增强型无标记SERS技术用于检测临床废弃透析液中的尿毒症毒素

《Analytica Chimica Acta》：Enhanced label-free SERS detection of uremic toxins in clinical spent dialysate

　　韩李|廖俊德|郭一珊|王忠宇|刘宽宏|赖淑雪|林伯深
国立成功大学材料科学与工程系生物医学应用工程材料实验室，台湾台南市大学路1号，701

**摘要**
β2-微球蛋白（β2-m）和瘦素是评估慢性肾病进展和透析效果的关键生物标志物。传统的生化检测方法通常耗时较长或需要昂贵的消耗品。由于β2-m或瘦素的特征功能团的表面增强拉曼光谱（SERS）活性较低，基于底物的无标记SERS的增强强度可能较弱。本研究设计了一种方法，将改性的银纳米颗粒（mAg NPs）与金纳米颗粒/ZrO2基底（Au NPs/fZrO2或Au NPs/pZrO2）结合，以接近目标物种，并构建了一种用于检测临床废弃透析液中的β2-m和瘦素的特征识别系统。

**结果**
使用mAg NPs与Au NPs/ZrO2对纯化的β2-m和瘦素进行了SERS光谱分析，以研究它们的拉曼特征峰。首先，确定了参考峰和指示峰以区分β2-m和瘦素。重要的是，β2-m的主要成分Trp95位于mAg NPs附近，而次要成分Trp60位于蛋白质核心附近，这与瘦素的主要成分Leu51和Phe41相似。

**意义**
该检测系统利用基底上的金纳米颗粒与目标物种周围的改性银纳米颗粒之间的等离子体耦合效应，增强了拉曼信号并产生了局部热点，从而提高了信号的可重复性和检测灵敏度，即使在复杂的临床介质中也是如此。在β2-m的主要成分Trp95附近，特征峰的增强最为明显，而在蛋白质核心或目标物种处的增强效果较弱。这对评估透析性能和监测透析过程具有重要意义。

**引言**
慢性肾病（CKD）是一种长期疾病，其特征是肾脏过滤功能逐渐丧失，全球约有十分之一的成年人受到影响[1]。除了废物清除能力受损外，CKD还会导致全身生化失衡，表现为尿毒症毒素的滞留，从而破坏代谢和炎症稳态。传统的临床指标（如肾小球滤过率（GFR）、血清肌酐和蛋白尿）对疾病分期至关重要，但它们只能提供关于累积毒素分子组成的间接信息。因此，影响治疗反应和患者预后的微妙生化变化往往难以检测[2]。这一限制凸显了开发能够直接识别和追踪驱动CKD进展的特定尿毒症毒素分子的分析方法的迫切需求。
在CKD患者体内残留的各种有毒溶质中，与蛋白质结合的中分子量（mMw）分子尤其有害[3]。它们的积累不仅反映了肾脏清除能力的下降，还直接导致炎症、氧化应激和组织重塑[4]。然而，这些毒素的及时准确监测仍然是一个挑战：它们的浓度低、易于与蛋白质结合以及结构复杂，限制了传统检测方法的准确性[5]。这一限制凸显了开发能够直接识别和追踪驱动CKD进展的特定mMw分子的分析方法的迫切需求。
根据分子大小和蛋白质结合能力，尿毒症毒素通常分为三类：（1）小分子水溶性溶质，如尿素和肌酐；（2）与蛋白质结合的溶质，如吲哚酚硫酸盐和对甲酚硫酸盐；（3）mMw溶质，分子量约为500至60,000 Da[7]。其中，mMw分子越来越多地被认为是CKD并发症的关键介质，因为它们太大而无法通过常规透析膜，但又足够小，可以在体内广泛循环并与目标组织相互作用[8]。
在各种mMw尿毒症毒素中，β2-微球蛋白（β2-m）和瘦素是评估透析效果和全身尿毒症毒性的关键生物标志物，具有重要的临床意义[9]。这些mMw分子代表了CKD分析和治疗的挑战：它们具有生物活性、结构复杂、难以表征且难以清除。尽管进行了常规透析，这些分子的水平仍持续上升，这突显了现有监测方法的局限性，并促使采用分子水平的方法来更准确地评估透析效果[10]。
β2-m是主要组织相容性复合体（MHC）I类分子的重要组成部分，分子量为11.8 kDa。它在抗原呈递和免疫监视中起关键作用，反映了其重要的临床意义。在正常肾功能下，β2-m可以自由过滤和代谢，使其血浆浓度保持在2 mg/L以下。然而，在CKD患者中，β2-m的清除能力受损，导致其积累，血浆浓度通常超过3 mg/L，从而促进淀粉样蛋白沉积、慢性炎症和氧化应激。升高的β2-m水平与透析相关的淀粉样变性密切相关，可以作为长期治疗效果的指标[11]。
瘦素也是一种16 kDa的激素，由脂肪细胞分泌，调节能量平衡和神经内分泌信号转导。在CKD患者中，瘦素排泄缺陷和代谢紊乱导致瘦素浓度显著升高，通常超过20 ng/mL[12]。除了其代谢效应外，瘦素还可能导致内皮功能障碍、胰岛素抵抗和心血管负担，使其成为致病因素和全身毒性的潜在生物标志物[13]。值得注意的是，β2-m和瘦素的生物途径在促进慢性炎症和氧化应激方面具有协同作用，这是驱动CKD进展的核心机制。
尽管β2-m和瘦素具有重要的诊断和预后价值，但在临床样本中的检测仍然极具挑战性。目前用于监测β2-m和瘦素的分析技术主要是侵入性和中心化的，需要采集血液样本并在临床实验室进行后续处理。现有方法无法直接和定性地评估分子状态或结构变化[14]。此外，依赖实验室分析阻碍了透析过程中的即时评估。这些限制突显了当前诊断实践中的关键问题，并强调了开发创新、非侵入性和快速检测策略的必要性，以便在生理条件下表征这些尿毒症毒素。
早期检测和持续监测mMw生物标志物（如β2-m和瘦素）对CKD的临床管理至关重要[15]。传统的β2-m和瘦素检测方法（如酶联免疫吸附测定（ELISA）和电化学免疫测定）耗时较长，不适合实时监测[16,17]。其他方法（包括放射免疫测定、Western blotting、基质辅助激光解吸/飞行时间质谱（MALDI-TOF）以及基于纳米机械或电化学发光的传感器）操作复杂，难以制造成可用于大规模生产的设备[18]。表面增强拉曼光谱（SERS）具有高灵敏度和无标记检测的优点，但由于增强效果弱和重复性差，其在检测中分子量较大蛋白质的应用仍受到限制。为了克服这些限制，我们开发了一种协同SERS系统，将表面改性的银纳米颗粒与金纳米颗粒/ZrO2基底结合，可以稳定形成热点并直接检测临床废弃透析液中的β2-m和瘦素。该方法填补了研究空白，提供了一种快速、灵敏且实用的方法，适用于尿毒症毒素的临床监测。
我们之前的研究表明，SERS在检测病毒颗粒方面表现出优异的性能，这主要是由于病毒蛋白的高表面反应性和小分子大小，有利于它们与SERS活性热点的相互作用[19,20]。然而，当应用于较大和更复杂的蛋白质（如β2-m和瘦素）时，增强机制变得不那么直接。它们的折叠三级结构和拉曼活性残基的有限暴露显著降低了与电磁热点的有效耦合，导致信号强度不稳定和重复性差[21]。
本研究探讨了通过将改性的银纳米颗粒（mAg NPs）与涂有金纳米颗粒的ZrO2纳米纤维基底（Au NPs/fZrO2）或涂有金纳米颗粒的ZrO2多孔基底（Au NPs/pZrO2）结合来检测临床废弃透析液中β2-m和瘦素的可行性。该检测方法将mAg NPs靠近目标分子，并与Au NPs/fZrO2或Au NPs/pZrO2结合，构建了一种用于临床废弃透析液中这两种分子定性检测的系统。本研究旨在解决分析物预处理方面的挑战，以促进分子进入SERS热点区域，从而获得临床显著的β2-m和瘦素SERS信号。

