利用红花（Erythrina caffra）介导的石墨烯量子点（GQDs）和碳点（CDs）的绿色合成方法，探索其对SARS-CoV-2的潜在抗病毒活性 作者：Refilwe Matshitse, Boetie M. Buta, Nothando S. Mabasa, Bongeka S. Nkosi, Lebo A. Ramarope, Nhluvuko Vuma, Nomusa Sikhakhane, Tebogo Matlala, Charity E. Maepa, Xavier Siwe Noundou （另有2位作者）

《Materials》：Green Synthesis of Graphene Quantum Dots (GQDs) and Carbon Dots (CDs) Mediated with Erythrina caffra for Potential Antiviral Properties Against SARS-CoV-2 Refilwe Matshitse, Boetie M. Buta, Nothando S. Mabasa, Bongeka S. Nkosi, Lebo A. Ramarope, Nhluvuko Vuma, Nomusa Sikhakhane, Tebogo Matlala, Charity E. Maepa and Xavier Siwe Noundou + 2 authors

　　摘要：本文介绍了利用简单技术从Erythrina caffra（E. caffra）的叶子中绿色合成石墨烯量子点（GQDs）和碳点（CDs）的方法，以促进碳化过程。这些碳点是通过E. caffra叶子的甲醇和水提取物制备的，并评估了它们作为对抗SARS-CoV-2的潜在抗病毒剂的潜力。对E. caffra叶子提取物的植物化学分析显示其中含有酚类、生物碱、甾体/萜类、单宁和黄酮类化合物。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析证实了这些提取物中含有来自植物化学物质的氧化官能团。紫外-可见光谱（UV-Vis）检测表明两种提取物和碳点中都存在次级代谢产物。X射线衍射光谱证实了从水提取物中合成的碳点为非晶态（2.51纳米），而从甲醇提取物中合成的石墨烯量子点为晶态（0.08纳米）。碳点和石墨烯量子点的粒径分别为5.5纳米和4.0纳米，具有颗粒状形态，其ζ电位分别为+200.0毫伏和-12.6毫伏。结果表明，在测试浓度（100毫克/毫升）下，所有提取物和碳点制剂均表现出高细胞存活率（>90%），显示出优异的生物相容性和最小的细胞毒性。SARS-CoV-2实验表明，提取物（甲醇和水）和纳米材料（碳点-水、石墨烯量子点-甲醇）的病毒抑制效果分别为87.86 ± 4.75%、87.95 ± 0.77%、87.95 ± 3.08%和94.84 ± 0.94%。所有样本的病毒抑制率均超过88%。实验还发现，每种样品至少需要5微克的浓度才能达到50%的抗氧化效果。该研究强调了E. caffra作为环保型碳点合成的可持续前体的价值，这些碳点具有潜在的抗病毒和抗氧化作用。

1. 引言
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）持续导致显著的发病率、死亡率和社会经济破坏，因此成为全球主要的健康问题[1,2]。尽管有多种抗病毒药物和疫苗可用，但由于耐药病毒变种的出现和不良药物反应，当前针对2019冠状病毒病（COVID-19）的治疗方案的效果仍然有限[3,4,5]。SARS-CoV-2病毒颗粒由四种主要结构蛋白组成：刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）[3,4,5,6]。每种蛋白在病毒复制中都起着重要作用[6]。M蛋白被认为是病毒组装的的组织者[7]，其关键作用是通过与其他结构蛋白（如S、E和N蛋白酶）相互作用来协调病毒的组装并决定病毒包膜的整体形状[3]。病毒的组装和出芽过程由E蛋白介导[4,8]，而N蛋白是一种磷酸蛋白，它保护病毒基因组，并参与病毒RNA的转录、复制以及将基因组包装进新的病毒颗粒中[5]。S蛋白是一种高度糖基化的同源三聚体，具有构象灵活性，在感染宿主时通过S1亚基与宿主细胞的I型跨膜蛋白（具有单羧肽酶活性，即ACE2受体）结合来发挥受体结合作用；S2亚基则介导病毒膜与细胞膜的融合，从而实现病毒进入[5]。因此，寻找替代治疗策略的呼声日益高涨，基于纳米技术的方法显示出巨大的潜力[9,10]。

石墨烯量子点（GQDs）是一种碳点（CD）。它们的特点是具有有序的类石墨烯原子结构、多层结构和平面形态，这导致了量子限制效应，使其具有多种应用前景，包括高水溶性、低毒性、光致发光性能以及易于表面修饰[12,13,14,15,16,17]。碳纳米点（CDs）是非晶态的，形态多样，具有碳骨架和连接到sp2/sp3杂化碳原子上的各种官能团。其荧光现象可归因于量子限制效应或表面缺陷[12,18,19]。相比之下，石墨烯量子点（GQDs）由类石墨烯结构的岛屿组成，呈盘状或片状形态，由芳香碳构成，其荧光是由于在石墨烯晶格内的横向限制[12,14,19,20]。碳点和石墨烯量子点的较大表面积和官能团提高了它们的反应性、机械强度和热稳定性[12,19]。它们的结构决定了它们的电学、机械、光学和化学性质，为纳米技术、医学和能源领域提供了广泛的应用前景[9,15,16,17]。基于这些特性，它们成为直接抑制病毒、生物传感和抗病毒药物输送的理想候选材料[15]。越来越多的研究表明，来自天然植物的GQDs和CDs可以与病毒蛋白相互作用，抑制病毒复制并增强宿主防御能力[9,15,16,21]。利用可再生和环保前体的绿色合成技术被认为是制造纳米材料的可持续方法[15]。植物提供了优良的碳源，因为它们含有丰富的生物活性物质，如酚类、黄酮类和生物碱，这些物质可以支持所得碳点的功能化和生物活性[15]。正如前文所述，本研究中使用的碳点是通过南非药用植物E. caffra的叶子制备的。选择E. caffra是因为此前没有关于该植物用于绿色合成碳点的研究。E. caffra是南非特有的物种，以其抗菌和抗炎特性而闻名[22]。本研究的目的是利用加热方法从E. caffra提取物中合成碳点，并评估它们对抗SARS-CoV-2木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）的抗病毒性能[23]。

