基于金纳米粒子的无电泳比色检测方法，用于等位基因特异性PCR-SNP基因分型

《Analytical Biochemistry》：Gold Nanoparticle-Based Electrophoresis-Free Colorimetric Detection Method for Allele-Specific PCR-SNP Genotyping

　　

苏里亚·坎特·维尔马（Surya Kant Verma）|拉尔·克里尚·库马尔（Lal Krishan Kumar）|穆尔利·达尔·米特拉（Murli Dhar Mitra）|吉滕德拉·库马尔（Jitendra Kumar）|普拉尚特·辛格（Prashant Singh）|罗山·莫希丁（Roshan Mohiddin）|瓦里杰·纳扬（Varij Nayan）|迪尔·辛格（Dheer Singh）|苏尼尔·库马尔·昂特鲁（Suneel Kumar Onteru）

分子内分泌学、功能基因组学与系统生物学实验室，动物生物化学部门，ICAR – 印度国家乳品研究所，卡纳尔（Karnal）

摘要

传统的等位基因特异性PCR（AS-PCR）基因分型方法需要使用凝胶电泳和溴化乙锭（EtBr），成本较高，尤其是在发展中国家。此外，该方法对操作人员存在健康风险，因为需要专门的设备和有毒的溴化乙锭。因此，本研究开发了一种简单且经济高效的比色基因分型方法，该方法利用金纳米粒子溶液（AuNPs）和未经修饰的引物。具体来说，15μl的AuNPs溶液足以检测5μl PCR产物中的扩增片段。在这种方法中，扩增的PCR产物呈现红色，而非扩增的PCR产物在不含染料的PCR Mastermix中呈现蓝色。透射电子显微镜（TEM）观察发现，扩增的PCR产物中AuNPs被固定，而非扩增的PCR产物中AuNPs发生聚集，从而分别呈现红色和蓝色。该方法用于对水牛六个基因（Akr1c3、Plg、Myf5、Sec14l2、Tpm1 和 Lama2）中的六个SNP进行基因分型，结果与琼脂糖凝胶电泳分析的结果完全一致。因此，结合AuNPs的AS-PCR为单核苷酸多态性（SNPs）的扩增和非扩增产物提供了一种易于视觉识别的方法。此外，该方法有潜力替代琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭的使用以及紫外透射仪。

引言

单核苷酸多态性（SNPs）是指基因组中特定位置单个核苷酸的差异。通常，SNPs大约每1000个核苷酸出现一次。由于高密度和突变稳定性，SNPs成为人类和兽医物种群体遗传学研究中常用的核苷酸标记。兽医遗传学中主要使用的基因分型方法包括基于限制性位点核苷酸变异的PCR-based-RFLP（限制性片段长度多态性）；使用引物3’端特定单核苷酸变化进行等位基因特异性PCR（AS-PCR），随后通过电泳分析PCR产物大小（Verma等人，2024；Verma等人，2022；Kumar等人，2022；Madnalwar等人，2010）；高分辨率熔解分析（HRM），该分析考虑了GC含量的长度及其熔解温度（Tm）和碱基互补性（Zhou等人，2025；Klafke等人，2019）；以及基于荧光染料和特定探针标记的TaqMan方法（Tao等人，2025；Kovalchuk和Arkhipova，2023）。此外，还使用了基于测序的方法，如基于ddNTP的链终止方法（Gershoni等人，2023）和下一代测序（NGS）/高通量测序（Gurgul等人，2019），这些方法允许大规模发现新的SNPs并进行基因分型。

在资源有限的实验室中，需要对大量动物进行基因分型，因此需要一种用户友好、快速且低成本的SNP基因分型方法。一种简单的SNP基因分型方法是AS-PCR，该方法使用等位基因特异性引物扩增目标序列（Devyatkin等人，2024；Hohman等人，2019）。由于AS-PCR的执行方式与传统PCR相同，随后通过琼脂糖凝胶电泳检测基因型（Zheng等人，2022），因此它似乎适用于即时检测（POC）应用（Manage等人，2014；Verma等人，2024；Verma等人，2022；Kumar等人，2022）。然而，尽管方法简单，但基因分型分析及所需设备的成本仍然较高，包括热循环仪、琼脂糖凝胶电泳装置和紫外透射仪（Mitra和Sharma，2021；Pavan等人，2020）。AS-PCR方法的另一个显著缺点是在琼脂糖凝胶电泳中使用溴化乙锭（EtBr）来检测扩增的PCR产物。众所周知，EtBr是一种化学染料，在紫外光下会强烈发光，当它插入核苷酸碱基对之间时可以检测到低至10 ng的DNA（Lee等人，2012）。由于EtBr与DNA/RNA结合具有高度致癌性，可能会对使用者造成伤害（Gandhi等人，2022）。因此，无需琼脂糖凝胶电泳的基于PCR的比色技术可以避免使用这种致癌物，并满足大规模基因分型的需求，用于诊断和预后（Safavieh等人，2014；Srivastava和Prasad，2023）。

