定时上皮覆盖技术可在抑制伤口微组织纤维化重塑的同时促进缺损闭合

《ACS Omega》：Timed Epithelial Overlay Preserves Defect Closure While Suppressing Fibrotic Remodeling in Wound Microtissues

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重新上皮化可以恢复屏障功能，并提供由上皮细胞产生的旁分泌信号，这些信号可以调节成纤维细胞的激活、收缩和纤维化重塑。然而，上皮覆盖是否能够在不损害成纤维细胞驱动的闭合过程的情况下限制类似疤痕的重塑，目前尚不清楚。在这里，我们开发了一个由弹性支架支撑的承重NIH-3T3-胶原伤口微组织模型。为了量化上皮细胞对闭合动态和纤维化重塑的调节作用，我们在模型中引入了一个500微米的圆形微缺损。MDCK上皮细胞的覆盖显著抑制了由收缩驱动的缺损闭合，并抑制了伤口边缘的局部增殖反应。相比之下，将上皮细胞的添加时间延迟到受伤后48小时，可以在保持快速闭合的同时减轻整个微组织的压缩。这种效应部分可以通过外源性前列腺素E2来模拟，这表明可溶性上皮来源的信号在其中起作用。延迟添加上皮细胞还能维持愈合区域的成纤维细胞重新分布，并有效覆盖再生表面。此外，延迟添加上皮细胞显著抑制了微组织中的肌成纤维细胞分化和纤维连接蛋白的积累，从而减弱了径向重塑梯度。这些发现确定了一个大致的伤口后上皮细胞加载窗口，在此窗口内，上皮细胞既能保持闭合效率，又能限制类似疤痕的重塑。该平台为优化上皮辅助伤口治疗和评估工程化3D伤口微环境中的抗纤维化干预措施提供了定量框架。

**引言**
伤口愈合是一个高度协调的多阶段过程，其中不同的细胞群体和信号通路以时空受控的方式相互作用：
(1) 在增殖和重塑阶段，成纤维细胞沉积胶原蛋白，重组细胞外基质（ECM），并产生由肌动蛋白-肌球蛋白驱动的收缩力，从而闭合组织缺损并恢复机械完整性。
(2) 这些功能主要由分化为α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性的肌成纤维细胞介导，它们加速伤口收缩和缺损闭合。
(3) 当肌成纤维细胞过度或持续激活时，会导致病理性组织压缩、异常的胶原蛋白组织和纤维化疤痕形成。
(4,5) 因此，一个核心挑战是在限制长期纤维化重塑和功能损伤的同时促进及时闭合。
(6?8) 伤口形成通常伴随着大量的上皮细胞丢失，导致屏障破坏、感染风险增加以及伤口边缘信号传导改变。
(9) 因此，重新上皮化不仅对于表面恢复至关重要，也对组织稳态至关重要。越来越多的证据表明，上皮细胞通过旁分泌介质（如转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-1（IL-1）和前列腺素E2（PGE2）调节成纤维细胞的行为，这些介质可以调节成纤维细胞的增殖、表型激活和ECM合成。
(10?12) 与这一观点一致，动物和体外研究表明，及时的重新上皮化和上皮-成纤维细胞之间的相互作用与减少纤维化重塑有关。
(13,14) 在临床上，大型上皮缺损（如糖尿病足溃疡和深度烧伤）通常通过补充上皮细胞来治疗，包括分层皮肤移植、皮肤替代物和基于细胞的敷料，以重建屏障功能和上皮来源的调节信号。
(15?17) 自体上皮细胞的采集以及喷雾或局部给药进一步提供了侵入性较小的选择，同时提高了供体部位的可用性。
(18,19) 然而，目前尚不清楚上皮细胞的补充是否能够在不损害由收缩驱动的伤口闭合的情况下抑制肌成纤维细胞的激活和纤维化重塑。部分原因是许多实验系统是静态的、二维的，或者缺乏损伤背景，这些系统往往孤立地研究上皮细胞对伤口闭合或纤维化的影响。
(20,21) 这一限制阻碍了在伤口护理和组织工程构建中合理设计上皮辅助的抗纤维化策略。
(18) 在这里，我们使用一个由弹性微弦支撑的3T3成纤维细胞-胶原微组织平台以及通过打孔引入的标准圆形微缺损来解决这些问题。通过将MDCK上皮细胞覆盖在微组织表面，我们建立了一个3D上皮-基质共培养损伤模型，该模型能够定量评估：
(i) 上皮覆盖如何调节成纤维细胞驱动的微缺损闭合；
(ii) 上皮输入如何重塑缺损周围成纤维细胞增殖、凋亡、肌成纤维细胞分化和ECM重塑的空间模式；
(iii) 上皮细胞加载的时间是否可以优化，以限制类似疤痕的纤维化，同时不显著延迟闭合。结果揭示了上皮细胞对成纤维细胞介导的闭合的时间依赖性调节，并为工程化3D伤口微环境中的上皮辅助抗纤维化策略提供了定量框架。

