示了统计上不同的细菌组合。这些结果表明，Melissa officinalis 中的微生物群落组成受到植物组织类型的强烈影响，每个组织都寄宿着独特的细菌群落。

3.5. 层次聚类热图确认了特定样本的微生物分组
样本距离热图显示了 Melissa officinalis 的叶（L4）、茎（S4）和根（R4）细菌群落之间的关系，为 PCA 分析提供了补充视角（补充材料图 S2）。叶样本（L41-L43）表现出最高的内部相似性，形成了密集的簇，样本间的距离一致较低。茎样本（S41-S43）也紧密聚集，表明组织内的微生物组成稳定且均匀。根样本（R41-R43）分开聚集，突出了与茎和叶群落的明显差异。然而，在根组内，R41 和 R42 之间的亲缘关系比与 R43 更密切，表明根样本之间存在间接的组成变异。这种聚类拓扑结构支持组织类型是配置 Melissa officinalis 细菌群落的主要因素。

3.6. 差异丰度分析凸显了组织间的属水平变化
基于 ANOVA 的细菌属比较揭示了 Melissa officinalis 叶（L4）、茎（S4）和根（R4）内生群落之间的显著差异（图 4A）。根组织显示了代谢多样性最高的类群，其中 Pseudomonas（约 0.018 ± 0.004）主导了群落，其次是 Rhizobium、Bacillus 和 Pantoea 的显著富集。这些属通常与根际中的养分循环、激素调节和压力缓解有关。相比之下，与茎相关的群落（S4）显示 Ligilactobacillus、Staphylococcus 和 Bacillus 显著占优，表明这种环境支持兼性和产孢细菌的生存。叶样本（L4）的相对丰度较低，其中 Rhizobium、Porphyromonas 和 Flavobacterium 的比例较低，这些类群适应于空中和附生生态位。插图分析进一步显示，Porphyromonas、Mammaliicoccus 和 Rubrivivax 在不同组织间的差异显著，且在根部的富集程度较高。这些发现表明 Melissa officinalis 的内生微生物组具有特定的组合特征，根部是分类学和功能上多样细菌群体的主要栖息地。

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**图 4. Melissa officinalis 不同组织中内生细菌群落的差异丰度和门级分布**
(A) 条形图显示了叶（L4）、茎（S4）和根（R4）样本中优势细菌属的平均相对丰度（±标准误）。插图面板突出显示了低丰度属以便于可视化。值得注意的是，不同组织之间存在特定的模式，某些属在根或茎样本中富集，而其他属在所有组织中的丰度较低。
(B) 三元图展示了主要细菌门（Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria 等）在各个样本中的相对贡献。每个点根据其在三个轴上的比例组成进行定位。靠近顶点的样本表示该门的优势，而位于中心的样本反映了更平衡的群落结构。质心（星星）代表所有样本的平均群落组成。

3.7. 三元分析突出了组织间的门级优势
三元图（图 4B）显示了 Melissa officinalis 的叶（L4）、茎（S4）和根（R4）组织中优势细菌门的相对分布变化。每个顶点对应一种组织类型，每个点的相对位置表示特定门对该组织细菌群的贡献。Pseudomonadota 是最丰富且分布最广的门，在所有组织区域都占据中心位置，显示出持续的优势。Bacteroidota 和 Acidobacteriota 更集中在 R4 轴附近，表明它们与根环境相关。未被分类的细菌比例较小，位于 L4 顶点附近，突出了叶样本中低丰度、组织特异性的类群。这一聚类拓扑结构支持组织类型是配置 Melissa officinalis 细菌群落的主要因素。