2. 材料与方法
2.1. 材料
使用了蒸馏水（Lasec purite select fusion，序列号33386）、甲醇（RLS Chemicals 99.5% AR，批号RLS-23137，CAS号67-56-1）、乙醇（RLS Chemicals 99.9% AR，批号RLS EE0065/23，CAS号64-17-5）以及硫酸奎宁（Sigma Aldrich，约翰内斯堡，南非）（W/W）≥90–≤100%，CAS号207671-44-1）。E. caffra叶子样本取自南非Sefako Makgatho健康科学大学的花园。BPS Bioscience试剂盒（#79995-1，美国加利福尼亚）包含重组木瓜蛋白酶样蛋白酶（2 μg，储存于-80°C）、PLPro底物（5 mM，25 μL，-80°C）、PLPro测定缓冲液（25 mL，-20°C）、10 mM GRL0617（20 μL，储存于-80°C）、0.5 M DTT（200 μL，-20°C）、黑色低结合板及密封剂。本研究中使用的HepG2细胞来自ATCC（美国马里兰州罗克维尔）。细胞在T75 cm2组织培养瓶中培养，使用Dulbecco改良Eagle培养基（DHEM，ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆），并添加5%胎牛血清（FCS，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）和1%抗生素（两性霉素/青霉素/链霉素，Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）。细胞在37°C、5% CO2条件下，在Forma Scientific水套式培养箱（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中培养。当细胞达到汇合时，用PBS（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）冲洗，然后用TrypLE Express溶液（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）处理，随后加入0.1% trypan blue（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和血细胞计数器（Neubauer chamber，ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）来计数活细胞。

2.2. 设备
紫外-可见光谱（UV-vis）是由Agilent Cary 60光谱仪（Agilent Technologies，美国加利福尼亚）获得的，该光谱仪配备Xe灯作为光源和硅二极管检测器。UV-vis透射光谱在200–800纳米的光谱范围内获得。通过将1毫克（提取物或纳米材料）溶解在2毫升二甲基亚砜（DMSO）溶剂中获取光谱。使用纯DMSO作为参考光谱进行100%透射率校正。使用Cary WinUV软件版本5操作光谱仪并处理数据，吸收值（A）通过A = log(1/T)公式计算得出。
荧光光谱是由FluoroMax-4荧光光谱仪（Horiba Scientific，美国新泽西）获得的。使用Xe弧光灯作为激发源，激发波长为325纳米，检测器为光电倍增管（PMT）。荧光光谱在90°几何结构下获取，狭缝宽度为5纳米。使用FluoroEssence V3.3软件操作荧光光谱仪。
红外吸收光谱是由Agilent Carry 630傅里叶变换红外光谱仪（Agilent Technologies，美国加利福尼亚）获得的，该光谱仪配备氘代三甘氨酸硫酸盐（DTGS）检测器和衰减全反射（ATR）附件。使用Agilent MicroLab软件版本5.8操作光谱仪并处理数据，ATR晶体为钻石型。光谱在650–4000 cm?1光谱范围内获取，分辨率为2 cm?1。
使用动态光散射（DLS）技术结合Nanotrac wave II颗粒大小分析仪（Microtrac MRB，Microtrac FLEX 11软件，日本大阪）研究了样品的粒径分布、多分散指数（PDI）、表面电荷和ζ电位。样品在25°C下溶解于折射率为1.333的H2O中。样品的结构通过粉末X射线衍射技术研究，使用D2 phaser衍射仪（Bruker，美国加利福尼亚），配备SSD160_2（ID模式）检测器，辐射源为Cu-Kα（λ = 1.5405 ?）。X射线的加速电压为30 kV，电流为10 mA。衍射分析在5–100° 2θ范围内进行，数据采集和处理使用Bruker DIFFRAC.SUITE和DIFFRAC.EVA软件版本6完成。
样品的形态和大小通过透射电子显微镜（TEM，JEOL JEM-2100F，日本东京电子光学实验室有限公司）确定。加速电子电压为200 kV，束流阀发射电流为149 μA。使用Image J软件版本1.5×从TEM显微照片测量颗粒直径。每个样品测量超过50个颗粒。
GloMax Explorer（Promega，美国麦迪逊）用于检测SARS-CoV-2的生物发光和化学发光。使用GloMax Explorer系统软件版本4.2操作和分析数据，通常在基于Windows的集成平板电脑上运行。激发波长为365纳米，发射在415–445纳米范围内检测，使用PMT检测器，检测范围为300–600纳米。Resazurin测定的荧光使用自动FLUOstar OPTIMA板读取器（BMG Technologies，德国奥芬堡）检测，激发波长为544纳米，发射波长为590纳米。