**材料与方法**
**微弦支架的制备**
微弦支架是根据我们之前报告中的改进方案制作的。
(22) 使用一个带有方形支架图案的硅模具（苏州文豪，中国，长度=2.4毫米，截面：50微米高，100微米宽）来制作负模聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具（Sylgard 184，10:1基材与固化剂比例，Dow Corning，美国）。该模具在55瓦的氧气等离子体下处理1分钟（PT-5S，三河博达，中国），然后涂覆1%（重量/体积）的聚乙烯醇（PVA，Aladdin，中国）。空气干燥后，将未固化的PDMS填充到微槽中，并在80°C下固化4小时。将矩形PDMS块（2毫米高）粘接到支撑弦的末端，进行等离子体处理，并在PDMS块的相反侧用12毫米的玻璃盖片密封。将支架浸入水中溶解PVA层后，释放出支架。放置一个中央PDMS支撑物（1毫米高）以固定未凝胶化的胶原。使用硅胶油脂（Baysilone，GE，美国）将支架从玻璃盖片的底部粘接到12孔培养板的基底上，以防止长期培养过程中支架漂移。

**共培养微组织和微缺损的制备**
小鼠NIH-3T3成纤维细胞和Madin–Darby犬肾（MDCK）上皮细胞（美国类型细胞培养收集）在添加了10%胎牛血清（FBS，Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco，Life Technologies，美国）中培养，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。
对于微组织的制备，将3T3细胞用胰蛋白酶处理，并与中和后的鼠尾I型胶原（Advanced Biomatrix，美国）混合，最终浓度为1×10^6细胞/毫升，置于2毫克/毫升的胶原溶液中。将20微升的细胞-胶原混合物滴加到每个支架上，在37°C下聚合45分钟，然后覆盖2毫升培养基。
对于微组织的药物处理，在培养基中加入前列腺素E2（PGE2，Sigma-Aldrich），最终浓度为10微摩尔。对于无细胞对照实验，在微组织表面施加20微升的8×10^5细胞/毫升聚苯乙烯微球（直径10微米，无锡瑞格生物技术，中国）。
对于共培养，小心吸出培养基，直到只剩下薄液膜覆盖微组织表面。然后将20微升的MDCK或3T3细胞悬浮液（浓度为0–8×10^5细胞/毫升）轻轻滴加到聚合的3T3-胶原微组织上，并孵育90分钟以使其附着。每个孔中填充2毫升新鲜培养基，并在安装到显微镜之前保持在培养箱中。在某些实验中，MDCK细胞在共培养前用5微摩尔的CellTracker Green（Thermo Fisher Scientific，美国）预标记。

**损伤后的处理**
在压缩48小时后，所得微组织的厚度约为200–300微米。使用25号皮下针在立体显微镜下在每个微组织的几何中心创建一个全厚度圆形切除微缺损（直径500微米）。该缺损大小约为组织宽度的20%，这样可以量化闭合动态，同时保持整体组织完整性。使用25号针可以确保样品之间缺损的几何形状一致。针头推进至刚好接触基底以确保完全穿透，然后移除组织塞子以生成全厚度缺损。用温培养基冲洗孔一次以清除残留物。立即获取明场图像，确认缺损是干净、圆形、全厚度的，边缘清晰且无残留塞子。