3.8. 微生物共现网络揭示了主导互动和关键类群
微生物共现网络显示了一个由 Bacillota（绿色节点）和 Pseudomonadota（蓝色节点）主导的密集连接拓扑结构，强调了它们在 Melissa officinalis 微生物组中的核心生态作用（图 5）。在 Bacillota 内，高度相互连接的属如 Lactobacillus、Ligilactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group 和 Ruminococcus 形成了一个一致的核心模块，表明它们在碳代谢和生物膜形成方面的合作关系。在 Pseudomonadota 中，Pseudomonas、Achromobacter 和 Rhizobium 作为关键枢纽类群，在多个门中表现出强烈的正相关性，表明它们在养分转化和植物生长促进方面的潜在作用。涉及 Bacteroidota 和 Acidobacteriota 的较小子网络显示出较少的关联，涉及更专门或依赖条件的生态功能，维持了 Melissa officinalis 内生微生物组的韧性和功能性完整性。

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**图 5. Melissa officinalis 内生群落中主导细菌属的共现网络**
每个节点代表一个细菌属，大小反映了其相对丰度，而边宽和颜色强度表示正相关性的强度（r > 0.7）。属标签在右侧列出以供参考。

3.9. 细菌内生菌的鉴定和系统发育特征
总共从 Melissa officinalis 的根（6 株）、茎（7 株）和叶（6 株）中分离并鉴定了 19 种细菌内生菌，代表了多样的分类关联（图 6，补充材料表 S1）。鉴定出的分离株的部分 16S rRNA 基因序列与 NCBI GenBank 数据库中的参考序列具有 98.61-100% 的相似性，序列长度在 1368 至 1416 个碱基对（bp）之间。相应的核苷酸序列在 GenBank 中以 PQ565593-PQ565611 的访问号存档，以确保公众访问和易用性。

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**图 6. 从 Melissa officinalis 中分离出的可培养内生菌的系统发育关系**
基于 16S rRNA 基因序列的最大似然树显示了分离菌的 Taxonomic 位置（粗体）相对于 GenBank 中最近类型的菌株。系统发育分析将菌株归类为两个细菌门：Pseudomonadota 和 Actinomycetota。其中，Pseudomonadota 占主导地位，有十二株，都属于 Pseudomonas 属，强调了其在 Melissa officinalis 中作为核心内生菌的分类地位。其余七株属于 Actinomycetota，包括 Pseudonocardiales 和 Micrococcales 目的成员。在 Pseudonocardiales 中，鉴定出一个代表性菌株 Pseudonocardia spinosispora XIEG-4RS3；Micrococcales 目包括一个来自 Micrococcaceae 科的菌株（Kocuria rosea XIEG-4RS30）和五个来自 Microbacteriaceae 科的菌株（Microbacterium oxydans XIEG-4RS6、Microbacterium hydrocarbonoxydans XIEG-4RS2、Agreia pratensis XIEG-4RS31、Plantibacter flavus XIEG-4RS3 和 Plantibacter flavus XIEG-4RS22）。系统发育聚类支持了菌株的分类学鉴定，显示了与组织特定细菌组合相对应的不同分支。

3.10. Pseudomonas 内生菌表现出抗真菌和酶促生物控制特性
对抗两种植物病原真菌 Fusarium graminearum 和 Fusarium moniliforme 的研究显示，分离出的细菌内生菌具有拮抗潜力（图 7）。在 19 株中，五株表现出显著的抗真菌活性，有效抑制了这两种真菌的生长。Pseudomonas fluorescens XIEG-4RS14 对 F. graminearum 的抑制率为 50%，对 F. moniliforme 的抑制率为 37%；P. marginalis XIEG-4RS15 的抑制率分别为 100% 和 62%；P. baetica XIEG-4RS18 的抑制率为 28% 和 42%；P. fluorescens XIEG-4RS32 的抑制率为 45% 和 39%；P. rhodesiae XIEG-4RS37 的抑制率为 58% 和 27%。两种 P. rhizosphaerae XIEG-4RS10 和 P. baetica XIEG-4RS20 对 F. graminearum 的抑制率为 68%。另外三株仅抑制了 F. moniliforme（P. koreensis XIEG-4RS4 和 P. poae XIEG-4RS27 的抑制率分别为 27% 和 40%，表明存在种特异性拮抗作用。