2.3. 提取
将E. caffra的干燥叶子研磨成50克细粉，依次用1升甲醇和水提取24小时，分别得到甲醇（MeOH）和水（H2O）滤液。然后使用漏斗和Whatman滤纸过滤滤液，得到甲醇和水的滤液。水滤液冷冻后冻干以去除所有水分，得到水提取物（4克，7%）。甲醇滤液在减压条件下用旋转蒸发器蒸发，得到甲醇提取物（16克，32%）。两种提取物均储存于4°C待进一步使用。

2.4. 植物化学筛选
对E. caffra的各种叶提取物进行了基于文献中的传统定性程序的植物化学筛选[25,26,27,28,29,30]。每次测试称取1毫克干燥植物提取物并放入六个独立的试管中。每个试管中加入1毫升甲醇或水溶剂。充分搅拌溶液以确保完全溶解，然后加入相应的植物化学试剂。每种植物化学测试重复三次。

2.4.1. 生物碱检测
采用两种常见的测试方法——Mayer测试和Wagner测试来检测粗提物中是否存在生物碱。
Mayer测试：向含有粗提物和溶剂的试管中加入1毫升Mayer溶液（由1.36克汞酸和5克碘化钾在100毫升蒸馏水中制备）。如果没有出现乳白色沉淀，则表明未检测到生物碱[25]。
Wagner测试：通过将2克碘和6克碘化钾溶解在100毫升蒸馏水中制备Wagner溶液，然后加入每个试管中。如果出现红棕色沉淀，则表明存在生物碱[25,26]。**单宁的检测**
植物提取物中单宁的存在是通过氯化铁测试来确定的。该测试包括向含有提取物的试管中加入1毫升10%的氯化铁溶液。如果加入氯化铁（FeCl3）后颜色变为蓝黑色或棕绿色，则表示存在单宁[27,28]。

**2.4.3 酚类的检测**
为了检测酚类化合物，也使用了氯化铁测试。测试方法是将几滴中性的5%氯化铁溶液加入1毫升的粗提物中。如果出现深绿色，则表明存在酚类化合物[27,28]。

**2.4.4 黄酮类的检测**
根据Bankole等人的研究，向提取物中加入镁和盐酸后如果出现粉红色或红色，则表示黄酮类物质的存在[29]。Shinoda测试：向每个试管中加入镁晶体，然后加入1毫升浓盐酸，并观察颜色变化。

**2.4.5 类固醇/萜烯的检测**
通过Salkowski测试来识别类固醇或萜烯的存在。实验步骤是将1毫升氯仿加入样品中并充分混合，随后小心地将1毫升浓硫酸（H2SO4）沿试管壁加入[30,31]。如果两种液体层之间的界面出现红棕色，则确认存在类固醇/萜烯[32]。

**2.5 碳纳米材料的合成**
碳纳米材料（GQDs、CDs）的合成采用了文献中报道的方法，并稍作修改[33,34,35]。具体步骤如下：将50毫克的甲醇粗提物在热板上加热至200°C并持续搅拌30分钟，然后分别向其中加入1毫升甲醇或水，继续搅拌30分钟。之后，将30毫升甲醇或水加入相应的试管中，再转移到离心管中以40转/分钟的速度离心15分钟，以去除未形成GQDs或CDs的植物成分。

**2.6 物理化学性质**

**2.6.1 荧光量子产率**
绿色量子点的荧光量子产率在水和甲醇中通过先前研究中的比较技术进行了评估[36,37]。以硫酸奎宁（吸光波长为...）为标准，其荧光量子产率为0.546。使用以下公式（1）考虑了溶剂的折射率：
\[公式（1）\]
其中 \(n_GQDs\) 和 \(n_{standard}\) 分别代表GQDs和标准的折射率；\(A_GQDs\) 和 \(A_{standard}\) 分别代表样品和标准品的荧光曲线下面积；\(A_{FL}\) 和 \(A_{standard}\) 分别代表样品和标准品的荧光量子产率[37]；\(A_{abs}\) 是样品（GQDs和CDs）和标准品在各自激发波长（275 nm和410 nm）下的吸光度值。

**2.6.2 粉末X射线衍射**
分析了提取物及其相应纳米材料的化学和分子结构。X射线衍射图谱在5至90度的角度范围内记录。实验使用Cu/Ka射线源，波长为0.154 nm，加速电压为30 kV。通过积分主衍射峰来计算样品的结晶度（CI%），使用公式（2）：
\[公式（2）\]
其中 \(I_c\)（a.u.）和 \(I_a\) 分别代表结晶区域和非结晶区域的积分强度。根据先前研究[18]，使用Scherrer方程（公式（3）计算CDs和GQDs在（200）面的晶粒尺寸（D nm）：
\[公式（3）\]
\(D = \frac{I_c}{I_a}\)
\(K\) 的值为0.9，\(\lambda\) 是射线波长，\(\theta\) 是半高宽角（以弧度为单位）。Bragg方程（公式（4）用于计算CDs和GQDs的最高强度处的层间距：
\[公式（4）\]
\[公式（4）\]
其中 \(n\) 是衍射级数（正整数）。