**实验设置和活细胞成像**
使用Axio Observer 7荧光显微镜（Carl Zeiss MicroImaging，德国）在37°C和5%二氧化碳条件下，配备5×/0.16 NA物镜进行成像。使用ORCA-Flash4.0相机（Hamamatsu，日本）进行明场多位置活细胞成像，从创建微缺损后立即开始。每24小时进行一次成像。每次成像后，小心移除一半的培养基，并替换为等量的新鲜培养基。为了量化微组织的收缩，测量成对PDMS微弦内边缘之间的距离作为最小距离。使用ImageJ将图像转换为二值掩模来量化缺损区域。使用适当的大小/圆形滤波器识别和测量感兴趣的缺损区域（ROI）。对于每个样本，导出t0时的初始面积（A0）和随后的面积A(t)，以计算归一化的缺损面积A(t)/A0。

**微组织硬度测量**
使用配备力敏探针和平头圆柱形压头（直径400微米；力分辨率0.5微牛顿）的微压痕系统（MicroTouch，苏州Nators，中国）来测量微组织的机械性能。探针安装在三轴运动台上，垂直定位的分辨率为5纳米。使用制造商的软件以50赫兹的频率记录力和位移数据。测量时，微组织在添加了20毫摩尔HEPES（Sigma-Aldrich）的培养基中培养48小时。为了最小化基底的影响，在PDMS支撑物和微组织之间放置一个玻璃盖片。在显微镜指导下，以2微米的步长将压头尖端向样品推进，直到检测到接触，此时力会持续增加。然后以2微米/秒的速度将压头压入微组织，直到压痕深度达到20微米，相当于大约10%的压缩应变，在此范围内观察到近似线性的力-压痕响应。记录力-压痕数据以供后续分析。使用简化的线性弹性模型（假设压头下的应力分布均匀）从力-压痕曲线的线性区域估计表观杨氏模量：E = Fh/(Aδ)，其中F是施加的力，A是压头面积，δ是压痕深度，h是初始微组织厚度。

**免疫荧光染色和量化**
微组织在室温下用4%甲醛（Sigma-Aldrich，美国）固定4小时，在PBS中渗透0.5% Triton-X100（Sigma-Aldrich）30分钟，然后用1%牛血清白蛋白（BSA，Roche，瑞士）封闭30分钟。随后用一级抗体孵育样本：小鼠抗α-SMA（BM0002，Boster，中国）、兔抗磷酸化组蛋白H3（pH3）（PA5-17869，Thermo Fisher Scientific）、小鼠抗泛细胞角蛋白（ab86734，Abcam，英国）或兔抗层粘连蛋白（ab92547，Abcam）。洗涤后，用Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠或驴抗兔二抗（Thermo Fisher Scientific）孵育样本。使用四甲基罗丹明（TRITC）标记的鬼笔环肽（Yeasen Biotech，中国）染色F-actin，用DAPI（Sigma-Aldrich）染色细胞核。使用配备20×/0.5 NA物镜（Carl Zeiss MicroImaging）的LSM 710共聚焦显微镜获取共聚焦图像。

**免疫荧光图像分析**
使用ImageJ（NIH）以盲法分析共聚焦图像，以空间分辨的方式量化闭合微缺损周围肌成纤维细胞的分化和ECM重塑。对于所有实验，保持给定标记物的共聚焦采集设置（激光功率、增益、偏移）不变。从微组织表面下方10微米开始采集z堆栈，步长为10微米，共六个切片（总采样厚度为50微米）。然后使用最大强度投影将z堆栈图像合并，生成单个复合图像进行分析。在共聚焦显微镜的明场照明下识别原始微缺损的几何中心，然后从同一视野中获取共聚焦图像，无需移动样本。该点被用作径向分析的起点。为了量化α-SMA和纤维连接蛋白的空间分布，从伤口中心到微组织边缘生成半径递增为50微米的同心环形ROI。测量每个环带的平均荧光强度。

**细胞增殖和凋亡检测**
为了进行增殖分析，用共聚焦显微镜对微组织进行pH3免疫染色。根据DAPI染色的细胞核计算每个微组织中的3T3细胞总数。pH3阳性率计算为（pH3阳性细胞数/总细胞数）× 100%。为了检测凋亡，将微组织固定、渗透，并在37°C下用One-Step TUNEL凋亡检测试剂盒（Beyotime，中国）孵育4小时。通过Cy3标记的TUNEL染色识别微组织中的凋亡3T3细胞。凋亡率计算为（TUNEL阳性细胞数/总细胞数）× 100%。