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**图 7. Melissa officinalis 可培养内生菌群的植物生长促进特性和抗真菌潜力**
为了阐明这种抗真菌活性的功能基础，对每个菌株进行了水解酶活性（几丁质酶、蛋白酶和脂肪酶）和铁载体产生的筛选（补充材料图 S3 – S6）。抗真菌 Pseudomonas 菌株表现出高度的代谢多样性，结合了多种生物控制特性。例如，P. fluorescens XIEG-4RS14 产生可检测的铁载体晕圈，并显示出正的几丁质酶、脂肪酶和蛋白酶活性。同样，P. marginalis XIEG-4RS15 和 P. baetica XIEG-4RS18 也显示出高蛋白酶和解脂酶活性，以及高效的铁载体和几丁质酶产生。P. fluorescens XIEG-4RS32 显示出显著的铁载体产生和优异的几丁质酶和蛋白酶活性，而 P. rhodesiae XIEG-4RS37 显示出显著的铁载体产生和中等的酶活性。缺乏可检测铁载体或水解酶产生的菌株可能通过其他机制发挥抗真菌作用，如产生抗真菌代谢物、挥发性有机化合物（VOCs）或诱导系统性抗性（ISR）。因此，这些菌株被认为是农业系统中进一步利用的潜在生物控制候选者。

3.11. 功能筛选揭示了具有显著植物生长促进潜力的多功能 Pseudomonas 内生菌
Pseudomonas 内生菌表现出多样的 PGP（植物生长促进）特性，包括磷酸盐溶解、固氮、ACC-脱氨酶和 IRC（吲哚丙酸）产生（图 7）。在 19 株中，十一株表现出磷酸盐溶解活性，其中五株表现出阳性活性，两组表现出高度阳性磷酸盐溶解活性。十二株能够固定大气中的氮，尽管只有三株表现出高固定活性。同样，十二株表现出 ACC-脱氨酶活性，其中一株表现出阳性活性，三株表现出高度阳性酶活性。十四株检测到 IRC 产生，所有菌株的产量均超过 0.5 μg/mL，九株的产量超过 1.0 μg/mL，表明其高 auxin 生物合成潜力。基于综合 PGP 特性，选出了十株功能上更优越的菌株，包括 P. koreensis XIEG-4RS4、P. fluorescens XIEG-4RS14、P. marginalis XIEG-4RS15、P. taetrolens XIEG-4RS19、P. baetica XIEG-4RS20、P. poae XIEG-4RS27、Kocuria rosea XIEG-4RS30、Agreia pratensis XIEG-4RS31、P. fluorescens XIEG-4RS32 和 P. rhodesiae XIEG-4RS37。这些菌株具有多种 PGP 机制，突显了它们的代谢多样性。例如，P. koreensis XIEG-4RS4 在磷酸盐溶解方面表现出优异性能（补充材料图 S7），并显示出可检测的 ACC-脱氨酶和 IRC 产生（0.069 μg/mL）；P. fluorescens XIEG-4RS14 显示出优异的 ACC-脱氨酶活性和 IRC 产生（0.113 μg/mL）。P. marginalis XIEG-4RS15 表现出高度正的 ACC-脱氨酶产生、磷酸盐溶解和固氮作用；P. taetrolens XIEG-4RS19 表现出最高的 IRC 产生水平（0.142 μg/mL）以及正的 ACC-脱氨酶活性。P. baetica XIEG-4RS20 和 P. poae XIEG-4RS27 在 IRC 产生（0.098 和 0.126 μg/mL）和磷酸盐溶解方面表现出优异性能，而 P. poae XIEG-4RS27 还表现出 ACC-脱氨酶和固氮活性。在非 Pseudomonas 类群中，Kocuria rosea XIEG-4RS30 和 A. pratensis XIEG-4RS31 分别表现出显著的 auxin 生物合成（0.211 和 0.132 μg/mL）以及固氮和磷酸盐溶解活性。P. rhodesiae XIEG-4RS37 在 ACC-脱氨酶活性、高效固氮和其他 PGP 特性方面表现出优异性能。这些结果强调了 Melissa officinalis 中多样的内生菌群，能够通过养分溶解、激素产生和酶活性支持植物生长。内生菌的原位活性决定了植物生长促进作用。从体外筛选中选出的十种多功能菌株在温室条件下对小麦（Triticum aestivum L.）的PGP活性进行了评估（图8）。在所有处理中，接种菌株的根长、茎长和生物量均比未接种的对照组有所增加，尽管不同菌株之间的生长促进效果有所不同。下载：下载高分辨率图片（1MB）下载：下载全尺寸图片