**部分内容**
**SERS活性基底**
使用了两种SERS活性基底，代表两种设计概念：Au NPs/fZrO2和Au NPs/pZrO2。使用四氯化锆（ZrCl4，98%，Acros Organics，比利时Geel）作为合成ZrO2的前体。通过将适量的ZrCl4溶解在10 mL异丙醇（99.8%，Panreac AppliChem Barcelona，西班牙）中制备前体溶液。经过24小时老化后，将100 mL每种前体在25°C的环境条件下旋涂到硅片上。

**β2-m和瘦素分子的结构和纯度分析**
如图1所示，通过质谱分析了β2-m和瘦素分子的结构和纯度，以了解它们的分子组成和功能团，这为SERS光谱特征与增强分子结构之间的对应关系提供了参考，并用于识别未知测试样本[27]。图1（a）展示了β2-m的分子结构，强调了关键功能团，如（1）色氨酸（Trp）、（2）酪氨酸（Tyr）和（3）缬氨酸（Val）。

**结论**
本研究提出了一种用于检测临床废弃透析液中β2-m和瘦素的无标记SERS方法。首先，通过将mAg NPs与其分子功能团结合并加载到纳米纤维或多孔ZrO2基底上，建立了纯β2-m和瘦素的参考标准。这两种基底都提高了检测灵敏度，而mAg NPs通过接近β2-m或瘦素的功能团，显著增强了拉曼信号。

**作者贡献声明**
韩李：方法学、撰写——初稿。廖俊德：撰写——审阅与编辑。郭一珊：数据管理、正式分析。王忠宇：方法学、软件、撰写——审阅与编辑。刘宽宏：资源。赖淑雪：方法学。林伯深：数据管理、软件。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

**致谢**
本研究得到了国家科学技术委员会（授权号：113-2321-B-006-023-、113-2221-E-006-032-MY2）的支持。此外，该研究还得到了教育部高等教育Sprout项目对国立成功大学大学发展总部的部分支持（授权号：D112-F2523）。