**统计分析**
除非另有说明，所有实验至少使用四个独立的微组织进行。统计分析和曲线拟合是使用Prism 10（GraphPad，美国）进行的。数据正态性通过Shapiro–Wilk检验进行评估。两组之间的比较使用双尾学生t检验进行，多组之间的比较使用单因素方差分析（ANOVA）后进行适当的后续检验。数据以平均值±标准差（S.D.）表示，独立样本的数量（n）在图例中标明。

结果1. 上皮细胞抑制共培养微组织中的微缺陷闭合
为了确定上皮细胞是否调节成纤维细胞驱动的缺陷闭合，我们建立了一个支架支持的3D微组织模型（图1A）。3T3成纤维细胞嵌入I型胶原蛋白中，并铸在2.4毫米的正方形PDMS微弦框架上。MDCK上皮细胞可以选择性地以定义的浓度播种在微组织表面。培养48小时后，这些结构压缩成具有抗拉力的微组织。然后通过冲压引入一个中央圆形微缺陷，MDCK(?)微组织的缺陷面积为0.064 ± 0.005平方毫米，MDCK(+)微组织的缺陷面积为0.059 ± 0.004平方毫米，表明两种条件下的初始缺陷大小相当。缺陷闭合过程在接下来的120小时内被监测。在MDCK(?)微组织中，明场成像显示快速的收缩驱动闭合，伤口后120小时缺陷几乎完全消失（图1B）。相比之下，高剂量MDCK覆盖（8 × 10^5细胞/毫升）的微组织在同一时期仍保留较大的残留缺陷。为了确定这种抑制效应是否是上皮细胞特有的，我们进行了额外的对照实验，其中MDCK覆盖层被替换为3T3成纤维细胞（模拟无上皮细胞群体）或10微米微球（模拟纯物理表面负荷）。这两种情况都没有再现MDCK细胞观察到的缺陷闭合抑制效应（图1B），表明该效应是上皮细胞覆盖特有的，而不是添加细胞或物理颗粒到微组织表面的普遍结果。

图1
图1. 上皮细胞覆盖抑制支架支持的微组织中的微缺陷闭合。(A) 支架支持的3T3-胶原蛋白微组织伤口模型的示意图，显示了在PDMS微弦支架上形成的微组织、可选的MDCK上皮细胞覆盖层以及通过冲压创建的中央圆形微缺陷。(B) 伤口前及创建缺陷后不同时间点的微组织明场图像，分别在没有MDCK、有MDCK或3T3、或以相同播种密度添加10微米微球的情况下。黄色虚线勾勒出用于量化的分割缺陷边界。刻度尺 = 500微米（伤口前）和100微米（伤口后）。

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共聚焦成像证实MDCK细胞定位于胶原蛋白嵌入的3T3成纤维细胞上方的微组织表面，形成了上皮细胞覆盖层（图2A）。压痕测量显示压缩后的微组织表现出约210帕的杨氏模量，MDCK(?)和MDCK(+)条件之间的整体硬度没有显著差异（图2B）。定量时间过程分析显示MDCK覆盖层对闭合有剂量依赖性的抑制作用。MDCK(?)微组织中的标准化缺陷面积在大约48小时内保持接近基线水平，然后急剧下降，在120小时时接近零，而增加的MDCK播种浓度逐渐抑制闭合并稳定了残留缺陷（图2C）。剂量-响应分析显示饱和行为，在8 × 10^4细胞/毫升及以上的播种密度之间没有观察到统计学上的显著差异（图2D）。因此，选择8 × 10^4细胞/毫升作为后续实验的代表性条件。为了将播种浓度与有效上皮细胞负荷联系起来，我们通过在播种后24小时用CellTracker Green预标记MDCK细胞来量化微组织上的表面细胞密度。在8 × 10^4细胞/毫升时，MDCK细胞在微组织上的平均表面密度为154 ± 32细胞/平方毫米（图2E）。总体而言，这些数据表明，在这种3D共培养损伤模型中，上皮细胞覆盖层以剂量依赖的方式抑制成纤维细胞驱动的微缺陷闭合。