图8. 内生细菌菌株对小麦的原位生长促进作用。每个箱形图显示了单个细菌菌株对（A）茎长、（B）茎干重、（C）根长、（D）根干重的影响。（E）在温室条件下接种单个细菌菌株后盆栽小麦植株的表现，（F）拔出的植株显示了不同菌株间根长和茎长的变化以及根系发育情况。例如，A. pratensis XIEG-4RS31使根长增加了22.9%，而P. fluorescens XIEG-4RS32则增加了12.2%。然而，P. fluorescens XIEG-4RS32对根干重的影响显著更大，增加了87.8%，而A. pratensis XIEG-4RS31仅增加了63.1%。这表明通过特定的功能策略可以增加根的大小和生物量。

四种菌株在根和茎的生物量上具有持续的提升作用：P. fluorescens XIEG-4RS14、P. taetrolens XIEG-4RS19、P. poae XIEG-4RS27和P. fluorescens XIEG-4RS32。P. fluorescens XIEG-4RS14使根干重增加了89.1%，茎干重增加了60.3%；P. taetrolens XIEG-4RS19和P. poae XIEG-4RS27分别使根干重增加了113%和59.6%。P. fluorescens XIEG-4RS32也使根干重和茎干重分别增加了87.9%和59.9%。这些菌株还显著增加了茎的伸长。与对照组相比，P. fluorescens XIEG-4RS14的茎伸长增加了22.8%，P. taetrolens XIEG-4RS19增加了15.3%，P. poae XIEG-4RS27增加了19.4%，A. pratensis XIEG-4RS31增加了20.7%，Pseudomonas fluorescens XIEG-4RS32增加了23.8%。总体而言，尽管P. taetrolens XIEG-4RS19在增强茎生物量方面更有效，但A. pratensis XIEG-4RS31在增加茎长方面表现更好，这突显了每种菌株引起的不同生理反应。这些发现强调了具有显著形態和生物量相关特性的假单胞菌菌株的影响。

4. 讨论
本研究提供了关于M. officinalis内生细菌群落的综合观点，结合了全长16S rRNA测序、基于培养的分离、功能筛选、抗真菌测定和温室验证方法。这些方法表明了高度有序的组织特异性关联，强调了植物作为系统发育和功能多样微生物群选择性储存库的作用。

4.1. 组织特异性的微生物组组装
在所有组织中，测序结果显示了一个由530种属于20个门、41个纲和340多个属的内生微生物组组成。尽管种类丰富，但微生物组成具有高度的组织特异性。根内生层作为与土壤的主要接口，容纳了最丰富的分类学细菌属，而叶和茎则包含更选择性的菌群，这一发现与其他芳香和药用植物的研究结果一致，其中根际附近有更多的微生物入侵和功能冗余（Shurigin等人，2021；Lin等人，2022；Ling等人，2022）。根、茎和叶之间的这种不同菌群分布与宿主-微生物相互作用的新兴模式相符，在这种模式中，植物组织起到生态位的保护作用，对微生物定植施加了生化、物理和免疫学屏障（Trivedi等人，2020；Hannula等人，2021；Zhu等人，2023）。这种多样性反映了土壤来源的接种物与宿主选择之间的动态相互作用，这对于养分获取、病原体防御和抗逆性非常重要（Compant等人，2021；Meng等人，2023）。