**2.7 药理性质**

**2.7.1 抗氧化作用**
采用DPPH（2,2-二苯基-1-吡啶肼）抗氧化剂测定法，根据先前方法[40,41]评估样品的自由基清除活性，通过测量吸光度的下降来量化[42,43,44,45]。具体步骤是制备DPPH（1 mg）的DMSO（50 mL）储备溶液，然后将1 mg的测试样品溶解在1 mL DMSO中。将DPPH与测试样品溶液按1:1的比例混合，在517 nm处使用UV-Vis光谱仪监测5分钟，每分钟一次[43,46]。DPPH清除活性的百分比使用公式（5）计算：
\[公式（5）\]
其中 \(A_{DPPH}\) 是不含样品的DPPH溶液的吸光度，\(A_{样品}\) 是含样品的DPPH溶液的吸光度[46]。根据先前研究[46,47]，IC50值表示清除50% DPPH自由基所需的样品浓度。

**2.7.2 毒性**
选择人肝细胞癌（HepG2）细胞系来评估提取物和纳米颗粒对细胞的毒性作用。细胞活力使用Alamar Blue（resazurin）测定法测定，并进行了少量修改[48]。细胞用10 μL的相应样品处理，在含有5% CO2的湿润气氛中于37 °C下孵育24小时，培养器为Forma Scientific水套式培养箱（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。孵育后，向处理组和对照组孔中各加入11.1 μL的2% resazurin溶液，再孵育3小时。使用自动化FLUOstar OPTIMA板读取器（BMG Technologies，德国奥芬堡）在544 nm激发波长和590 nm发射波长下测量荧光[48]。细胞活力百分比使用公式（6）计算：
\[公式（6）\]

**2.7.3 SARS-CoV-2木瓜蛋白酶（PLpro）酶活性测定**
使用荧光共振能量转移（FRET）技术，通过木瓜蛋白酶类似物酶活性测定法来测量植物提取物及其相应量子点抑制SARS-CoV-2 PLpro的能力[49,50,51,52]。具体步骤是：首先制备1 mM的二硫苏糖醇（DTT）溶液，将20 μL的0.5 M DTT储备溶液加入10 mL的PLpro测定缓冲液中。将PLpro酶（0.7 ng）稀释在1 mM DTT溶液中，然后向96孔板中加入30 μL，用于测试样品和抑制剂对照组（除三个孔外，这三个孔加入1 mM测定缓冲液作为空白对照）。阳性对照（500 μM）由10 μL的已知PLpro抑制剂（GRL0617）制备。FRET酶活性测定法首先将96孔板在37 °C下孵育30分钟，然后加入PLpro（9 ng）。同时，制备125 μM的PLPro荧光底物，比例为5 mM PLpro底物与1 mM PLpro缓冲液的1:40混合液。将96孔板从培养箱中取出，加入10 μL的PLPro底物，再放回培养箱中孵育60分钟。酶抑制百分比根据公式（7）计算：
\[公式（7）\]
其中 \(RFU_{样品}\) 是含抑制剂孔的平均荧光强度，\(RFU_{阴性对照}\) 是不含抑制剂的空白孔的荧光强度[49]。

**3 结果与讨论**

**3.1 植物化学筛选**
对从E. caffra植物中提取的甲醇（MeOH）和水（H2O）提取物进行了植物化学筛选，使用了表1中列出的各种测试方法。每种测试的对照组均使用相应的提取物溶解在MeOH和H2O溶剂中制备。E. caffra的MeOH和H2O提取物对生物碱、黄酮类、单宁、类固醇/萜烯和酚类呈阳性反应，但H2O提取物对黄酮类呈阴性反应。黄酮类是一类多样的植物次级代谢产物，由于其化学结构和溶剂极性的不同，它们在甲醇中的溶解度高于在水中的溶解度[53,54]。

**3.2 UV-Vis吸光光谱**
图1显示了H2O提取物在250 nm、（280–300）nm和670 nm处的吸收带，以及E. caffra MeOH提取物在250 nm、420 nm、450 nm和670 nm处的吸收带。图1a,b中的670 nm吸收带显示了E. caffra MeOH提取物及其相应的GQDs。然而，H2O提取物和相应的CDs在图1c,d的相同区域没有吸收。叶绿素不溶于水，通常在650–700 nm范围内吸收[55]，这一峰特征表明了叶绿素的存在。叶绿素以及其他植物化学物质如单宁、黄酮类和酚类存在于MeOH提取物中，这为绿色纳米材料的制备提供了所需的吸光特性。其他植物提取物（如Erythrina sacleuxii）在262 nm和290 nm处显示出明显的吸收峰，这是酚类和黄酮骨架的特征[56]。据报道，单宁和叶绿素在640 nm和650–700 nm处吸收[55]。Erythrina crista-galli中的宽吸收峰归因于花青素[55,57,58,59]。E. caffra提取物和碳纳米材料的UV-Vis光谱中明显可见吸收模式的变化，这些变化反映了表面官能态的建立和碳化过程中的分子组成变化。图1b中的MeOH提取物显示出显著的吸收，这是共轭芳香系统中的π–π*跃迁特征，主要在300 nm以下的紫外区域。转化为GQDs后，在280–320 nm处出现吸收增强，这与表面羰基（C=O）或亚胺（C=N）基团引起的额外n–π*跃迁相符。H2O提取物中也可见强深紫外吸收带（约220–260 nm），表明存在许多酚类/黄酮类官能团[39]。图1d中300 nm以下的显著特征和肩峰表明了碳化过程中形成的新表面状态和官能团。在其他关于植物来源CDs的研究中，π-π*跃迁（约250–300 nm）和n-π*跃迁（通常约320–350 nm）归因于芳香/sp2结构域和含氮或氧的表面官能团（例如，在可食用蘑菇CDs中表现为280 nm和320 nm处的峰[60]。因此，UV光谱中的峰宽化与CDs的芳香结构有关。