结果2. 上皮细胞覆盖抑制成纤维细胞的伤口边缘增殖而不改变细胞凋亡
图2
图2. MDCK覆盖层不改变微组织的整体硬度，但以剂量依赖的方式抑制缺陷闭合。(A) 共聚焦图像显示培养48小时后，位于胶原蛋白嵌入的3T3细胞（vimentin，绿色）上方的表面定位的MDCK细胞（pan-CK，红色）。刻度尺 = 100微米。(B) 通过微压痕测量的48小时培养微组织的表观杨氏模量（每组n ≥ 4个微组织）。(C) 随着MDCK播种浓度增加，微组织中标准化缺陷面积的时间过程。(D) 120小时时的标准化缺陷面积与MDCK播种浓度的关系。红线表示剂量-响应关系的非线性饱和拟合（R2 = 0.9692）。(E) 在指定浓度播种后24小时测量的MDCK细胞表面密度（每组n ≥ 4个微组织）。

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为了将上皮细胞对闭合的抑制作用与成纤维细胞的行为联系起来，我们分析了三种闭合状态下的3T3增殖和凋亡：72小时时半闭合的MDCK(?)、120小时时闭合的MDCK(?)以及120小时时未闭合的MDCK(+)。对于每种情况，细胞在100微米宽的缺陷周围区域（伤口）和距离伤口边缘>300微米的远端非伤口区域进行了量化。针对有丝分裂标志物pH3的免疫染色显示了明显的空间和状态依赖性增殖模式（图3A）。在伤口边缘，半闭合的MDCK(?)微组织显示出显著升高的pH3阳性比例（34.2 ± 3.3%）。这种增殖活性在120小时的闭合MDCK(?)微组织中急剧下降（1.1 ± 0.3%），达到与MDCK共培养组伤口边缘的水平（2.9 ± 0.3%）没有显著差异（图3B）。在非伤口区域，所有条件下的增殖都保持较低，而MDCK共培养选择性地抑制了通常在伤口边缘观察到的增殖。

图3
图3. 上皮细胞覆盖层调节微缺陷周围的成纤维细胞增殖和凋亡。(A) 72小时（半闭合）或120小时（完全闭合）无MDCK覆盖层以及120小时有MDCK覆盖层时微组织中pH3（绿色）/DAPI（蓝色）染色的代表性图像。左侧和右侧面板分别显示伤口和非伤口区域。黄色曲线标记伤口边缘和100微米宽的缺陷周围区域的边界。刻度尺 = 100微米。(B) 三种条件下伤口和非伤口区域中pH3阳性3T3细胞（占总核的百分比）的量化（n = 5个微组织，每个ROI至少有100个细胞）。(C) 与(A)相同条件下的代表性TUNEL（红色）/DAPI（蓝色）图像。刻度尺 = 100微米。(D) 三种条件下伤口和非伤口区域中TUNEL阳性3T3细胞（占总核的百分比）的量化（n = 5个微组织，每个ROI至少有100个细胞）。

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TUNEL染色显示所有条件下的凋亡率都很低（<5%），表明微组织的活力得以维持（图3C）。伤口边缘的凋亡比例在各组中接近基线（约1%），而在后期时间点非伤口区域的凋亡率仅有轻微增加（图3D）。尽管不能排除早期短暂的凋亡事件（<72小时），但均匀较低的凋亡率和与闭合状态无明显相关性表明它不太可能是该模型中的主要驱动因素。相反，快速的收缩驱动伴随着闭合前沿的局部成纤维细胞增殖增加。上皮细胞覆盖层阻止了通常在边缘观察到的强烈增殖反应，可能对微缺陷闭合起到“制动”作用。

结果3. 延迟的上皮细胞覆盖层在保持快速成纤维细胞驱动的闭合的同时延缓闭合动态
接下来我们询问是否可以将上皮细胞覆盖层延迟到伤口后的一个窗口期，以保持快速的成纤维细胞驱动的闭合。MDCK细胞（8 × 10^4细胞/毫升）在伤口后立即（0小时）或伤口后48小时添加，然后至少监测闭合120小时（图4A）。明场成像显示上皮细胞添加的时间产生了不同的闭合结果（图4B）。定量上，48小时添加MDCK并没有显著延迟闭合动力学，在120小时时达到接近完全闭合，与MDCK(?)对照组相当（图4C）。相比之下，0小时添加MDCK显著减缓了闭合，并在120小时时留下了显著的残留缺陷。这些结果确定了一个大约48小时的伤口后窗口期，在此期间可以引入上皮细胞而不影响闭合效率。