热图聚类和PCA确认了叶、茎和根微生物组的明显区分，表明组织身份是β多样性的最强影响因素。与根相关的菌群显著富集了代谢多样的类群，如Phenylobacterium、Acidibacter、Flavobacterium、Humatobacter和多种Actinobacteria成员，反映了根际-内生层界面的异质性、养分丰富性和微生物竞争性，以及它们在促进植物生长、抑制病原体和缓解胁迫中的作用（Conco-Biyela等人，2024；Sun等人，2025）。Phenylobacterium具有降解芳香化合物的能力，可能有助于M. officinalis调节富含酚类的环境，通过解毒或代谢作用参与其中（Zheng等人，2024）。Actinobacteria以其抗菌代谢产物的产生和磷酸盐溶解能力而闻名，可能被选择性地富集以加强根区防御，从而提高养分的有效性（Semenzato和Fani，2024；Yang等人，2024）。相比之下，叶组织支持更专化的微生物组，如Methylobacterium、Kosakonia和Massilia属，这些菌类通常与叶圈适应、促进植物生长和抗逆性相关，并以其释放C1化合物和抵抗氧化应激的能力而著称，在地上组织中是碳循环的关键参与者（Fan等人，2024；Zheng等人，2024；Yurimoto，2025）。茎组织表现为中等微生物多样性，并富含乳酸菌和葡萄球菌（Sarago?a等人，2024），这与选择能够在养分有限环境中生存的微生物类群一致（Zhu等人，2023）。

4.2. 生态结构和关键类群
共现网络进一步显示了Pseudomonas和几个Bacillota作为中心枢纽的生态区别，表明它们在维持社区结构和植物有益功能方面具有合作作用。高度连接的类群通常作为关键成员，稳定社区动态，并对功能输出（如病原体抑制和胁迫缓解）做出重大贡献（Liu等人，2025）。Pseudomonas、Lactobacillus相关群组和Lachnospiraceae成员之间的强正相关表明潜在的协同代谢合作和生态位互补性（Qiao等人，2024），这为多个作物系统的深入基因组和代谢组学评估提供了依据，与我们的研究结果一致。

有趣的是，尽管测序检测到高度的的分类多样性，但只有部分菌株（19种）通过分离得到了验证，这反映了培养依赖（培养）和培养独立（分子）方法之间的广泛差异。尽管如此，培养依赖的菌株在功能上丰富且在系统发育上多样，主要由Pseudomonas、Agreia、Microbacterium、Kocuria和Plantibacter组成。Pseudomonas因其代谢灵活性、铁载体产生、抗真菌能力和强大的定植特性而被认为是最多样化和广泛分布的植物相关类群之一（Anderson & Kim，2020）。这些菌株进一步强调了植物招募生长缓慢、适应胁迫且具有高生物活性潜力的细菌的能力。分离株与GenBank参考菌株的高序列一致性（98.6-100%）表明它们是生态适应性强的内生菌，而不是短暂的定植者。

4.3. 功能潜力和生物控制属性
PGP筛选显示许多菌株表现出多种有益特性，如磷酸盐溶解、固氮、ACC脱氨酶生产和IRC合成，这与高价值药用和芳香作物中报道的多功能内生菌的作用一致（Berde和Berde，2022；Gupta等人，2024）。其中，Pseudomonas表现出最高的代谢多样性。大多数菌株表现出高水平的铁载体产生、几丁质酶、蛋白酶和脂肪酶活性，这些都是参与养分螯合、菌丝体裂解和竞争排斥的抗真菌机制（Dukare & Paul，2021）。五种Pseudomonas菌株在体外双重培养试验中对F. graminearum和F. moniliforme表现出显著的抑制作用，表明其具有潜在的生物控制能力（Ullah等人，2020；Dai等人，2024）。这一模式支持了已建立的模型，即Pseudomonas fluorescens通过协调的铁竞争和酶拮抗作用抑制真菌病原体（Ren等人，2024）。缺乏这些酶活性的内生菌株几乎不表现出抗真菌活性。然而，这些发现仍需通过植物实验来证实体外观察到的抗真菌效果，并确认其自然条件下的生物控制潜力。