**3.3 荧光**
当在325 nm激发时，两种碳纳米材料显示出不同的发射颜色，如图2中的插图所示。具体来说，图2a中的GQDs-MeOH呈现红色发射，而图2b中的Carbon Dots-water（CDs-H2O）呈现淡黄色发射。在各自的最大吸收波长处激发这些碳纳米材料时，GQDs-MeOH的发射波长为486 nm，CDs-H2O的发射波长为473 nm。根据紫外-可见光吸收光谱（见图1a,b），红色发射颜色与叶绿素a色素的存在相关。红色发射源自在合成过程中整合到碳骨架中的叶绿素基团[61]。这些纳米材料的计算发射效率分别为19%和7%。根据紫外-可见光吸收光谱（见图1a,b），红色发射颜色与叶绿素a色素的存在相关。之前已有报道从各种植物叶片（如芦荟、菠萝和橙子）中提取出具有不同荧光量子产率的绿色碳基量子点[62]。然而，这些纳米材料是首次使用卡弗埃咖啡（E. caffra）叶片提取物合成的，与从水提取物制备的碳量子点（CDs）相比，甲醇提取物产生的光稳定GQDs具有更高的荧光效率。据报道，GQDs的荧光效率高于CDs，因为这两种碳基纳米材料具有不同的结构特征[9,12,14,18,19]。因此，GQDs的荧光量子产率是由于石墨烯晶格内的侧向限制，而CDs则是由于表面缺陷的量子限制。图2显示了在410 nm和275 nm激发下GQDs的荧光图像：(a) GQDs-MeOH和(b) CDs-H2O。

3.4. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）图3a–d显示了水提取物、CDs-H2O、甲醇提取物和GQDs-MeOH的吸收带。相应纳米颗粒和提取物在FTIR频率下的官能团包括(C–N) 1052.56 cm?1、(C–O) 1234.61 cm?1、(C=O) 1737.87 cm?1和(C–H) 2919.68 cm?1。图3a,b显示了水提取物中C=C峰的宽化和位移，而CDs-H2O中的C=C峰较窄且分裂（1631.54, 1529.26 cm?1），同时(C–N, 1234.61 cm?1)峰增强。然而，图3c,d显示GQDs-MeOH的C=C峰（1737.87 cm?1）也有类似的增加，C=C峰（1607.14 cm?1）发生位移，C–C峰（1453.25, 1355.66 cm?1）发生分裂，C–O峰（1052.56 cm?1）发生宽化，这进一步证实了化学变化。

3.5. 粉末X射线衍射（PXRD）图4a–d中的晶体学峰分别出现在(22, 24, 29, 41, 51)°、(22, 24)°、(22, 24, 29, 41, 51)°和(22, 24, 29, 41, 51)°，并分别被赋予米勒指数(002)、(002)、(100)和(102)，对应于水提取物、CDs-H2O、甲醇提取物和GQDs-MeOH。表3显示水提取物呈100%非晶态，而甲醇提取物中仅有5%的缺陷。CDs和GQDs都是荧光碳纳米材料，但它们具有不同的结构和光学特性。主要差异源于它们的结构组成，这影响了它们的大小、结晶度、层间距和荧光量子产率[12,13,14]。CDs-H2O样品保持了其母体提取物的100%非晶态，没有结晶性。图4a中的尖锐、窄峰与表3中呈现的100%非晶态百分比相矛盾。这种差异通常来源于样品的特性。在使用卡弗埃咖啡进行绿色合成的过程中，植物代谢物（酚类、生物碱和萜类）既作为碳前体，也作为封盖和稳定碳的试剂。植物代谢物作为钝化层留在纳米颗粒表面，并保持其在原始提取物中的振动频率[63,64]。这些峰的连续性表明，功能团的化学环境在碳化后没有发生显著的结构变化。C–H（2919.68 cm?1）峰表明萜类的烷基链长度基本未受碳化影响，说明它们位于纳米颗粒的外壳上[65]。在从卡弗埃咖啡等植物提取物中合成纳米颗粒的过程中，保留萜类的烷基链长度是材料核心-壳层结构的关键指标[66]。在碳化过程中，植物化学物质发生选择性变化，反应性官能团形成核心，而稳定的烷基段留在表面[62]。C=O（1737.87 cm?1）处的羰基峰的一致性证实了含氧基团（如酯或酮）的存在，这对CDs–H2O的水溶性和生物相容性至关重要[63]。C–N键未发生变化表明，生物碱中的含氮基团有效地整合到了纳米颗粒表面，且键长没有显著改变[65]。在绿色合成中，前体分子通常通过非共价相互作用或轻微的结构修饰包裹最终的碳核心，从而在提取物和纳米颗粒之间产生“共同的官能团”，导致FTIR指纹几乎相同[58]。其他绿色合成研究中也发现了类似的结果，其中植物基质中的羟基、羰基和芳香基团的峰与所得量子点表面的峰紧密对应[63,65]。这些峰的连续性表明，功能团的化学环境在碳化后没有发生显著的结构变化。