图4
图4. 延迟的上皮细胞覆盖层在限制微组织压缩的同时保持微缺陷闭合。(A) 支架支持的微组织伤口模型的示意图，显示在伤口后0小时或48小时添加MDCK覆盖层，随后继续培养至120小时。(B) 在伤口后0小时或48小时添加MDCK覆盖层的微缺陷的代表性明场图像。黄色虚线标记用于量化的分割缺陷边界。刻度尺 = 100微米。(C) 无MDCK和在伤口后0小时或48小时添加MDCK的微组织的标准化缺陷面积的时间过程（每组n = 7个微组织）。(D) 120小时时添加MDCK覆盖层或用外源性PGE2处理（在伤口后0小时或48小时）的微组织的标准化缺陷面积（每组n ≥ 6个微组织）。(E) 120小时时MDCK(?)、MDCK(0小时添加)和MDCK(48小时添加)条件下PDMS微弦间距的量化（每组n = 5个微组织）。

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为了区分上皮细胞覆盖层的抑制效应是来自物理/机械覆盖还是生化信号，我们接下来检查了外源性前列腺素E2（PGE2）的效果，这是一种已知可以抑制成纤维细胞收缩性的可溶性因子。有趣的是，PGE2处理再现了上皮细胞覆盖层观察到的阶段依赖性行为。当在伤口时添加PGE2时，PGE2适度减缓了缺陷闭合。相比之下，在伤口后48小时添加PGE2并没有显著改变闭合动力学，与延迟的MDCK覆盖层观察到的行为非常相似（图4D）。这些结果表明，上皮细胞对成纤维细胞驱动的闭合的调节不太可能仅由上皮细胞的物理覆盖引起，而是与可溶性生化信号的贡献一致。

为了评估组织尺度的力学特性，我们通过测量PDMS微弦间距作为整体微组织压缩的宏观指标。在120小时时，MDCK(?)微组织显示出最小的弦间距，与最高的压缩程度一致。无论是0小时还是48小时的上皮细胞覆盖层，相对于MDCK(?)对照组，弦间距都显著增大（图4E）。这表明即使在上皮细胞覆盖层在闭合开始后添加，也能抑制整体压缩。

接下来我们通过使用pan-keratin（pan-CK）免疫荧光检查再生表面上的MDCK分布来评估再上皮化情况。如图5A所示，120小时时在再生伤口区域内清晰可见MDCK阳性簇。pan-CK分割的量化显示，MDCK在再生区域的覆盖面积与相邻非伤口区域的覆盖面积相当（图5B），表明在伤口后48小时添加的MDCK细胞可以迁移到新闭合的表面并在72小时内积累到相似的水平。我们进一步量化了愈合区域内的成纤维细胞积累情况。120小时时再生伤口区域内的3T3核密度在MDCK(?)和MDCK(48小时添加)微组织之间没有差异（图5C），表明延迟的上皮细胞覆盖层不会减少闭合区域内的最终成纤维细胞数量。

图5
图5. 延迟的上皮细胞覆盖层支持愈合区域的上皮细胞覆盖，而不减少成纤维细胞的重新填充。(A) 120小时时MDCK(48小时添加)条件下伤口和相邻非伤口区域内的MDCK（pan-CK）分布的免疫荧光图像。黄色虚线标记用于量化的缺陷边界。刻度尺 = 100微米。(B) 120小时时MDCK(48小时添加)条件下伤口与非伤口区域的MDCK覆盖面积的量化（每组n = 6个微组织）。(C) 120小时时MDCK(?)和MDCK(48小时添加)微组织中3T3细胞的量化。细胞使用以原始缺陷中心为中心的同心径向区间进行量化（每组n = 6个微组织）。