纳米技术在多个生物学领域迅速发展。纳米粒子独特的化学和物理特性，如适合功能化的化学表面、形状依赖的电子性质以及独特的聚集特性，使它们在生物分子传感中非常有用（Jazayeri等人，2018）。特别是金纳米粒子被广泛用于各种纳米生物传感应用（Gopinath等人，2014），如基因组DNA传感（Myakishev等人，2001）、无需离心机的DNA提取（Varona和Anderson，2019）和mRNA检测（Moros等人，2018）。AuNPs的聚集会导致其状态发生变化，从红色或粉色变为蓝色或紫色（Hong等人，2023）。先前的研究发现，扩增的DNA负责固定AuNPs或包裹AuNPs，从而防止其在PCR溶液中因盐而聚集（Wang等人，2022；Deng等人，2013）。另一项报告表明，金纳米粒子主要与硫原子结合，从而减少聚集并避免颜色变化（Zhou等人，2014）。在这些研究中，使用了修饰过的硫醇化引物进行AS-PCR，以开发BRCA1基因突变的比色SNP基因分型检测方法（Jung等人，2011b）。然而，尚未有研究使用未经硫醇化修饰的引物进行此类研究。

本研究假设，在含有引物的PCR反应混合物中按一定比例加入AuNPs后，可以区分扩增产物和非扩增产物。不含染料的反应混合物中的扩增PCR产物可能呈现红色或粉色（无颜色变化），而未添加任何染料的非扩增PCR产物则呈现蓝色，从而无需电泳即可用肉眼识别DNA的扩增情况（图1）。PCR反应混合物中的蓝色可能是因为PCR Mastermix缓冲液中的钾（K⁺）和铵（NH⁴⁺）离子导致AuNPs聚集。利用扩增PCR产物包裹AuNPs的特性，本研究对其进行了验证，并为水牛中六个选定基因（Akr1c3（Aldo-Keto还原酶家族1成员C3）、Plg（纤溶酶原）、Myf5（肌生成因子5）、Sec14l2（SEC14样脂质结合蛋白2）、Tpm1（原肌球蛋白1（Alpha））和Lama2（层粘连蛋白2）的几个SNP开发了一种基因分型方法，这些基因与脂肪组织生物学相关。

章节片段

DNA样本

本研究使用了从新德里屠宰场收集的29个水牛脂肪组织样本。样本收集是在获得机构动物伦理委员会批准（批准号46-IAEC-20-3）后，作为一项名为“早期哺乳压力特异性脂肪组织中的选择性基因与产后乏情期的关联”的博士项目进行的。所有29个脂肪组织样本的基因组DNA（gDNA）均使用Tritizol? LS试剂分离。

基因组DNA在两个200μl的试管中分别进行PCR扩增，一个试管中加入Alb基因引物（阳性对照），另一个试管中不加引物（阴性对照）。扩增后，用肉眼观察产物的颜色变化，期望扩增的PCR产物保持粉色，而非扩增的PCR产物变为蓝色。通过逐渐增加AuNPs的用量来观察这种颜色变化。

讨论

本研究的目的是开发一种简单快速的基因分型方法，该方法不使用电泳装置。本研究的新颖之处在于使用未经修饰的引物，与之前的研究（Jung等人，2011b）不同，之前的研究中引物经过硫醇化处理以与金纳米粒子相互作用。相反，本研究依赖于扩增的双链DNA本身吸附到柠檬酸包覆的金纳米粒子上的能力，从而实现空间位阻效应。

苏尼尔·库马尔·昂特鲁（Suneel Kumar Onteru）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，资源管理，项目协调，资金获取，数据分析，概念构思。迪尔·辛格（Dheer Singh）：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源管理，项目协调，资金获取，数据分析，概念构思。拉尔·克里尚·库马尔（Lal Krishan Kumar）：方法学研究，实验设计，数据分析。苏里亚·坎特·维尔马（Surya Kant Verma）：撰写 – 原稿，方法学研究，实验设计，资金获取

Xia等人，2010；Wangkumhang等人，2007

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

作者感谢ICAR-国家乳品研究所提供的基础设施，以及印度国家农业科学基金对本研究的财政支持（资助编号NASF/GTR-5005/2015-16）。苏里亚·坎特·维尔马（项目编号RBMH/FW/2020/23；项目ID：2020-8398）感谢印度医学研究委员会（ICMR）主任提供的ICMR-SRF奖学金。M. D. 米特拉博士还想感谢CIFC，IIT（BHU）的支持。