在绿色合成的背景下，植物提取物及其相应纳米颗粒（CDs–H2O和GQDs–MeOH）之间FTIR峰的出现、消失或位移提供了合成过程中发生的生化转化和表面功能化的直接证据。表2中显示的提取物和相应纳米材料吸收带的显著变化表明，植物提取物中的植物化学物质积极参与了纳米颗粒的还原和稳定[65]。表2列出了每个样品的官能团、FTIR频率、振动和植物化学特性。峰的位移表明功能团的化学环境或键能发生了变化。在绿色合成中，这通常意味着植物化学物质（如酚类）与纳米颗粒表面结合，起到封盖作用，防止颗粒聚集并确保胶体稳定性[65]。卡弗埃咖啡提取物中特定峰的消失表明这些官能团在反应过程中被消耗或发生了化学修饰[65]。例如，某些O–H或特定C–O信号的丧失可能反映了植物代谢物的脱水或氧化，因为它们提供了还原金属离子所需的电子，或者它们在形成碳核心时发生了热分解[65]。新峰的出现——特别是与C=C和C–C基团相关的峰——表明这些官能团是在合成过程中形成的，而在原始植物材料中并不存在[65]。芳香C=C伸缩峰的出现是成功碳化的标志，表明形成了构成CDs和GQDs核心的sp2杂化碳网络[63]。新峰的出现也可以代表在微波辅助或热处理过程中产生的新的表面官能团，这些官能团赋予了纳米颗粒独特的光学和生物学性质[65]。因此，峰的位移表明发生了还原和表面封盖[65]。同时，峰的消失可能与前体代谢物的消耗或分解有关[65]。峰的出现与石墨碳核心的形成和新化学键的形成有关[63,65]。因此，光谱变化证实了合成过程成功地将卡弗埃咖啡的代谢物重新结构化为保留了特定“继承”基团的功能化纳米材料，同时发展出了对其预期应用至关重要的新结构特性。

表2中的水提取物显示，官能团（C–N、C–H和O–H）表明其中含有丰富的生物碱、萜类和酚类[65,67]。这些基团对提取物的生化性质至关重要，因为它们为与生物靶标的潜在相互作用或合成纳米材料的稳定提供了必要的表面化学性质[65,68]。峰的归属得到了芳香物质的鉴定支持。水提取物中1392.25 cm?1处的C–N峰来源于常存在于红花木属（Erythrina）物种和其他用于纳米颗粒稳定的药用植物提取物中的生物碱[65]。1619 cm?1峰反映了通过C=C环伸缩的复杂芳香代谢物（生物碱/酚类）混合物[68]。这些含氮和含氧的官能团对提取物的生物活性至关重要，并为后续的绿色合成应用提供了化学界面[65]。1200–1250 cm?1范围内的吸收带是酯类、醚类和羧酸中C–O伸缩振动的特征[69,70]。这与[69]中卡弗埃咖啡基质中的酚类和单宁的植物化学发现一致。该波数也对应于O–H基团的平面弯曲[71]。鉴于红花木属物种富含多酚，这一峰反映了羟基化芳香环的高浓度。在药用植物提取物中，这一区域通常被归因于烷基胺的C–N伸缩[69,70]。这支持了在我们的植物化学筛选中鉴定出的生物碱的存在。这些峰的持续性表明，功能团的化学环境在碳化后没有发生根本性的结构变化。C–H（2919.68 cm?1）峰是萜类的烷基伸缩，基本上未受碳化影响，表明它们位于纳米颗粒的外壳上[65]。C=O（1737.87 cm?1）峰的稳定性证实了含氧基团（如酯或酮）的保留，这对CDs–H2O的高水溶性和生物相容性至关重要[63,72]。