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因为延迟的上皮细胞覆盖层限制了整体微组织压缩，我们接着询问上皮细胞是否也调节缺陷区域内的局部纤维化重塑。为了捕捉闭合后的重塑事件，我们在伤口后196小时分析了微组织。针对α-SMA的免疫染色显示MDCK(?)对照组中存在强烈的α-SMA表达，表明肌成纤维细胞激活，而立即和延迟的MDCK覆盖层显著降低了闭合区域的α-SMA信号（图6A）。为了量化纤维化标志物的空间分布，我们使用以原始缺陷为中心的同心环状ROI进行了径向强度分析。在从伤口中心到边缘的50微米径向区间内测量平均荧光强度。如图6B所示，MDCK(?)微组织在各个半径方向上都显示出较高的α-SMA强度，且外围区域的信号更强，这与远离缺陷区域的细胞分化时间更长是一致的。相比之下，添加了MDCK细胞的微组织在整个径向剖面上α-SMA水平均较低，无论是0小时还是48小时添加的情况都远低于MDCK(?)对照组。图6显示，延迟添加MDCK细胞可以抑制微缺陷处的肌成纤维细胞激活和纤维连接蛋白的积累。(A) 代表性的免疫荧光图像显示了在伤口后196小时培养的微组织中α-SMA（绿色）、F-actin（红色）和细胞核（DAPI，蓝色）的情况，其中未添加MDCK细胞或在伤口后0小时和48小时添加了MDCK细胞。这些图像是从微组织表面下方10到50微米处获取的共聚焦z堆栈的最大强度投影。星号表示用于径向强度分析的原始微缺陷中心。刻度尺=200微米。(B) 在三种上皮条件下对α-SMA荧光强度进行了径向量化。平均强度是在以原始缺陷为中心的同心50微米径向区间内测量的。线条代表平均值，误差条表示95%的置信区间。阴影区域标记了未受伤区域（每组至少4个微组织）。(C) 在与(A)相同条件和时间点下，显示了纤维连接蛋白（绿色）、F-actin（红色）和细胞核（蓝色）的代表性免疫荧光图像。刻度尺=200微米。(D) 使用与(B)相同的50微米同心区间策略对纤维连接蛋白荧光强度进行了径向量化。线条代表平均值，误差条表示95%的置信区间（每组至少4个微组织）。

接下来，我们通过观察纤维连接蛋白的沉积来评估细胞外基质（ECM）的积累情况（图6C）。与α-SMA数据一致，径向量化显示在MDCK(?)条件下存在明显的梯度，纤维连接蛋白强度向伤口中心逐渐降低，反映了中央闭合区域基质形成的时间较晚（图6D）。无论是立即添加还是延迟添加MDCK细胞，都在所有距离中心的位置显著降低了纤维连接蛋白的强度，表明MDCK细胞减少了纤维连接蛋白的沉积。这些发现共同表明，即使在伤口后48小时才引入MDCK细胞，它们仍然能够显著减少肌成纤维细胞的激活程度和富含纤维连接蛋白的基质沉积范围。

讨论
在这项研究中，我们使用了一个几何形状明确、具有张力的3D 3T3-胶原微组织模型，并在其中设置了一个标准化的中央微缺陷，以研究上皮覆盖如何调节缺陷闭合和纤维化重塑。测量得到的硬度（约210帕）处于早期肉芽组织和柔软真皮ECM环境（数百帕到亚帕范围）的较低范围内，这些环境已知可以抑制肌成纤维细胞的激活和肌成纤维细胞的分化。(23) 在没有上皮的微组织中，缺陷闭合仅在48小时后才开始加速，这与在富含肌成纤维细胞的组织中观察到的“两阶段”收缩行为一致，即早期ECM重塑和张力积累阶段先于快速收缩阶段。(24,25) 此外，我们之前使用类似的肌成纤维细胞-胶原微组织的研究表明，α-SMA表达在培养约48小时后显著升高，这表明这个时间窗口对应于该系统中肌成纤维细胞激活的开始。(14) 在这种机械背景下，我们观察到上皮覆盖对闭合过程有强烈的、依赖于密度的抑制作用，支持了上皮对肌成纤维细胞介导的收缩的“制动”作用。重要的是，当上皮细胞在快速收缩阶段开始后（在我们的系统中约为48小时）引入时，这种抑制作用几乎不存在，表明上皮对闭合的调节强烈依赖于阶段。