4.4. 温室验证和植物生长效应
温室评估表明，具有积极体外功能特性的内生菌也能改善小麦的生长。所有选定的十种菌株都显著增强了根和茎的发育及生物量，但其效果在幅度和目标植物性状上有所不同。如P. fluorescens XIEG-4RS14、P. taetrolens XIEG-4RS19、P. poae XIEG-4RS27和P. fluorescens XIEG-4RS32使根干重增加了87-113%，茎干生物量增加了约57-60%。根长的增加并不总是伴随着生物量的增加，这突出了微生物生长促进的多因素性质，通常涉及激素调节（Lugtenberg等人，2013；Kaya，2024）、养分获取的改善（Pii等人，2015）和胁迫缓解（Majeed等人，2018），而不仅仅是简单的形态扩展（Jiang和Chen，2016；Shurigin等人，2024）。这些数值与开放栽培和温室条件下报道的最佳生物接种剂相当（Soldan等人，2019；Ocwa等人，2024）。有趣的是，根伸长并不总是与生物量积累相关。A. pratensis XIEG-4RS31虽然显著增加了根和茎的长度，但对干重的影响较弱。这种形态生长与生物量增加之间的脱钩与研究表明微生物对生长素信号（Ma等人，2022）的调节、养分分配和根系结构（Khan等人，2023；Li等人，2024）可以独立影响生长模式一致。Actinobacteria菌株的高IRC产量可能在激素调节中发挥了更重要的作用。多功能Pseudomonas菌株的主导地位与全球证据一致，表明它们具有生态适应性（Letizia等人，2025）、根际竞争力（Sanchez-Gil等人，2023）和适合生物制剂制备（Fadiji等人，2024）。同时，高性能的Actinomycetota菌株如Agreia和Kocuria的存在扩大了有前景的接种剂范围，超出了常见的属。

4.5. 未来方向
未来的研究应探索全基因组测序以识别生物合成基因簇，通过代谢组学分析表征抗真菌化合物，并构建合成内生菌群以评估实际田间条件下的表现。此外，鉴定菌株之间的协同作用可能会揭示进一步增强植物抗逆性和产量的合作机制。随着微生物生物刺激剂在全球范围内的发展，像M. officinalis这样的药用植物提供了未被充分探索但具有生态适应性和功能活性的细菌共生体的强大来源。通过测序、网络分析、功能分析和温室数据综合研究，可以探索M. officinalis作为具有PGP和抗真菌能力的内生菌的强大来源。

5. 结论
本研究强调M. officinalis宿主具有高度结构化和功能多样化的內生微生物组，具有明确的组织特异性，其中Pseudomonadota和Actinomycetota的代表性强。通过结合全长16S rRNA测序、基于培养的分离、生化分析、抗真菌测定和温室验证，我们证明了尽管可培养的部分较少，但仍包含具有重大生物功能的菌株。几种Pseudomonas和Actinobacteria菌株表现出积极的植物生长促进特性，包括养分溶解、酶活性和IRC产生以及广泛的抗真菌活性，对抗Fusarium病原体有效。温室验证证实这些多功能内生菌可以显著增强小麦的生长和生物量积累。这些发现突显了M. officinalis作为重要药用植物的潜力，其内生细菌来源尚未得到充分探索，为基于微生物组的生物接种剂的发展奠定了基础。

红色作者贡献声明：
Xiaoxuan Lu：撰写——原始草稿、验证、方法论、调查、正式分析、概念化。
Abdur Rashid Khan：撰写——原始草稿、验证、方法论、调查、正式分析、概念化。
Vyacheslav Shurigin：撰写——原始草稿、验证、方法论、调查、正式分析、概念化。
Dilfuza Egamberdieva：撰写——审稿与编辑、验证、资源管理、数据管理。
Yang Yu：撰写——审稿与编辑、验证、资源管理、数据管理。
Murad Muhammad：可视化、验证、软件应用、正式分析。
Ibad Ullah：可视化、验证、软件应用、正式分析。
Li Li：撰写——审稿与编辑、验证、监督、项目管理、资金获取、概念化。