3.6. 形态和尺寸图5a中的TEM显微照片显示，卡弗埃咖啡水提取物衍生的碳点分布均匀、呈球形且分散良好，没有聚集的迹象。相应的尺寸分布（图5a）表明颗粒直径范围为4.0 ± 1.2 nm。图5b显示，甲醇提取物衍生的GQDs也主要是球形的且分散良好，但尺寸较大，为5.5 ± 1.5 nm，PDI为0.2（见表2）。图5c中GQDs-MeOH的插图显示的d间距为0.08 nm的晶格条纹表明了石墨的片层结构[79]。这两种新合成的纳米材料都表现出相对狭窄的高斯型尺寸分布，表明了良好的均匀性。Shapiro–Wilk检验是在一个纳米粒子群体上进行的，该群体的数量超过50个（n > 50），置信区间为95%；详见附带的补充数据S2(a,b)。纳米粒子的分布呈统计上的正态分布：p > 0.05。这些观察结果与文献中的描述一致，即从生物质或植物提取物中制备的碳点（CDs）通常具有点状形态、良好的分散性，其大小从几纳米到几十纳米不等，具体取决于前体和合成方法[15,16,33,80,81,82]。在动态光散射（DLS）测量中观察到的较大尺寸主要是由于包含了流体动力学层（水化壳），以及DLS对粒子聚集的高敏感性[83,84,85]。相比之下，透射电子显微镜（TEM）测得的尺寸代表的是在真空条件下沉积在干燥网格上的单个纳米粒子[86,87]。X射线粉末衍射（PXRD）与TEM测得的尺寸差异是由于PXRD代表的是大量晶体的平均值，而TEM直接显示的是单个粒子的图像[88,89,90]。图5：(a) CDs-H2O；(b) GQDs-MeOH及其尺寸分布；(c) GQDs-MeOH的d间距插图。

3.7. 泽塔电位和表面电荷
本研究的泽塔电位分析揭示了E. caffra提取物及其相应纳米材料之间的表面电荷差异，突显了溶剂和碳化过程对胶体稳定性的影响。表2显示，水提取物表现出强烈的负电荷（-63.6 mV），这与其中含有大量阴离子官能团一致；而甲醇提取物则表现出正电荷（+49.8 mV），反映了阳离子植物化学物质的稳定作用。水提取物制备的CDs显示出极高的正泽塔电位（+200.0 mV），表明在碳化过程中发生了显著的表面修饰，这可能是由于氮含基团的质子化；而甲醇提取物制备的GQDs则保持中等程度的正电荷。相比之下，这些结果表明碳化显著减小了粒子尺寸并改变了表面电荷，从而增强了胶体稳定性，而提取过程中选择的溶剂则同时影响了初始泽塔电位和粒子尺寸分布。总体而言，大多数样品的泽塔电位均超过了±30 mV的稳定阈值，显示出它们在生物医学领域的应用潜力[91,92]，唯一的例外是GQDs-MeOH（+12.6 mV）。GQDs通常被认为具有较低的细胞毒性但良好的生物相容性[93,94]。虽然有报道称泽塔电位升高与高毒性之间存在正相关关系，但这并非普遍规律[95]。据报道，负电荷泽塔电位（-44.1至-9.7 mV）的纳米材料具有较低的毒性[95]；而一些正电荷泽塔电位（+11.4至+41.4 mV）的纳米材料则表现出高毒性[95]。据报道，负电荷泽塔电位为-15 ± 1.5和-32 ± 4 mV的GQDs非常稳定[96,97]。最稳定的正电荷GQDs的泽塔电位为+26 ± 5 mV。

3.8. 定量抗氧化剂：DPPH清除剂测定
图6(a1–d1)中的插图显示，随着DPPH自由基与测试样品中的抗氧化剂反应，其吸光度逐渐降低。这种DPPH的减少可能通过两种途径发生：氢原子转移或单电子转移[98]。在氢原子转移（主要机制）中，测试样品中的氢原子被转移到DPPH自由基上，生成DPPH-H分子和抗氧化剂自由基[99,100]；而在单电子转移中，抗氧化剂向DPPH自由基捐赠一个电子，形成DPPH阴离子[99,100]。随后，该阴离子通过溶剂或其他可利用的物种发生质子化，重新生成DPPH-H[43,100]。此外，图6a–d中还计算了各样品的IC50值，即在不同浓度（0.05, 1, 10, 100, 1000）μg L?1下的活性变化百分比。所有提取物和纳米材料均显示，需要至少0.05 μg L?1的测试样品浓度才能达到50%的抗氧化活性。

3.9. 生物传感应用：体外检测
3.9.1. 毒性：人肝细胞瘤：Resazurin测定
Resazurin测定常用于HepG2细胞（人肝细胞瘤）中，是一种评估细胞活力、代谢活性和活细胞细胞毒性的成熟方法[101]。Resazurin是一种蓝色的非荧光染料，能被代谢活跃的细胞主动吸收并还原为粉红色的、高荧光的resorufin，如图7所示。测定中使用的对照包括阴性对照（Uc）：PBS；载体对照1：PBS: DMSO 0.01%；载体对照2：PBS: HCl: MeOH 0.01%；以及阳性对照（Pc）：1% Triton X。当将Pc应用于细胞系时，观察到颜色变为蓝色，表明其具有最高的活性。测试样品包括H2O提取物、CDs H2O、MeOH提取物和GQDs-MeOH。染料的还原作用作为生物传感器，颜色变化或荧光强度的变化反映了细胞的活力和代谢状态[102]。细胞传感器利用活的生物细胞作为传感元件，检测外部刺激（如毒素）引起的变化[103]。因此，这种方法有助于了解分析物的生理效应，并为药物评估和毒性检测提供有价值的工具，如图7所示。图7显示，与空白对照（100%）相比，所有测试样品的细胞活力均超过90%。然而，MeOH提取物、H2O提取物、MeOH GQDs和CDs-H2O在HepG2细胞系中的细胞活力分别为92.80%、97.78%、94.82%和91.43%。与对照组相比，DMSO（0.1%）保持了约100.78%的细胞活力，证实了溶剂的非毒性；HCl（0.01%）使细胞活力降至约92.35%，表明其毒性较低；CDs-H2O（91.43%）和GQDs-MeOH（94.81%）的细胞活力降低幅度也小于5%，表明这些纳米材料的毒性较低。H2O和MeOH提取物的细胞活力分别为97.78%和92.79%，表明它们具有良好的生物相容性，通常被认为符合无毒分类标准[11]。所有测试样品的细胞活力均高于90%，表明它们具有较高的生物相容性，且细胞毒性差异较小。这些发现与先前研究结果一致，即GQDs和植物提取物在中等浓度下具有较低的毒性[104,105]。