上皮覆盖还对肌成纤维细胞的行为和纤维化标志物的表达具有显著的空间控制作用。在没有上皮的微组织中，72小时时快速闭合伴随着伤口边缘pH3阳性的峰值，这与工程组织裂隙中细胞增殖和基质沉积在前沿增强的报告一致。(26) 在有上皮覆盖的情况下，这种边缘定位的增殖爆发明显减弱，而细胞凋亡在整个条件下都保持较低水平。此外，延迟添加的上皮覆盖并没有减少愈合缺陷区域的最终3T3细胞密度，表明上皮的调节并不是通过从伤口部位清除肌成纤维细胞或减少其在闭合区域的最终积累来实现的。在更长的时间尺度上，上皮覆盖显著减少了整个径向剖面上的肌成纤维细胞分化和富含纤维连接蛋白的基质沉积，使得上皮无组织中观察到的中心到边缘的梯度变平缓。这些梯度可能反映了远端肌成纤维细胞更长时间地暴露于张力信号中，并有更多的机会进入收缩和基质沉积的程序。(25) 鉴于持续的肌成纤维细胞存在和过度基质沉积是病理疤痕形成的关键驱动因素，(3,4) 我们的数据支持上皮覆盖作为一个组织尺度的调节器，可以在具有张力的3D伤口环境中广泛抑制类似纤维化的重塑。

这项工作的一个重要概念性进展是确定了在保持闭合的同时限制纤维化的伤口后上皮加载窗口。当在伤口后48小时添加上皮细胞时，即使闭合动力学已经进入快速收缩阶段，闭合动力学仍接近正常。此外，MDCK细胞覆盖在再生表面上的密度与相邻未受伤区域的密度相当。尽管保持了闭合和覆盖，延迟添加的上皮覆盖显著降低了α-SMA表达、纤维连接蛋白沉积和整体微组织的压缩程度。这种阶段依赖性表明，当上皮输入在早期收缩开始后提供时，可以将闭合效率与纤维化负担解耦。此外，我们工作条件下的有效上皮加载密度（约1.5 × 10^4细胞/平方厘米）与基于细胞的覆盖方法中报告的上皮加载密度处于同一数量级，支持了此处探索的剂量范围的生理相关性。(27,28) 因此，加载窗口的概念表明，分阶段的上皮补充可能提供一种合理的途径，在保持大范围上皮缺陷闭合的同时抑制纤维化。

我们之前在相关微组织系统中的研究表明，旁分泌PGE2可能是上皮抑制肌成纤维细胞收缩性和肌成纤维细胞分化的合理机制。(14) 在本研究中，将3T3成纤维细胞或微球覆盖在微组织表面并未抑制缺陷闭合，表明这种效应不仅仅是由于额外的细胞群或纯机械解释（如表面加载或物理阻塞）所致。相反，外源性PGE2部分再现了上皮覆盖的时间依赖性行为。这些结果表明，上皮对肌成纤维细胞驱动的收缩的“制动”作用不太可能仅由物理阻力引起。相反，上皮细胞可能通过可溶性旁分泌信号来调节肌成纤维细胞的收缩性。

需要指出几个局限性。首先，使用3T3成纤维细胞和MDCK上皮细胞虽然提高了可重复性，但并未涵盖人类组织的细胞多样性。将这一平台扩展到原代人类细胞对于测试研究的普遍性非常重要。其次，我们关注的是组织尺度的动态和表型标志物，而没有详细分析特定的上皮-肌成纤维细胞信号通路（例如TGF-β、IL-1）。(10,29) 第三，当前模型没有考虑合并因素，如血管化、慢性炎症、高血糖、缺血或感染，这些因素可能会改变上皮-肌成纤维细胞相互作用并改变最佳干预时机。(20,21) 将这些因素整合到未来的工作中对于将这一框架转化为临床相关场景至关重要。

总之，一个具有张力的3D伤口微组织模型揭示了上皮覆盖在肌成纤维细胞介导的愈合过程中的双重、时间依赖性作用。在伤口后大约48小时（在本系统中）添加的上皮覆盖保持了闭合动力学和愈合区域的肌成纤维细胞积累，同时显著减少了类似疤痕的压缩和纤维化重塑。这些发现为识别能够将有效闭合与过度纤维化重塑解耦的上皮时间窗口提供了一个定量框架。