3.9.2. 病毒细胞毒性：SARS-CoV-2木瓜蛋白酶类似物测定
图9中的基于RFU的荧光蛋白酶测定显示，所有测试抑制剂的酶抑制百分比均超过80%，而阳性对照（基于RFU的荧光蛋白酶测定）的抑制率为100%。测试样品（如MeOH提取物、H2O提取物和CDs-H2O）的抑制百分比分别为87.86 ± 4.75%、87.95 ± 0.77%和87.95 ± 3.08%，相对于GQDs MeOH（94.84 ± 0.94%）。SARS-CoV-2中的木瓜蛋白酶类似物（PLPro）是一种可以通过生物传感器检测其特定酶活性的酶。该蛋白酶在特定位点切割多肽前体，生成具有功能的病毒蛋白[106]。在生物传感中，通过蛋白酶在底物内的特定肽序列处进行切割来产生可测量的信号（如荧光或发光），从而筛选出有效的抗病毒抑制剂[18,107]。已知的抑制剂作为阳性对照，显示出比实验抑制剂更强的抑制效果。当蛋白酶与抑制剂结合时，荧光强度降低（图9），因为较少的荧光团从淬灭剂中释放出来。据报道，植物提取物能够阻止病毒复制，通过抑制RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）蛋白复合物（特别是非结构蛋白NSP12、NSP7和NSP8亚基）来发挥作用，这是病毒RNA基因组复制和转录所必需的酶[108]。先前对Erythrina属植物的研究表明，黄酮类植物化学物质可能是潜在的SARS-CoV-2 3CL蛋白酶抑制剂[109]。在本研究中，虽然H2O提取物中不含黄酮类化合物，但与MeOH提取物相比，抑制效果没有显著差异。然而，GQDs的抑制效果比两种提取物及H2O提取物制备的CDs都要好。一些CDs已被报道能够靶向病毒酶如3CLpro[109]；但GQDs还被报道可以通过干扰病毒与宿主细胞受体的结合来抑制病毒进入和复制[110,111]。病毒刺突蛋白的膜部分（M）、包膜部分（E）以及受体结合域内部在广泛的pH范围内保持正电荷[112,113]。暴露于ACE2受体的病毒包膜部分和S蛋白茎部某些区域则呈现负电荷[112,114]。在本研究中，GQDs显示出最高的泽塔电位，同时具有最强的抗病毒特性和较低的毒性。因此，GQDs在复杂的生物环境中具有较高的胶体稳定性，其表面电荷可能因与蛋白质和离子的相互作用而改变，适用于生物医学应用[97]。GQDs相比CDs具有更强的抗病毒效果，这归因于纳米材料（或测试样品）与冠状病毒之间的静电表面相互作用、物理化学特性以及测试抑制剂的特性。本研究证实，E. caffra提取物及其相应的纳米材料（尤其是GQDs-MeOH）具有潜在的SARS-CoV-2抗病毒活性。

4. 结论
本研究成功展示了使用H2O和MeOH溶剂从E. caffra植物提取物中绿色合成CDs和GQDs。两种提取物均含有多种植物化学物质，但H2O提取物中不含黄酮类化合物。从相应提取物中合成的CDs和GQDs具有增强的或改性的物理化学和生物特性。对E. caffra叶片提取物的植物化学分析发现了五类次生代谢物。这些研究表明，该植物可以作为绿色合成碳点及抑制SARS-CoV-2木瓜蛋白酶（PLpro）的潜在原料。提取物和合成的纳米材料均具有抗氧化特性。光谱和TEM表征证实，绿色合成的纳米颗粒分散良好、胶体稳定性高、呈点状，直径约为4–6纳米。表面电荷和泽塔电位表明这些纳米颗粒具有胶体稳定性。纳米材料的官能团和结构特性表明，GQDs比CDs和两种提取物具有更高的结晶度。水提取物样品表现出较高的表面氧化程度和优异的胶体稳定性，而甲醇提取物样品则具有更多的碳氢化合物官能团，但合成后的稳定性相对较低。两种提取物及其相应的纳米材料对HePG2细胞的毒性均较低。重要的是，GQDs对SARS-CoV-2主要蛋白酶表现出优异的抗病毒活性，支持它们作为廉价、基于植物的纳米材料用于治疗的潜力。总体而言，这些发现为E. caffra作为具有生物医学相关性的功能性纳米材料的可持续前体提供了有力证据。

补充材料
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